способ диагностики факта потребления наркотических веществ

Формула изобретения

1. Способ диагностики факта потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотке крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен : макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотке крови, и установления факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе, отличающийся тем, что в качестве конъюгата используют конъюгат, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен : макромолекулярный носитель в мол.% (3-12):1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гаптена используют производные эфедрина: натриевую соль эфедрон-N-3-пропионовой кислоты

или натриевую соль d,l-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты формулы

а в качестве макромолекулярного носителя - овальбумин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гаптена используют производные морфина: 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)пропионат)морфин формулы 6-(C(O)(CH₂)₂C(O)N(H)(CH₂ )₆NH₂)-мopфин (3) или 3-(6-аминогексиламинокарбонил)метиловый эфир морфина формулы 3-(CH₂C(O)N(H)(CH₂ )₆NH₂)-мopфин (4), а в качестве макромолекулярного носителя поли- или олигоакрилаты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу, в котором отсутствует выявление антител класса G, а процент выявления лиц, злоупотребляющих опиатами, недостаточен (Гамалея Н.Б., Елагина Э.Н., Леви М.И., Паршин А.Н. Вопросы наркологии, 1991, №3, с.10-13).

Известен способ выявления антител против эфедрина в сыворотке крови больных эфедроновой наркоманией, принятый нами за прототип, основанный на использовании ИФА, в котором образцы сыворотки больных и доноров инкубируют с конъюгатом гаптен : макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердую фазу. В качестве макромолекулярного носителя используют бычий сывороточный альбумин, в качестве гаптена - модифицированную молекулу эфедрина, имеющую карбоксипропильный заместитель у атома азота в роли спейсера, формулы

а конъюгированный антиген имеет соотношение гаптен : макромолекулярный носитель, равное 12:1. Уровень специфических антител против эфедрина определяют с помощью антивидовых антител к иммуноглобулинам класса М и G человека, меченных ферментом (пероксидазой хрена), измеряя величину оптической плотности ОД₄₉₂ и по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб, содержащих сыворотки крови с наличием и без наркотиков, устанавливают факт потребления последних в случае, если определяемое значение ОД₄₉₂ превышает сумму среднего значения ОД ₄₉₂ сывороток группы доноров и двух стандартных отклонений (Мягкова М.А., Лушникова М.В., Полевая О.Ю., Гамалея Н.Б. “Антитела к эфедрину у больных эфедроновой наркоманей”, Вопросы наркологии, 1991, №2, с.10-13).

Однако указанный выше способ приводит к ложноположительным результатам, что снижает процент выявления лиц, употребляющих наркотические вещества.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является расширение ряда определяемых наркотиков и повышение процента выявления лиц, употребляющих эти наркотические вещества.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является установления факта потребления наркотических веществ в отдаленные сроки спустя 2-4 месяца после последнего приема наркотика, когда в организме могут отсутствовать следы метаболитов употребляемых наркотических веществ.

Поставленная задача решается способом диагностики факта потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотки крови. Способ включает инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен - макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови, и установление факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе. Новизна предлагаемого способа заключается в использовании конъюгата, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен : макромолекулярный носитель (3-12):1 (мол. %).

В качестве гаптена могут быть использованы любые гаптены, являющиеся производными метаболитов определяемого наркотика.

Использование предлагаемого способа с заявляемым конъюгатом позволяет решить указанную выше задачу за счет применения в конъюгате оптимального соотношения гаптен - макромолекулярный носитель, использования синтетических антигенов, снижающих неспецифическое связывание с белками сыворотки крови, расширения изотипического состава выявляемых G и М классов иммуноглобулинов, выявления полного спектра специфических антител к метаболитам производных анализируемых наркотических веществ.

При установления факта потребления эфедроновых наркотических веществ наиболее предпочтительно использовать в качестве гаптена производные эфедрина: натриевую соль эфедрон-N-3-пропионовой кислоты

или натриевую соль d,1-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты формулы

а в качестве макромолекулярного носителя овальбумин, что позволяет повысить процент выявления больных, употребляющих данный наркотик.

Гаптен формулы (1) получен нами по известной методике - конденсацией -бромпропиофенона и этилового эфира 3-(метиламино)пропионовой кислоты и последующим гидролизом продукта реакции. Строение полученного соединения подтверждено данными элементного анализа и спектров протонно-магнитного резонанса (ПМР).

Получение гаптена формулы (2) известно из прототипа. Конъюгаты гаптен - белок получают известным карбодиимидным способом, описанным в прототипе.

При установления факта потребления антиопиатных наркотических веществ предпочтительно использовать в качестве гаптена производные морфина: 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)пропионат)морфин формулы и 3-(6-аминогексиламинокарбонил)метиловый эфир морфина формулы а в качестве макромолекулярного носителя - поли- или олигоакрилаты, что также позволяет повысить процент выявления больных, употребляющих данный наркотик.

Соединения формулы (3) и (4) получают из морфина путем карбоксилирования его по шестому или третьему положению, этерификации карбоксильных производных морфина и взаимодействия полученных эфиров с гексаметилдиамином. Конъюгаты гаптен - макромолекулярный носитель, в качестве которого берут поли- или олигоакрилаты, получают 10-15% замещением полимерной матрицы производным морфина. После очистки выделяют целевые антигены 3-морфин-полимер (3-М-П) или 3-морфин-олигомер (3-М-О) и 6-морфин-полимер (6-М-П) или 6-морфин-олигомер (6-М-О), в которых молекулы производных морфина ковалентно связаны с матрицей.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Получение натриевой соли эфедрон-N-3-пропионовой кислоты.

К раствору 26,63 г этилового эфира 3-(метиламино)пропионовой кислоты в 100 мл абсолютного этанола при 0°С добавлют 17,47 г -бромпропиофенона. Реакционную смесь перемешивают в течение 8 часов при 0°С, затем отгоняют растворитель, добавляют 100 мл 6 N раствора едкого натрия (NaOH) и экстрагируют эфиром получаемое соединение. Экстракт сушат сульфатом магния, растворитель отгоняют и остаток перегоняют в вакууме. Выход составляет 18,3 г (84,9%), т.кип 137,5-139°С (1 мм рт.ст.); n²⁰ _D 1,5110.

Вычислено, %: С 68,44; Н 7,98; N 5,32. C₁₅ H₂₁NO₃.

Найдено, %: С 68,204; Н 7,86; N 5,22.

Спектры ЯМР Н (СDСl₃ b, м.д., 6 МГц): 1,1 т (3Н, СН₃, J 7,5 Гц), 2,2 с (2Н, СН ₃); 2,37 т (2H, CH₂, J 6,5 Гц), 2,8 т (2Н, СН ₂, 65 Гц), 3,93 кв (2Н, ОСH, 7,5 Гц), 4,17 кв (1Н, СН, J 7,5 Гц), 7,13-8,0 н (5Н, С₆Н₅).

Полученный этиловый эфир эфедрон-N-3-пропионовой кислоты весом 0,2 г растворяют в теплом растворе 2 N NaOH. Реакционную смесь перемешивают 2 часа. После охлаждения полученную натриевую соль эфедрон-N-3-пропионовой кислоты отделяют фильтрованием, т.пл 200°С.

Пример 2. Получение конъюгата эфедрон - овальбумин с соотношением гаптен - белок 3:1(А).

Полученное модифицированное производное эфедрона используют в качестве гаптена для синтеза конъюгата А - эфедрон - овальбумин с соотношением гаптен - белок 3:1, для чего добавляют его в количестве 2 мг при охлаждении и перемешивании к 15 мг овальбумина, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, и 3 мг водорастворимого карбодиимида (КДИ). Смесь выдерживают 5 часов при 4°С. Полученный конъюгат выделяют гель-хроматографией на сефадексе G-25. Количество молей эфедрина, связанных с одним молем белка-носителя, определяют с помощью тринитробензолсульфокислоты по разнице свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъюгированном антигене.

По данным УФ-спектров в конъюгате эфедрон - овальбумин содержится 3 моля эфедрона на 1 моль овальбумина.

Пример 3. Получение конъюгата эфедрин - овальбумин с соотношением гаптен - белок 12:1 (Б).

В качестве исходного реагента для синтеза конъюгата Б используют натриевую соль d,l-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты. Далее, как в примере 2, при содержании исходных реагентов: 5 мг натриевой соли d,l-эфедрин-N-3-пропионовой кислоты, 20 мг овальбумина, 8 мг водорастворимого карбодиимида (КДИ).

По данным УФ-спектров в конъюгате эфедрин - овальбумин содержится 12 молей эфедрина на 1 моль овальбумина.

Пример 4. ИФА выявление антител к производным эфедрина в сыворотки крови человека.

Предлагаемый способ осуществляют на 96-луночных полистирольных планшетах. На твердую фазу иммобилизируют конъюгат А, полученный в примере 2, для чего вносят в лунки по 100 мл его раствора в концентрации 5 мкг/мл в 0,2 М карбаматном буфере, рН 9,5, и выдерживают 18 часов при 4°С. Затем планшеты трижды отмывают забуференным физраствором (3ФР), рН 7,2, содержащим 0,05% твин-20, и проводят инкубацию с анализируемыми образцами биологических сред, в качестве которых взята сыворотка крови, в разведении 1:200 в 3ФР, содержащих 0,1% твин-20. Процесс инкубации проводят в течение 45 мин при 37°С и отмывают, как описано выше. Далее в лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгатов антител против иммуноглобулинов класса М и G человека в разведении 1:2000 в 3ФР с 0,1% твин-20, меченных ферментом (пероксидазой хрена). Затем проводят инкубацию в течение 45 мин при 37°С, отмывают, как описано выше, и заполняют субстратной смесью, содержащей 0,4% О-фенилендиамин, и 0,2% раствором перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере. Выдерживают 10-15 мин в темноте и останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение оптической плотности (ОД) проводят на спектрофотометре "Multiskan" при 492 нм. Уровень специфических антител выявляют по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в биологических средах, в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе. Предлагаемый способ выявления антител против производных эфедрина был апробирован в сыворотках крови 38 больных эфедроновой наркоманией. В качестве контроля использовали сыворотки 20 практически здоровых людей (доноров), 10 больных опиатной наркоманией и 10 больных алкоголизмом. Предварительно на основе статистического анализа было установлено, что достоверное увеличение уровня антител в группе эфедроновых наркоманов составляет в ИФА величину, большую чем сумма среднего значения оптической плотности (OD₄₉₂) в контрольной группе и 2 стандартных отклонения.

В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось как для иммуноглобулинов класса М человека (IgM), так и для иммуноглобулинов класса G (IgG) и составило по сравнению с контрольной группой 40% (15 чел) для IgG и 72% (27 человек) для IgM.

Пример 5. ИФА выявление антител к производным эфедрина.

То же, что в примере 4, только в качестве конъюгата был взят конъюгат Б, полученный в примере 2. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось как для иммуноглобулинов класса М человека (IgM), так и для иммуноглобулинов класса G (IgG) и составило по сравнению с контрольной группой 8% (3 человека) для IgG и 54% (20 человек) для IgM.

Пример 6. Получение конъюгата морфина с лизоцимом 6-M-Lys с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 6:1 (С).

То же, что в примере 2, только в качестве исходного соединения берут 15 мг лизоцима, 2 мг и 4 мг водорастворимого карбодиимида. В результате получают конъюгат морфина с лизоцимом с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 6:1.

Пример 7. ИФА выявление антител к производным опиатов с помощью конъюгата 6-M-Lys.

То же, что в примере 4, только в качестве конъюгата был взят конъюгат (С), полученный в примере 6. Было исследовано 30 образцов сывороток крови больных опиатной наркоманией и 22 образца сывороток доноров. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось в 21 образце и составило 70%.

Пример 8. Получение конъюгата 6-М-П с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 10:1 (D).

К раствору 6 мг поли(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1,5 мл диметилформамида (ДМФ) добавляют 3,8 мг 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)пропионат)морфина [6-(C(O)(CH₂)₂C(O)N(H)(CH₂) ₆NH₂)-морфин] и выдерживают реакционную смесь в течение суток при 20°С, а затем добавляют 200 мкл 25% аммиака. Растворитель упаривают в вакууме. Оставшееся масло многократно промывают эфиром, получают конъюгат 6-М-П, имеющий 15% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Контроль за степенью замещения полимерной матрицы производным морфина осуществляют спектрофотометрически по количеству образовавшегося в процессе реакции п-нитробензола.

Пример 9. Получение конъюгата 3-М-П с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 5:1 (E).

То же, что в примере 6, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1 мл ДМФ и 2 мг 3-(СН₂С(O)N(H)(CH ₂)₆NH₂)-морфина. Получаемый конъюгат 3-М-П имеет 10% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 10. Получение конъюгата 6-М-О с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 3:1 (F).

То же, что в примере 6, только в качестве исходного соединения берут 5 мг олиго(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 8000) в 2 мл ДМФ и 3 мг 6-(C(O)(CH₂)₂C(O)N(H)(CH ₂)₆NH₂)-морфина. Получаемый конъюгат 6-М-О имеет 17% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 11. Получение конъюгата 3-М-О с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 5:1 (G).

То же, что в примере 6, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг олиго(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 8000) в 1 мл ДМФ и 2 мг 3- . Получаемый конъюгат 3-М-О имеет 10% замещение полимерной матрицы производным морфина со спейсером по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 12. ИФА выявление антител к производным опиатов с использованием в качестве макромолекулярного носителя полиакрилатов.

То же, что в примере 4, только в качестве конъюгата были взяты конъюгат 6-М-Р (D), полученный в примере 8, и конъюгат 3-М-Р (Е), полученный в примере 9. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антиопиатных антител наблюдалось в 24 образцах (80%) при использовании 6-М-Р и в 28 образцах (свыше 90%) при использовании 3-М-Р.

Пример 13. ИФА выявление антител к производным опиатов с использованием в качестве макромолекулярного носителя олигоакрилатов.

То же, что в примере 4, только в качестве конъюгата были взяты конъюгаты 6-М-0 (F), полученный в примере 10, и конъюгат 3-М-О (G), полученный в примере 11. В обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антиопиатных антител наблюдалось в 24 образцах (80%) при использовании 6-М-О и в 28 образцах (свыше 90%) при использовании 3-М-О.

Пример 14. Получение конъюгата амфетамина с лизоцимом с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 6:1 (Н).

Так же, как в примере 6, к 15 мг амфетамина сульфата и 20 мг лизоцима в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера добавили 0,1 мл триэтиламина. К полученной смеси по каплям в течение 30-40 минут добавляли при перемешивании 1,0 мл глутарового альдегида. В результате получают конъюгат амфетамина с лизоцимом с соотношением гаптен - макромолекулярный носитель 6:1.

Пример 15. ИФА выявление антител к производным амфетамина.

То же, что в примере 4, используя сыворотку крови наркоманов, употребляющих амфетамин (20 человек), и сыворотку крови здоровых доноров (20 человек), а в качестве конъюгата полученный в примере 15 конъюгат (Н). В результате в обследуемой группе больных достоверное увеличение уровня антител наблюдалось для иммуноглобулинов класса М человека (IgM) у 67% наркоманов и для иммуноглобулинов класса G человека (IgG) у 53% наркоманов по сравнению с донорами.

Пример 16. ИФА выявление антител к производным бензодиазепина.

То же, что в примере 4, используя сыворотку крови наркоманов, употребляющих бензодиазепин (20 человек), и сыворотку крови здоровых доноров (20 человек), а в качестве конъюгата полученный из 12 мг бензодиазепина и 25 мг овальбумина при соотношении последних 10:1. Процент выявления IgG и IgM в группе наркоманов составил 52 и 68% соответственно.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет с довольно высокой вероятностью устанавливать факт потребления различных классов наркотиков и психотропных веществ (опиатов, эфедринов, амфетаминов, бензодиазепинов и др.) по наличию антител к производным метаболитов анализируемых веществ, которые сохраняются в организме человека в течение длительного времени (2-4 месяца) после самого факта потребления, что является актуальным в современных условиях для выявления ранней стадии заболевания.