способ трансэтерификации для получения синтетического производного хлорофилла или бактериохлорофилла

Формула изобретения

1. Способ трансэтерификации для получения синтетического производного хлорофилла или бактериохлорофилла общей формулы I

где X=O

М означает центральный атом металла, выбранный из группы, включающей Мg, Pd, Co, Ni, Сu, Zn, Нg, Er, It, Еu, Sn и Мn, или представляет два атома Н;

каждый из R ₃ и R₅ независимо представляет ацетил, винил, этил, 1-гидроксиэтил либо простой или сложный эфир указанного 1-гидроксиэтилрадикала;

R₄ представляет метил или формил;

пунктирная линия в положениях 7-8 представляет необязательную двойную связь; а

R₁ и R₂ являются различными и выбираются из группы, включающей: (i) C₁-C₂₅ гидрокарбилрадикал, который может быть прямолинейным или разветвленным, насыщенным или ненасыщенным, необязательно замещенным одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо прерван одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо карбоциклическими или гетероциклическими остатками;

(ii) остаток аминокислоты, олигопептида или полипептида, содержащего гидроксигруппу, либо их производное, выбранное из группы, включающей сложные эфиры и N-защищенные производные, в которых указанная гидроксилированная аминокислота или ее производное связано с СOO^- остатком производного Chl или BChl через указанную гидроксигруппу;

(iii) остаток пептида, описанный в (ii), связанный с СОО^- остатком через C₁-C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂;

(iv) остаток клеточно- или тканево-специфического лиганда, выбранного из олигопептида и белка, непосредственно связанного с СОО^- остатком или через C₁-С₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂; и

(v) остаток моно-, олиго- или полисахарида или полиоксиэтилена, связанный с СОО^- остатком непосредственно или через C₁ -C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C ₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂ , либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂;

включающий взаимодействие в анаэробных условиях производного (бактерио)хлорофилла, металл(бактерио)хлорофилла или (бактерио)феофитина, имеющего в положении С-13² группу СООСН₃, а в положении С-17² - группу COOR₂, со спиртом R₁OH, при условии, что R₁ не представляет метил, в присутствии тетраэтил-орто-титаната, при этом взаимодействие осуществляют в апротонном растворителе, таком как свободный от пероксида тетрагидрофуран (ТГФ) или диметилформамид (ДМФ), получая в результате желаемый диэфир C-13²-COOR ₁, C-17²-COOR₂, который затем отделяют от реакционной смеси.

2. Способ трансэтерификации для получения синтетического производного хлорофилла или бактериохлорофилла общей формулы I

где X=O

М означает центральный атом металла, выбранный из группы, включающей Мg, Pd, Co, Ni, Сu, Zn, Нg, Er, It, Еu, Sn и Мn, или представляет два атома Н;

каждый из R ₃ и R₅ независимо представляет ацетил, винил, этил, 1-гидроксиэтил либо простой или сложный эфир указанного 1-гидроксиэтилрадикала;

R₄ представляет метил или формил;

пунктирная линия в положениях 7-8 представляет необязательную двойную связь; а

R₁ и R₂ являются идентичными и выбираются из группы, включающей:

(i) C₁-C₂₅ гидрокарбилрадикал, который может быть прямолинейным или разветвленным, насыщенным или ненасыщенным, необязательно замещенным одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо прерван одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо карбоциклическими или гетероциклическими остатками;

(ii) остаток аминокислоты, олигопептида или полипептида, содержащего гидроксигруппу, либо их производное, выбранное из группы, включающей сложные эфиры и N-защищенные производные, в которых указанная гидроксилированная аминокислота или ее производное связано с СОО^- остатком производного Chl или BChl через указанную гидроксигруппу;

(iii) остаток пептида, описанный в (ii), связанный с СОО^- остатком через C₁-C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂;

(iv) остаток клеточно- или тканево-специфического лиганда, выбранного из олигопептида и белка, непосредственно связанного с СOO^- остатком или через C₁-С₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂; и

(v) остаток моно-, олиго- или полисахарида или полиоксиэтилена, связанный с СOO^- остатком непосредственно или через C₁ -C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C ₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂ , либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂;

включающий взаимодействие в анаэробных условиях производного (бактерио)хлорофилла, металл(бактерио)хлорофилла или (бактерио)феофитина, имеющего в положении С-13² группу СООСН₃, а в положении С-17² - группу COOR₂, со спиртом R₁OH, (при условии, что R₁ не представляет метил), в присутствии тетраэтил-орто-титаната, получая в результате желаемый диэфир С-13²-COOR ₁, C-17²-COOR₂, и где в качестве растворителя используют R₁OH.

3. Способ по п.1 или 2, где М представляет двухвалентный металл, выбранный из группы, включающей Мg, Pd, Co, Ni, Сu, Zn, Нg, Er, It, Еu, Sn и Мn.

4. Способ для получения соединения хлорофилла по п.1 или 2, где R₃ представляет винил, R₄ представляет метил или формил, R₅ представляет этил, а пунктирная линия в положениях 7-8 представляет двойную связь.

5. Способ для получения соединения бактериохлорофилла по п.1 или 2, где R₃ представляет ацетил, R₄ представляет метил, R₅ представляет этил, а положения 7-8 гидрированы.

6. Способ по п.5, где М представляет Pd, R₁ представляет трет-бутилбензил, a R₂ представляет метил.

7. Способ по п.5, где М представляет Pd, R₁ представляет трет-бутилбензил, а R₂ представляет геранилгеранил.

8. Способ по п.5, где М представляет Pd, R₁ представляет пропил, a R₂ представляет геранилгеранил.

9. Способ по п.5, где М представляет Pd, R₁ представляет N-трет-бутилоксикарбонилсерил, а R ₂ представляет метил.

10. Способ по п.5, где М представляет Pd, R₁ представляет 0-серил, a R ₂ представляет метил.

11. Способ по п.5, где М представляет Мg, a R₁ и R₂ представляют пропил.

12. Способ по п.5, где М представляет Pd, a R₁ и R ₂ представляют трет-бутилбензил.

13. Способ по п.5, где М представляет Pd, a R₁ и R₂ представляют пропил.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым производным хлорофилла и бактериохлорофилла, к их получению, применению в способах фотодинамического лечения (PDT) in vivo, для диагностики и фотодинамического уничтожения вирусов и микроорганизмов in vitro.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВСhl = бактериохлорофилл а (Мg-содержащий 7,8,17,18-тетрагидропорфирин формулы (а) в приводимой ниже схеме А, в которой М означает Мg, и имеющий фитиловую или геранилгераниловую группу в положении 17³, СOOСН ₃ группу в положении 13², атом Н в положении 13², ацетилгруппу в положении 3 и этилгруппу в положении 8).

Производное ВСhl = производное BChl с модификациями в макроцикле, в центральном атоме металла и/или на периферии.

BChlide = бактериохлорофиллид а (свободная от С-17 ² карбоновая кислота, полученная из BChl).

BPhe = бактериофеофитин а (ВСhl, в котором центральный магний замещен двумя атомами Н).

BPheid = бактериофеофорбид а (свободная от С-17² карбоновая кислота, полученная из BPhe).

Chl (b) = хлорофилл а (b) (Мg-содержащий 17,18-дигидропорфирин формулы (b) в приводимой ниже схеме А, в которой М означает Мg, и имеющий фитилгруппу в положении 17³, СOOСН₃ группу в положении 13², атом Н в положении 13², виниловую группу в положении 3, двойную связь в положениях 7-8, и либо метил в положении 7 и этил в положении 8 (Chl a), либо формилгруппу в положении 7 и этил в положении 8 (Chl b)).

Chlide = хлорофиллид а (свободная от С-17 ² карбоновая кислота, полученная из Chl).

DMF = диметилформамид; ESI = ионизация электроспреем;

et = этил; gg = геранилгеранил; glс = глюкоза;

HPLC = жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД);

FITC = флюоресцеинизотиоцианат.

[М]-BChl = производное BChl, в котором центральный атом Мg замещен металлом М согласно приводимому ниже описанию.

mе = метил; MS = масс-спектроскопия; NMR = ядерный магнитный резонанс; NtBoc-ser=N-трет-бутоксикарбонилсерил; PDT=фотодинамическое лечение.

Phe = феофитин а (Chl, в котором центральный Мg замещен двумя атомами Н).

Pheid = феофорбид а (свободная от С-17² карбоновая кислота, полученная из Phe); рr = пропил; SDP = сайт-направленное фотодинамическое лечение; ser = серил, серин;

tbb = пара-трет-бутилбензил; THF = тетрагидрофуран;

Ti(OEt)₄=тетраэтил-орто-титанат.

На протяжении всего описания используется номенклатура и нумерация (бактерио)хлорофилловых структур в соответствии с IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии) (см. приводимую ниже Схему А). Согласно данной номенклатуре нативные (бактерио)хлорофиллы имеют две группы сложного эфира карбоновой кислоты в положениях С-13² и С-17², этерифицированные в положениях С-13³ и С-17³. В номенклатуре и сокращениях, используемых в примерах, вначале появляется этерифицирующий остаток в С-13³, затем центральный атом металла, если не Мg, а затем тетрапиррол (существительное), за которым следует остаток сложного эфира С-17³. Например, соединение в приводимом ниже примере 1 обозначено как а-17³-метиловый эфир 13³-трет-бутилбензил-Рd-бактериофеофорбида (сокращенно tbb-Pd-BPheid-me).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хлорофиллы и бактериохлорофиллы, убиквотные пигменты фотосинтеза, интенсивно изучались с целью понимания их фотофизики и фотохимии (Scheer, 1991). Вместе с более доступными, но спектроскопически менее информативными порфиринами их также применяли для более общего проникновения в явления переноса энергии и электронов, взаимодействия больших ароматических молекул с центральными металлами, а также центральных металлов с лишними лигандами.

Интерес представляет применение фотосенсибилизаторов для фотодинамического лечения (PDT) опухолей. В соответствии с данным способом применяют сочетание нетоксичного лекарственного препарата, поглощающего свет при подходящей длине волны, с неопасным фотосенсибилизирующим облучением пациента после введения лекарственного препарата.

Было установлено, что порфирины аккумулируются в опухолевой ткани и после ее облучения, поглощают свет in situ, обеспечивая возможность определения опухолей по расположению флюоресценции. Как для обнаружения, так и для фотодинамического лечения опухолей было предложено применение сырого производного гематопорфирина, известного как HPD. Форма HPD, которая считается более эффективной, включает порцию HPD, имеющего агрегатную массу свыше 10 кДа и являющегося предметом патента США №4649151. HPD или его активные компоненты были описаны в патенте США №4753958 для местного лечения кожных заболеваний, а также Matthews et al., 1988, для стерилизации биологических образцов, содержащих инфекционные организмы, такие как бактерии и вирусы. Смесь, известная как производное гематопорфирина (HPD), содержащая большое количество связанных сложным эфиром олигомеров гематопорфирина (HP), доступна коммерчески (Photofrin II, Quadra Logic Technologies Inc., Vancouver, ВС, Canada).

С целью оптимизации свойств порфириновых лекарственных препаратов при лечении и диагностике было предложено несколько производных порфирина, в которых, например, присутствует центральный атом металла в комплексе с четырьмя кольцами пиррола, и/или периферические заместители колец пиррола модифицированы, и/или макроцикл дигидрирован до производных Chl (хлорины) либо тетрагидрированы до производных BChl (бактериохлорины).

Производные хлорофилла и бактериохлорофилла имеют лучшие свойства по сравнению с порфиринами, однако они не так легко доступны и более трудны в обращении. Была исследована возможность применения производных хлорофилла (Spikes and Bommer, 1991) и производных бактериохлорофилла (Beems et al., 1987; Dougherty, 1992; Fiedor et al., 1993; Kessel et al., 1993; Moser, 1998; Pandey et al., 1994; Tregub et al., 1993) для диагностики и лечения рака. Благодаря их интенсивному поглощению в благоприятных спектральных диапазонах (650-850 нм) и их легкому распаду после лечения производные хлорофилла и бактериохлорофилла считаются прекрасными сенсибилизаторами для опухолей PDT.

Были исследованы комплексы тетрапирролов с металлами, отличными от Мg, в сериях порфирина и 17,18-дигидропорфирина для понимания их спектроскопических и восстановительно-окислительных свойств (Hynninen, 1991). Бактериохлорофиллы имеют потенциальное преимущество по сравнению с хлорофиллами, поскольку они демонстрируют интенсивные, почти инфракрасные полосы, т.е. при существенно большей длине волны, чем производные хлорофилла.

Публикация Международной заявки РСТ № WO 90/12573 на имя Dougherty описывает производные бактериохлорофилла-а или -b соответствующих бактериохлоринов, которые не имеют центрального атома металла либо в которых центральный атом металла может представлять непарамагнитный металл, выбранный из Mg²⁺, Sn²⁺ и Zn²⁺, а С-17 ²-карбоксильная группа этерифицирована насыщенным или ненасыщенным гидрокарбильным остатком 8-25С, для получения композиции, применимой в способе разрушения или ухудшения нежелательных целевых биологических субстратов, включающего фотосенсибилизацию указанного субстрата эффективным количеством указанного производного с последующим облучением целевого субстрата излучением в диапазоне длины волны, поглощаемой указанным производным в течение периода времени, достаточного для ухудшения или разрушения субстрата. Кроме того, применение данных соединений считается целесообразным для фотодинамического лечения и диагностики. Следует отметить, что несмотря на заявленные комплексы Sn²⁺ и Zn ²⁺ бактериохлорофилла-а или -b, данные производные металла не были проиллюстрированы примерами, равно как и ни один способ их получения не был раскрыт в описании указанной заявки на патент WO 90/12573.

При нормальных условиях доставки, т.е. в присутствии кислорода, при комнатной температуре и в нормальных световых условиях остатки BChl лабильны и имеют несколько более низкий квантовый выход для получения триплетного состояния по сравнению, например, с производным гематопорфирина (HPD). Однако их возможная инициация биологических окислительно-восстановительных реакций, благоприятные спектральные характеристики и их легкий распад in vivo приводят к потенциальному превосходству бактериохлорофиллов над другими соединениями, например порфиринами и хлорофиллами, при лечении PDT и диагностике, а также для уничтожения клеток, вирусов и бактерий в образцах и живой ткани. Ожидается, что химическая модификация бактериохлорофиллов приведет к дальнейшему улучшению их свойств, однако она весьма ограничена из-за отсутствия подходящих способов получения таких модифицированных бактериохлофиллов (Hynninen, 1991).

Заявка на Европейский патент, опубликованная под №0584552, того же заявителя, что и заявитель настоящей заявки, описывает новые конъюгаты хлорофиллов и бактериохлорофиллов в положении С-17³ с аминокислотами, пептидами и белками, применимые для лечения PDT и для диагностики. Аминокислотный, пептидный или белковый остаток связан непосредственно или через спейсер с С-17²-карбоксильной группой молекулы хлорофилла или бактериохлорофилла. Данные конъюгаты получают способами, достаточно мягкими для того, чтобы удержать кислотолабильный центральный атом Мg.

С-13²-карбометоксигруппу хлорофиллов и бактериохлорофиллов биосинтетически получают из боковой цепи С-13 пропионовой кислоты и части реакционноспособной -кетоэфирной системы, присутствующей в изоциклическом кольце большинства хлорофиллов. Однако в отличие от боковой цепи сложного С-17 пропионового эфира не имеется никаких способов ни для химической, ни для ферментной трансэтерификации в положении С-13³. Единственной ранее известной реакцией для данной группы является расщепление, приводящее к получению 13²-деметоксикарбонил- или пирохлорофиллов. В заявке на патент Германии № DE 4121876 и публикации РСТ № WO 97/19081, принадлежащих данному заявителю, предложены производные бактериохлорофиллов с модифицированными остатками сложных эфиров в положении 13³ и 17³. Однако в указанных заявках описаны только производные бактериохлорофилла с нативными остатками метилового эфира в положении 13³ и не описаны способы получения других сложных эфиров в положении 13³.

Существует необходимость получения новых производных хлорофилла и бактериохлорофилла, применимых для PDT, с целью поддержания или даже улучшения благоприятных оптических и физиологических свойств Chl и BChl, при этом оптимизируя их фотосенсибилизирующий потенциал, а также улучшая их химическую стабильность и оптимизируя их физиологический срок действия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что новые диэфиры С-13³ /С-17³ хлорофиллов и бактериохлорофиллов могут быть получены путем селективной трансэтерификации С-13² -карбометоксигруппы производных хлорофилла и бактериохлорофилла как таковых либо вместе с боковой цепью С-17 пропионовой кислоты в безводных и анаэробных условиях в присутствии избытка спирта и с применением тетраэтил-о-титаната в качестве катализатора. Данная процедура достаточна мягка для того, чтобы обеспечить модификацию, т.е. трансэтерификацию, кислотнолабильных пигментов, таких как нативные, Мg-содержащие хлорофиллы.

В настоящем изобретении раскрыты новые производные хлорофилла и бактериохлорофилла общей формулы I:

в которой

М означает центральный атом металла или представляет два атома Н;

каждый из R₃ и R ₅ независимо представляет ацетил, винил, этил, 1-гидроксиэтил либо простой или сложный эфир указанного 1-гидроксиэтилрадикала;

R₄ представляет метил или формил;

пунктирная линия в положениях 7-8 представляет необязательную двойную связь; а

R₁ и R₂, одинаковые или различные, выбраны из группы, включающей:

(i) C₁-C ₂₅ гидрокарбилрадикал, который может быть прямолинейным или разветвленным, насыщенным или ненасыщенным, необязательно замещенным одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), OН, СНO, СOOН или NH₂, либо прерван одним или несколькими гетероатомами, выбранными из O, S и NH, либо карбоциклическими или гетероциклическими остатками;

(ii) остаток аминокислоты, олигопептида или полипептида, содержащего гидроксигруппу, либо их производное, выбранное из группы, включающей сложные эфиры и N-защищенные производные, где указанная гидроксилированная аминокислота или ее производное связано с СOO^- остатком производного Chl или BChl через указанную гидроксигруппу;

(iii) остаток пептида, описанный в (ii), связанный с СOO ^- остатком через C₁-C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СООН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из O, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂;

(iv) остаток клеточно- или тканево-специфического лиганда, выбранного из олигопептида и белка, непосредственно связанного с СOO ^- остатком или через C₁-C₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), в котором указанный C₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), OН, СНO, СOOН или NH₂, либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из O, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из OН, СOOН или NH₂; и

(v) остаток моно-, олиго- или полисахарида или полиоксиэтилена, непосредственно связанный с СOO^- остатком или через C₁-C ₂₅ гидрокарбил, описанный в (i), где указанный C ₁-C₂₅ насыщенный или ненасыщенный гидрокарбильный остаток, необязательно замещенный одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, оксо (=O), ОН, СНО, СOOН или NH₂ , либо такой остаток, прерванный одним или несколькими гетероатомами, выбранными из О, S и NH, либо фенильным кольцом, далее замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СOOН или NH₂.

Соединения формулы I, в которых R₃ представляет винил, R₄ представляет метил или формил, R₅ представляет этил, а пунктирная линия в положениях 7-8 представляет двойную связь, являются производными хлорофилла а и b соответственно. Соединения формулы I, в которых R₃ представляет ацетил, R₄ представляет метил, R₅ представляет этил, а положения 7-8 гидрированы, являются производными бактериохлорофилла а.

Центральный атом металла М в соединении формулы I может отсутствовать, может быть нативным атомом Мg натуральных пигментов хлорофилла и бактериохлорофилла, либо он может быть двухвалентным металлом, выбранным из группы, включающей Pd, Со, Ni, Cu, Zn, Hg, Er, It, Еu, Sn и Мn.

Настоящее изобретение относится к новому способу трансэтерификации для получения синтетических производных хлорофилла и бактериохлорофилла вышеприведенной общей формулы I, включающему следующие стадии:

(a) взаимодействие в анаэробных условиях соответствующего производного (бактерио)хлорофилла, металл(бактерио)хлорофилла или (бактерио)феофитина, имеющего в положении С-13² группу СOOСН₃, а в положении С-17² - группу COOR₂, со спиртом R₁OH, где R₁ и R₂ имеют вышеуказанные значения, при условии, что R₁ не представляет метил, в присутствии тетраэтил-орто-титаната, при этом взаимодействие осуществляют либо в растворителе, таком как свободный от пероксида тетрагидрофуран (ТГФ) или диметилформамид (ДМФ); в этом случае предпочтительно получают диэфир C-13 ²-COOR₁, С-17²-СОOR₂, либо спирт R₁OH, применяемый в большом избытке, служит в качестве растворителя; в таком случае получают диэфир C-13 ²-COOR₁, C-l7²-COOR₁; и

(b) отделение желаемого продукта от реакционной смеси.

Методы в соответствии с данным изобретением могут быть осуществлены в сочетании с другими известными методами модификации молекулы, например, конъюгирования в положении С-17³ , описанного в ЕР 0584552, модификациями на периферии молекулы и/или переметаллирования, например, описанного в WO 97/19081. Предпочтительно деметаллирование или замену центрального атома металла осуществляют перед трансэтерификацией.

Новые соединения хлорофилла и бактериохлорофилла, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, применимы в качестве фотосенсибилизаторов как терапевтические и диагностические агенты, например, против рака и возрастной дегенерации желтого пятна, для уничтожения клеток, вирусов и бактерий в образцах и живых тканях, также известных в области применения PDT и других фотосенсибилизаторов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1А-1D показывают токсичность в темноте (черные квадраты) и фототоксичность (белые квадраты) относительно клеток меланомы M₂R после инкубирования с применением tbb-Pd-BPheid-tbb (1A), tbb-Pd-BPheid-me (1В), Pd-BPheid-et (1C), контроль (1D). Сенсибилизаторы добавляют в липосомы. Жизнеспособность клеток определяли, вводя в ДНК [ ³Н]-тимидин.

Фиг.2 показывает токсичность в темноте (--+--) и фототоксичность Pd-BPheid-Nglc (черные квадраты) и Pd-BPheid-ser светлые (черные треугольники), темные (белые треугольники) клетки меланомы M₂R у мышей. Жизнеспособность клеток определяли, вводя [³H] -тимидин.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому способу трансэтерификации для получения новых производных С-13² -COOR₁, С-17²-СOOR₂ и C-13 ²-COOR₁, C-17²-COOR₁ соединений хлорофилла и бактериохлорофилла.

В соответствии с одним из вариантов осуществления данного изобретения R₁ и R₂ идентичны; в соответствии с другим вариантом они различны.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения R₁ и R₂ могут представлять гидрокарбильный радикал. В данном описании термин "гидрокарбил" означает любые прямолинейные или разветвленные, насыщенные или ненасыщенные, включая ароматические, гидрокарбильные радикалы, предпочтительно имеющие 1-25 атомов углерода, такие как алкил, предпочтительно имеющий 1-4 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, бутил или алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, такой как фенил, или аралкильная группа, такая как бензил или замещенный бензил, например, трет-бутилбензил. Если R₁ и R ₂ различны, то R₁ предпочтительно представляет метил, радикал, присутствующий в натуральных соединениях Chl и BChl, a R₂ предпочтительно представляет этил или радикал, полученный из натуральных соединений Chl и BChl, например, геранилгеранил(2,6-диметил-2,6-октадиенил) или фитил(2,6,10,14-тетраметилгексадец-14-ен-16-ил). Если R₁ и R₂ различны, то R₁ и R₂ также могут представлять углеводородную цепь, замещенную одним или несколькими радикалами, выбранными из галогена, такого как F, Br, Cl и I, или ОН, оксо (=O), СНO, СOOН или NH ₂, либо такая необязательно замещенная гидрокарбильная цепь, прерванная O, S или NH, предпочтительно O, например, R ₁ или R₂, представляет остаток олигооксиэтиленгликоля, имеющий от 4 до 10 атомов углерода, предпочтительно пентаоксиэтиленгликоль, либо карбоциклическими, например, фенил, или гетероциклическими, например, пиридил, остатками.

В соответствии с другим вариантом R₁ и R₂ могут представлять остаток аминокислоты или пептида (олиго- или полипептид), содержащего гидроксигруппу, такую как серин, треонин и тирозин, или содержащие их пептиды, либо производное указанной аминокислоты или пептида, выбранное из сложных эфиров, например, сложных эфиров алкила, и N-защищенные производные, в которых N-защитная группа представляет, например, трет-бутилокси, карбобензокси или тритил, а указанная гидроксилированная аминокислота или пептид, или их производное связано с группой СОО^- производного Chl или BChl через свою гидроксигруппу. Примерами таких производных аминокислот являются метиловый эфир серина, N-трет-бутилоксикарбонилсерин, метиловый эфир N-тритилсерина, метиловый эфир тирозина и метиловый эфир N-трет-бутокситирозина, а примером такого пептида является метиловый эфир N-карбобензоксисерилсерина, при этом все вышеуказанные соединения получены в соответствии с описанием, приведенным в ЕР 0584552. Согласно предпочтительному варианту производное Chl или BChl этерифицируют L-серином или N-трет-бутилоксикарбонилсерином.

В соответствии с дальнейшим вариантом R₁ и R₂ могут представлять остаток пептида (олиго- или полипептида), связанного с Chl или BChl через радикал C₁-C₂₅ гидрокарбила согласно вышеприведенному описанию; в таком случае радикал гидрокарбила служит в качестве спейсера для указанного пептида или полипептида/белка и имеет концевую функциональную группу, выбранную из ОН, СOOН и NH ₂, через которую пептид или белок связан сложноэфирной или амидной связью.

В соответствии со следующим вариантом R₁ и R₂ могут представлять остаток клеточно- или тканево-специфического лиганда, выбранного из пептидов и белков, примерами которых являются, но не ограничиваются ими, пептиды гормонов, например, меланоцитстимулирующие гормоны (меланотропины), и антитела, например, иммуноглобулины и опухолево-специфические антитела. В таком случае пептид или белок также могут быть соединены с Chl или BChl через радикал C₁-C₂₅ гидрокарбила, как указано выше, при этом радикал гидрокарбила служит в качестве спейсера для указанного пептида или полипептида/белка и имеет концевую функциональную группу, выбранную из ОН, СOOН и NH ₂, через которую пептид или белок связан сложноэфирной или амидной связью.

В соответствии с очередным вариантом R₁ и R₂ могут представлять остаток моно-, олиго- или полисахарида, непосредственно связанного с СOO ^- молекулы Chl или BChl либо через радикал C₁ -C₂₅ гидрокарбила, как указано выше. В соответствии с предпочтительным вариантом моносахаридом является глюкозамин.

Для получения сложных эфиров в соответствии с данным изобретением трансэтерификацию только в положении С-13³ предпочтительно осуществляют взаимодействием С-17³, С-13³ производного диэфира Chl или BChl, имеющего нативную карбометоксигруппу в положении С-13³, с желаемым спиртом R₁ OH, в котором R₁ не представляет метил, в присутствии тетраэтил-орто-титаната, при этом реакцию осуществляют в апротонном растворителе, таком как свободный от пероксида тетрагидрофуран (ТГФ) или диметилформамид (ДМФ). Некоторые сложные эфиры получают данным способом в соответствии с приведенным ниже описанием с этанолом, трет-бутилбензиловым спиртом, пропанолом, трет-бутилоксикарбонилсерином и серином.

В соответствии с другим вариантом трансэтерификацию как в положении С-13³, так и в положении С-17 ³ осуществляют одновременно спиртом R₁OH. После синтеза следует вышеописанная процедура, однако в качестве растворителя применяют спирт (Неприменимо для NtBoc-ser, представляющего собой твердое вещество). Данным способом в соответствии с нижеприведенным описанием получают некоторые сложные эфиры, включая сложные эфиры tbb, Pr, NtBoc-Ser и ser. Время реакции для пара-трет-бутилбензилового спирта и для н-пропанола составляет 48 и 12 часов соответственно.

Вид спирта и температура определяют, произойдет ли этерификация сильнее в положении С-13³ или как в положении С-17 ³, так и С-13³. Большие спирты R₁ OH предпочтительно этерифицируют положение С-13³, в то время как небольшие спирты этерифицируют как положение С-17 ³, так и положение С-13³.

Предпочтительным растворителем в соответствии с данным изобретением является ТГФ. ДМФ применяют в том случае, если спирт нерастворим в ТГФ. Температура реакционной смеси может составлять 75°С в течение нескольких дней, например, при использовании 1-пропанола, пара-трет-бутилбензилового спирта и N-tBoc-серина.

Отделение продуктов от реакционной смеси осуществляют обычными способами, например, путем добавления диэтилового эфира и воды до разделения фаз, трехкратной экстракции водной фазы простым эфиром, сушки объединенных органических фаз с применением NaCl, выпаривания растворителя в вакууме, удаления избытка спирта в глубоком вакууме (<10^-3 Ра) и выделения желаемого трансэтерифицированного производного Chl или BChl в результате применения ЖХВД или колоночной хроматографии.

Трансэтерифицированные сложные эфиры Chl и BChl в соответствии с данным изобретением могут быть затем обработаны пиридином при повышенной температуре с целью отщепления С-13²-карбометоксиостатка и получения пиропроизводных формул IV и V, приведенных ниже на Схеме В. Пигменты формулы IV могут быть затем трансэтерифицированы, тиолированы или амидированы в положении 17³.

Производные Chl и BChl, полученные обоими способами, сами могут быть использованы как сенсибилизаторы в соответствии с данным изобретением, либо они могут служить в качестве мостика/спейсера для связывания других подходящих молекул с макроциклом Chl/BChl.

При получении сложного эфира, когда желаемый пептид или белок, присоединяемый к одному из положений, лишен гидроксилсодержащего аминокислотного остатка, то макроцикл Chl или BChl может быть вначале соединен с серином или любым другим гидроксилсодержащим остатком либо его производным путем трансэтерификации нативных соединений или этерификации соответствующих свободных кислот (Chlide или BChlide), а затем пептид или белок связывают с макроциклом через такой аминокислотный остаток.

Для получения замещенных металлом производных Chl и BChl нативный центральный атом Мg замещают желаемым металлом М перед конъюгированием пигмента с аминокислотным или клеточно-специфическим лигандом. Замещение центрального атома Мg в хлорофилле и его производных на Pd, Еr, Сu, Ni, Zn, V, Co, Sn, Hg и другие двухвалентные металлы осуществляют обычными способами, например, обработкой соответствующего феофитина солью желаемого металла, например, ацетатом Zn или Сu, в абсолютном этаноле при комнатной температуре (Hambright, 1975; Hynninen, 1991). В случае бактериохлорофилла и его производных центральный атом Мg может быть замещен Zn, Сu или Pd в результате похожей процедуры, включающей обработку ацетатом Zn, Сu или Pd в аргоне при повышенных температурах, как описано в WO 97/19081.

Если R₁ представляет замещенный гидрокарбил, то он может содержать концевую функциональную группу, через которую он может быть прикреплен к другим желательным остаткам, например, сложноэфирную группу получают взаимодействием либо концевой карбоксильной группы R₁ с карбоксильной группой другого соединения, такого как аминокислота или сахарид, либо концевой гидроксильной группы R₁ с карбоксильной группой другого указанного соединения; амидную группу получают взаимодействием концевой карбоксильной группы R₁ с аминогруппой другого соединения, такого как аминокислота, либо концевой аминогруппы R₁ с карбоксильной группой другого соединения, такого как аминокислота.

Новые сложные эфиры, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, имеют такие же характеристики оптического поглощения и фотофизические характеристики, как и соответствующие Chl и BChl. Поэтому ожидается, что после внедрения в обработанную ткань новые сложные эфиры Chl и BChl станут эффективными фотодинамическими агентами. Таким образом, они могут быть использованы в качестве фотосенсибилизаторов как терапевтические и диагностические агенты, для уничтожения клеток, вирусов и бактерий в образцах и живых тканях, хорошо известных в области HPD и других фотосенсибилизаторов. Данные соединения применимы, например, для сенсибилизации неопластических клеток или других аномальных тканей к разрушению облучением in vivo или ex vivo с применением света с соответствующей длиной волны. Полагают, что энергия фотоактивации передается эндогенному кислороду, превращая его в синглетный кислород, который, как считается, отвечает за цитотоксическое действие. Кроме того, фотоактивированные формы (бактерио)хлорофиллов флюоресцируют, что может помочь при локализации опухолей или других мест, в которые вводят (бактерио)хлорофиллы.

Примеры известных в данной области показаний, при которых могут быть назначены новые производные (бактерио)хлорофиллов, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, включают разрушение опухолевой ткани в твердых опухолях, растворение бляшек в кровеносных сосудах (см. например, патент США №4512762); лечение местных состояний, таких как акне, стопа атлета, бородавки, папилломы и псориаз, а также обработку биологических продуктов (таких как кровь для переливания) с целью уничтожения инфекционных агентов.

Производные (бактерио)хлорофилла, полученные способом трансэтерификации настоящего изобретения, приготавливают в виде готовых фармацевтических композиций, вводимых пациенту или применяемых для объекта in vitro, используя способы, хорошо известные в данной области, например, описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Penna., последнее издание. Композиции могут быть введены системно, в частности, путем инъекций, либо могут иметь местное применение.

Для диагностики производные (бактерио)хлорофилла могут быть использованы как таковые либо могут быть помечены радиоизотопом или другим средством для обнаружения, известным в данной области.

Согласно практике, количество вводимого производного (бактерио)хлорофилла соответствует другим порфиринам, применяемым для PDT, и варьируется в зависимости от выбора производного, используемого в качестве активного ингредиента, подвергаемого лечению состояния, способа введения, возраста и состояния пациента, а также заключения врача.

Длину волны облучающего света предпочтительно выбирают таким образом, чтобы она соответствовала максимальному поглощению фотосенсибилизатора (бактерио)хлорофилла. Подходящая длина волны для любого соединения может быть легко установлена по его спектру поглощения.

Помимо применения in vivo, производные (бактерио) хлорофилла, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, могут быть использованы для обработки материалов in vitro для уничтожения опасных вирусов или инфекционных агентов, таких как опасные бактерии. Например, кровь и плазма крови, предназначенные для переливания, могут быть обработаны соединением в соответствии с данным изобретением и подвергнуты облучению с целью стерилизации.

Конъюгирование белков, например, гормонов, факторов роста или их производных и антител, а также питательных веществ для клеток, например, тирозина, с остатками Chl и BChl, как подразумевается, способствует их лучшему удержанию в опухолях и на обрабатываемых участках. Усиление сдвига в красную область обеспечивает более глубокое проникновение, сохраняя убиквотность натуральной системы. Замена Мg другими металлами, как подразумевается, способствует оптимизации собственной и метаболической стабильности остатка Chl или BChl и его внутрисистемному пересечению с возбужденным триплетным состоянием, а также открывает возможность для новых диагностических процедур.

Опухолево-специфические антитела предпочтительно нацеливают остатки Chl и BChl в опухоли или на обрабатываемый участок, в то время как гормоны и питательные вещества для клеток также могут быть захвачены нормальными, нетрансформированными двойниками. Однако клетки, выбранные в качестве мишеней для гормонов и питательных веществ для клеток, таких как меланоциты, рассеяны среди других клеток в нормальных условиях и при трансформации в злокачественные клетки собираются вместе, образуя твердые опухоли. В результате ожидается, что концентрация фотосенсибилизатора в злокачественной ткани резко возрастет относительно его концентрации в нормальной ткани, где клетки более диспергированы, обеспечивая усиление действия PDT на опухолевом участке. Это позволяет эффективно применять невысокие дозы, ниже порога разрушения нормальной ткани, таким образом снижая необходимость применения четко направленного в пространстве облучения. Кроме того, обладая очень сильной флюоресценцией, сайт-направленный Chl или BChl может быть использован для флюоресцентного мечения опухолевого участка (участков) или других мишеней.

Новые фотосенсибилизаторы Chl и BChl, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, подходят для лечения опухолей-меланом по нескольким причинам: (а) на ранних стадиях (неметастатических) злокачественная меланома и другие опухоли кожи легко доступны для PDT; (b) фотодинамическое лечение с применением зеленого света, а также обычная химиотерапия и радиотерапия до сих пор не достигли успеха в лечении меланом; (с) однако существует несколько специфических для меланомы лигандов, которые могут нацелить фотосенсибилизирующий остаток на опухолевой участок, и (d) ожидается, что применение возбуждаемых длинными волнами остатков Chl и BChl устранит недостатки обычно применяемых фотосенсибилизаторов, которые экранируются из-за поглощения меланина.

Опухоли-меланомы возникают в результате канцерогенной трансформации (включая УФ-индуцированный мутагенез) меланоцитов. Нормальные меланоциты включают небольшое количество нормальной популяции клеток кожи человека и обычно располагаются в базальном клеточном слое между эпидермисом и дермисом, где каждая из них окружена 30-40 кератиноцитами и одной клеткой Лангерханса. Лечение опухолей-меланом особенно затруднительно при использовании PDT, поскольку клетки опухоли-меланомы могут содержать черные нерастворимые эумеланины (поли-5,6-индолхиноны), имеющие широкую полосу поглощения вокруг 540 нм и поэтому соревнующиеся с любым фотосенсибилизатором за излучение на длине волн менее 650 нм. Кроме того, молекулы меланина могут гасить образовавшиеся радикалы кислорода, тем самым предотвращая интоксикацию органелл жизнеспособных клеток. Следовательно, PDT меланотических меланом обычно применяемыми HPD не очень обнадеживает. Однако имея максимальное оптическое поглощение при длине волны свыше 650 нм, возбужденные Chl и BChl и их синтетические производные не должны заслоняться меланином. Более того, опухолевые клетки меланомы (т.е. трансформированные меланоциты) потребляют значительное количество тирозина во время синтеза меланина, проявляют высокую аффинность по отношению к меланотропинам (-, - и -меланоцитстимулирующие гормоны (MSH) гипофиза) и к нескольким известным антителам. Поэтому они могут служить хорошей мишенью для тирозин-, меланокортин- или антител-конъюгатов Chl и BChl, при условии, что конъюгирование не сильно влияет на распознавание лигандов клеточными рецепторами. Поскольку концентрация меланоцитов увеличивается почти в 40 раз на участках меланомы (относительно нормальной ткани кожи), то ожидается резкое усиление фотодинамического действия.

Новые производные Chl и BChl, полученные способом трансэтерификации настоящего изобретения, могут быть использованы в качестве активных агентов в фармацевтических композициях для фотодинамического лечения некоторых видов рака, включая рак мозга, яичников, молочной железы, опухоли, рак кожи, легких, пищевода и мочевого пузыря, а также другие гормоночувствительные опухоли.

Например, соединения могут быть использованы в фотодинамических лечениях злокачественных меланом. Фотодинамическое действие соединений наблюдают на клетках меланомы в опухолевых и клеточных культурах. Примеры производных, которые могут быть использованы для данной цели, включают конъюгаты производных Chl и BChl с -меланотропином, связанным с остатком пигмента либо через свои остатки серина, тирозина или лизина, либо через концевую аминогруппу.

Фармацевтические композиции могут быть введены пациенту обычными способами, применяемыми при PDT. Количество вводимого соединения и способ введения определяют в соответствии с родом опухоли, стадией заболевания, возрастом и состоянием здоровья пациента, однако указанное количество намного ниже применяемой в настоящее время дозировки фотофрина II, составляющего около 20-40 мг HPD/кг массы тела. Предпочтительным способом введения является внутривенный способ или прямая инъекция в твердую опухоль водного раствора активного соединения, включающего обычные фармацевтически приемлемые носители и добавки, а также местное лечение опухолей кожи подходящими композициями для местного применения.

Таким образом, производные Chl и BChl, полученные способом данного изобретения, могут быть использованы для нескольких назначений, таких как фотодеструкция доброкачественных или злокачественных клеток или ткани сайт-направленным фотодинамическим лечением (SDP). Конъюгат доставляет молекулу Chl или BChl к клеткам, группирующимся в опухолевых тканях после трансформации, но хорошо отделенным друг от друга в нормальных тканях (например, меланоциты в меланоме). В результате фотодинамическое действие фотосенсибилизатора в опухоли может быть на несколько порядков выше, чем его действие в нормальной ткани. Следовательно, ожидается, что порог разрушительного для опухоли освещения будет снижен до уровня, не разрушительного для нормальной ткани. В таких условиях фототоксическое действие будет ограничено опухолевым участком даже при неспецифическом облучении. Такое применение особенно важно при наличии опухолей, недоступных для обычной хирургии.

Другим способом расширения диапазона сенсибилизации до уровня, близкого ИК, является фотодинамическое лечение с применением бифотонных способов (Leupold and Freyer, 1992). Высокий внутрисистемный уровень пересечения производных Chl и BChl и их длинные волны для максимального поглощения делают их очень хорошими кандидатами для данного вида PDT.

Конъюгаты, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, также применимы для фотодеструкции нормальных или злокачественных клеток животных, а также микроорганизмов в культуре с применением или без применения SDP, обеспечивая селективную фотодеструкцию некоторых видов клеток в культуре или инфекционных агентов; для нацеливания остатка порфирина на выбранные клетки путем прикрепления, например, конъюгата Chl- или BChl-серина к специфическим полипептидам, таким как гормоны или иные лиганды рецепторов, к клеточно- или тканево-специфическим антителам, или к другим лигандам, например, лектинам; для флюоресцентного мечения молекул для аналитических целей в лаборатории, диагностического и промышленного применения; а также для флюоресцентного мечения животных клеток или микроорганизмов, или частиц для лабораторных, диагностических или промышленных целей. Благодаря своему высокому коэффициенту затухания и высокой флюоресценции, они могут заменять некоторые из применяемых в настоящее время флюоресцентных меток, таких как флюоресцеинизотиоцианат (FITC) или фикоэритрин.

Для диагностических целей производные Chl и BChl, полученные способом данного изобретения, могут быть помечены радиоактивными изотопами с применением обычных способов, например, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ²⁰¹Tl, ⁹⁹mТс, после чего радиоактивный диагностический агент вводят пациенту, предпочтительно путем внутривенной инъекции. Через несколько часов расположение рака может быть визуализировано при помощи обычных способов.

Ожидаемые положительные результаты PDT с применением сайт-направленных сенсибилизаторов, таких как те, что получены способом трансэтерификации данного изобретения, включают резкое снижение побочного действия и применяемых доз сенсибилизаторов. Некоторые конкретные преимущества применения производных Chl и BChl, полученных способом данного изобретения, для PDT заключаются в следующем:

1. Ранее недоступная функциональная группа Chl и BChl, т.е. С-13³ сложноэфирная группа, становится доступной как таковая или в сочетании с С-17³ сложноэфирной группой для трансэтерификации. Полученные пигменты сохраняют свои положительные абсорбционные и другие оптические свойства, а также свойства возбужденного состояния, обеспечивая лучшее регулирование гидрофильного, гидрофобного баланса и/или нацеливания.

2. Данные соединения проявляют максимальную оптическую абсорбцию при длине волн, при которых оптическая абсорбция/аттенуация тканями человека/животных существенно снижается (660-830 нм в мономерной форме и до 1000 нм в димерах или высших агрегатах). Вместе со снижением уровня рассеивания света это обеспечивает более глубокое проникновение или применение менее сильных и дорогих источников света.

3. Их коэффициент затухания в видимом и близком к ИК спектру приблизительно в десять раз выше, чем коэффициент затухания порфиринов, применяемых в настоящее время для PDT.

4. Данная процедура достаточно мягка для того, чтобы сохранить нативный атом Мg. Однако замещение центрального атома Мg другими металлами возможно и способно увеличить выход синглетного кислорода благодаря более высокому уровню образования триплетного состояния фотосенсибилизатора, а также способно существенно стабилизировать соединения.

5. Сенсибилизаторы Chl и BChl, полученные способом трансэтерификации данного изобретения, должны обладать повышенной специфичностью для распознавания клеток-мишеней и, следовательно, некроз клеток может быть достигнут при более низких дозах. Кроме того, они проявляют хорошие фотохимические свойства по сравнению со многими флюорофорами, применяемыми в настоящее время, и, следовательно, могут быть использованы для других назначений.

6. Имеется несколько работ, описывающих высокий уровень выведения некоторых производных Chl из организма (Spikes and Bommer, 1991).

7. Обычно облучение при PDT осуществляют лазерными источниками, такими как лазер, на красителе с Аr-накачкой затухающим полем, настроенный на эмиссию при 630 нм, или лазер на парах золота (пульсирующий), эмитирующий при 628 нм. Высокая стоимость такого оборудования ограничивает применение PDT в больших медицинских центрах. Применение красных или близких к ИК поглощающих фотосенсибилизаторов, полученных в соответствии со способом данного изобретения, создает возможность использования более удобных и дешевых средств, таких как ксеноновые импульсные лампы, галогеновые лампы, диодные лазеры или прямое солнечное облучение.

8. Производные Chl и ВСhl, меченные радиоактивными или активными изотопами, могут применяться одновременно как для диагностических, так и для терапевтических целей.

Ниже данное изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Общие методики

(а) Сложные диэфиры, предпочтительно модифицированные в С-13² группе карбоновой кислоты (бактерио)хлорофилла, могут быть получены следующим способом:

Производное (бактерио)хлорофилла (3 мг, 4 мкмоль) растворяют в 15 мл сухого и свободного от пероксида тетрагидрофурана (ТГФ) (или в диметилформамиде (ДМФ) при использовании нерастворимых в ТГФ спиртов). К реакционному раствору добавляют 500-кратное количество спирта и 1 мкл (4 мкМ) тетраэтил-орто-титаната. Смесь выдерживают при 75°С в течение 2, 8 или 14 дней при использовании 1-пропанола, пара-трет-бутилбензилового спирта или N-tBoc-серина соответственно. Реакционные смеси обычно окончательно обрабатывают следующим образом: (i) добавлением диэтилового эфира и воды до разделения фаз; (ii) трехкратной экстракцией водной фазы простым эфиром; (iii) сушкой объединенных органических фаз с применением NaCl; (iv) выпариванием растворителя в вакууме; и (v) удалением избытка спирта в глубоком вакууме (<10 ^-3 Pa).

(b) Трансэтерификация как С-13³ , так и С-17³ может быть осуществлена одновременно в соответствии с вышеописанным способом с тем отличием, что в качестве растворителя применяют спирт. Время взаимодействия пара-трет-бутилбензилового спирта и н-пропанола составляет 48 и 12 часов соответственно.

Вышеописанными способами (а) и (b) получали несколько сложных эфиров, применяя, например, метанол, этанол, пропанол, трет-бутилбензиловый спирт, трет-бутоксикарбонилсерин и серин. Примеры таких сложных эфиров формул I, II и III в соответствии со схемой В приведены ниже в таблице 1. Указанные производные могут быть использованы сами по себе при применении данного изобретения, либо они могут служить мостиком/спейсером для соединения других подходящих молекул с макроциклами Chl и BChl.

(с) Обработка трансэтерифицированных сложных эфиров формул I, II и III, полученных в соответствии с вышеприведенным описанием, пиридином при высоких температурах приводит к получению пиропроизводных формул IV и V на схеме В, примеры которых приведены ниже в таблице 2.

Пример 1. Получение 13³-трет-бутилбензил-Рd-бактериофеофорбид-а-17 ³-метилового эфира (tbb-Pd-BPheid-me) (R₁ -tbb; R₂-СН₃; М-Pd)

В соответствии с вышеприведенной общей процедурой (а) 3 мг Pd-BPhe-me подвергают взаимодействию с 250 мкл пара-трет-бутилбензилового спирта (tbb). Через 10 дней основной продукт tbb-Pd-BPheid-me выделяют с выходом, составляющим 65%, после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом 5:95 (об./об.).

Диэфир а-17³-трет-бутилбензилового эфира 13³-трет-бутилбензил-Pd-бактериофеофорбида (tbb-Pd-BPheid-tbb) выделяют в виде побочного продукта.

Аналитические данные для tbb-Pd-BPheid-me: t_r=16,3 мин в системе ЖХВД НII: r_f=0,27 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

UV/Vis: _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,67) B _y, 385 (0,53) В_х, 530 (0,19) Q_x , 755 (1) Q_y.

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,57 (s, 5-Н), 8,67 (s, 10-H), 8,63 (s, 20-H), 7,48 и 7,28 (2 d, ³J _A'B'=³J_АВ=4 Гц, o- и m-H tbbat С-13³), 6,52 (s, 13²-H), 5,53 (s, 13³-СН²), 4,37, 4,14, 4,11, 3,97 (4m, 7-Н, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,50 (17³-СOOСН₃), 3,06 (3¹-СOСН₃), 3,41 (s, 12-СН₃), 3,39 (s, 2-СН₃), 2,60-2,01 (m, 17^1,2-CH ₂), 1,63 (m, 7-СН₃), 0,98 (t, ³ J_AB=7 Гц, 8¹-CH₃), 1,18 (s, tbb-СН₃ при 13³).

MS (FAB): M ⁺=860,0 (вычислено 860,4 для ¹²C¹ ₄₆H¹⁴₅₀N¹⁶₄ O¹⁰⁶₆Pd), 669,3 (35%, М⁺ - COO-tbb); 713,3 (18%, M⁺ - tbb); 877 (30%, добавление O и Н); 819 (17%, добавление O и Н плюс потеря НС(СН₃) ₃).

Пример 2. Получение 13³-тpeт-бyтилбeнзил-Pd-бaктepиoфeoфитин-a-17 ³-геранилгеранилового эфира (tbb-Pd-BPhe-gg)

3 мг Pd-BPhe-gg трансэтерифицируют 250 мкл пара-трет-бутилбенэилового спирта (tbb). Через 14 дней при 75°С tbb-Pd-BPhe-gg выделяют с выходом, составляющим 63%, после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

Аналитические данные для tbb-Pd-BPhe-gg: t_r=16,3 мин в ЖХВД (двуокись кремния, градиент 3-10% А в В, при этом А = толуол. В: толуол/метанол/н-пропанол = 100:4:0,5 (об./об./об.), скорость потока = 1 мл/мин); r _f=0,63 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

UV/Vis: _max [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,51 B _y), 384 (0,42, B_x), 528 (0,45, Q_x ), 756 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,58 (s, 5-Н), 8,67 (s, 10-Н), 7,49 и 7,24 (2m, о- и m-H 13³-tbb), 6,53 (s, 13²-Н), 5,54 (s, 13³-СН₂ ), 4,37, 4,14, 4,11, 3,97 (4m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,08 (s, 3-СОСН₃), 3,41 (s, 12-СН₃), 3,39 (s, 2-СН ₃), 3,50 (s, 17³-СOOСН₃), 4,61 (m, gg-OCH₂), 5,15 (m, gg-OCH₂- ), 1,63 (s, gg-СН₃), 2,59-1,98 (4m, 17-CH₂ ), 1,18 (s, 13³-tgg-С(СH₃)₃), 1,69 (d, ³J_AB=7 Гц, 18-СН₃), 0,98 (t, ³J_АВ=7 Гц, 8¹-CH ₃-).

MS (FAB) M⁺=1118,6 (вычислено 1118,6 для ¹²C¹₆₅H¹⁴ ₈₀N¹⁶₄O¹⁰⁶₆ Pd), 927 (<5%) (M⁺ - COO-tbb).

Пример 3. Получение 13³-пpoпил-Pd-бaктepиoфeoфитин-a-17 ³-геранилгеранилового эфира (pr-Pd-BPhe-gg)

6 мг Pd-BPhe-gg трансэтерифицируют 1 мл 1-пропанола (рrOН) в 20 мл ТГФ. Через 14 дней при 75°С pr-Pd-BPhe-gg выделяют с выходом, составляющим 60%, после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

Аналитические данные для tbb-Pd-BPhe-gg: r_f=0,44 в системе двуокись кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

UV/Vis: _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,50, B _y), 384 (0,44, В_х), 528 (0,47, Q_x ), 756 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,59 (s, 5-Н), 8,66 (s, 10-H), 6,53 (s, 13²-H), 4,38, 3,90, 3,89, 3,97 (4m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,08 (3¹-СOСН₃ ), 3,42 (s, 12-СН₃), 3,39, (s, 2-СН₃), 4,71 (m, gg-OСН₂ при 17³), 5,46 (m, gg-OCH ₂- при 17³), 1,62 (s, gg-СН₃ при 17³ ), 2,59-1,98 (4 m, 17^1,2-CH₂), 1,74-1,56 (m, пропил- при 13³), 0,98 или 0,62 (m, пропил-СН₃ при 13³).

MS (FAB) M⁺=1014,4 (вычислено 1014,4 для C₅₇H₇₂N₄O¹⁰⁶ ₆Pd), 927 (<3%) (M⁺ - COO-pr).

Пример 4. Получение 13³-трет-бутилоксикарбонилсерил-Рd-ВРheid-а-17 ³-метилового эфира (N-tBoc-ser-Pd-BPheid-me)

50 мг трет-бутилоксикарбонилсерина (N-tBoc-ser) добавляют к пигментному раствору Pd-BPheid-me в ДМФ. Через 14 дней при 75°С N-tBoc-ser-Pd-BPheid-me выделяют с выходом, составляющим 7%, распределением между водой и этилацетатом и хроматографией на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

Аналитические данные для N-tBoc-ser-Pd-BPheid-me: r_f=0,03 в системе двуокись кремния с ацетоном/толуолом = 10:90 (об./об.).

UV/Vis: (СНСl₃) _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,45, B _y), 387 (0,34, В_x), 537 (0,16), 764 (1, Q_y).

MS (ESI) M⁺=901,2 (вычислено = 901,4 для ¹²C¹₄₃H¹⁴ ₄₉N¹⁶₅O¹⁰⁶₁₀ Pd), 845,4 (40%, добавление Н и потеря С(СН₃ )₃); 801/5 (10%, добавление Н плюс потеря NtBoc); 669 (11%, потеря NtBoc-ser).

Пример 5. Получение 13 ³-O-серил-Рd-бактериофеофорбид-а-17³-метилового эфира (O-ser-Pd-BPheid-me)

Защитную группу соединения из примера 4 отщепляют, добавляя 2 мл трифторуксусной кислоты до получения сухого N-tBoc-ser-Pd-BPheid-me. Трифторуксусную кислоту удаляют в течение 15 минут потоком аргона, а остаток аккуратно трижды экстрагируют этилацетатом и водой, получая ser-Pd-BPheid-me (<5%) из Pd-BPheid-me. Пигмент очищают на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 40:60 (об./об.) (дальнейшую очистку для взаимодействия с целью получения ser-Pd-Bpheid-me можно не проводить).

Аналитические данные для ser-Pd-BPheid-me: r_f =0,65 на C₁₈ двуокиси кремния с обращенной фазой с метанолом/толуолом =5:95 (об./об.).

UV/Vis: (СНСl₃ ) _mах [нм] (A_rel, задание) = 334 (0,36, B _y), 387 (0,29, B_x), 534 (0,09, Q_x ), 765 (1, Q_y).

MS (ESI) M⁺=801,2 (вычислено 801,3 для ¹²C¹₃₈H ¹⁴₄₁N¹⁶₅O¹⁰⁶ ₈Pd); 698,3 (10%, добавление Н и потеря серина).

Пример 6. Получение 13³-мeтил-Pd-бaктepиoфeoфopбид-a-17 ³-н-пропилового эфира (me-Pd-BPheid-pr)

Применяя 7% н-пропанол в ТГФ, во время синтеза pr-Pd-BPheid-pr выделяют побочный продукт pr-Pd-BPheid-me с выходом, составляющим 5%, после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

Аналитические данные для me-Pd-BPheid-pr: r_f=0,42 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 10:90 (об./об.).

UV/Vis: (DE) _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,50, B _y), 385 (0,38, B_x), 528 (0,15, Q_x ), 755 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] = 9,57 (s, 5-H), 8,95 (s, 10-H), 6,50 (s, 13 ²-H), 4,32, 4,24, 3,88 (3 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,87 (m, пропил-OСH₂ при 13³), 3,07 (s, 3 ¹-СOСН₃), 3,43 (s, 12-СН₃), 3,38, (s, 2-СН₃), 2,62-2,09 (m, 17^1,2-CH ₂), 1,72-1,56 (m, пропил-ОСН₂СН₂ при 17³-CH₂), 1,68 (m, 7-СН₃ ), 0,98 или 0,63 (m, пропил-СН₃ при 17³ ).

MS (ESI): M⁺=756,6 (вычислено 756,3 для ¹²C¹₃₈H¹⁴₄₂ N¹⁶₄O¹⁰⁶₆Pd); 697,5 (27%, M⁺-СOOСН₃).

Пример 7. Получение 13³-н-пропил-бактериохлорофиллид-17³-н-пропилового эфира (pr-BChlide-pr) (центральный металл Мg вместо Pd)

В соответствии с вышеприведенной общей методикой (b) и применяя в качестве исходного материала ВСhl со 100-кратным избытком н-пропанола, через 3 дня получают продукт pr-BChlide-pr с выходом, составляющим 40%, после хроматографии на C₁₈ двуокиси кремния с обращенной фазой с градиентом, составляющим 25-10% (фаза A: HEPES/KOH (20 мМ; рН 7,5), фаза В: ацетон).

Аналитические данные для pr-BChlide-pr: r_f=0,73 на C₁₈ двуокиси кремния с обращенной фазой с HEPES/KOH (20 mM, рН 7,5)/ацетон =15:85 (об./об.).

UV/Vis: (DE) _mах [нм] (A_rel, задание) = 357 (0,78, B _y), 392 (0,52, B_x), 574 (0,23, Q_x ), 771 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,51 (s, 5-Н), 8,65 (s, 10-Н), 8,54 (s, 20-H), 6,57 (s, 13²-H), 4,35 (m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,99 (пропил-OСН₂ при С-17 ³ и С-13³), 3,11 (3¹-СOСН ₃), 3,57 (s, 12-СН₃), 3,46 (s, 2-СН₃ ), 2,62-2,09 (m, 17^1,2-CH₂), 1,63 (m, 7-СН ₃), 0,81 (t, ³J_AB=7 Гц, 8 ¹-CH₃)

MS (ESI): M⁺=702,4 (вычислено 702,4 для ¹²C¹₄₀H¹⁴ ₄₆N¹⁶₄O²⁴₆ Mg); 616,4 (добавление Н и потеря СOOС₃Н₇ ).

Пример 8. Получение 13³-трет-бутилбензил-Рd-бактериофеофорбид-а-17 ³-трет-бутилбензилового эфира (tbb-Pd-BPheid-tbb)

В результате взаимодействия Pd-BPheid-me в пара-трет-бутилбензиловом спирте в течение 48 часов получают tbb-Pd-BPheid-tbb (50%) после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

Аналитические данные для tbb-Pd-BPheid-tbb: t_r =10,8 мин в ЖХВД (двуокись кремния, градиент 2-10% А в В, при этом А = толуол, В: толуол/метанол/н-пропанол = 100:4:0,5 (об./об./об.); r_f=0,50 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.), скорость потока = 1 мл/мин).

UV/Vis: (DE) _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,49, B _y), 385 (0,36, В_х), 528 (0,15, Q_x ), 755 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,58 (s, 5-Н), 8,75 (s, 10-Н), 8,63 (s, 20-H), 7,50 и 7,26 (2 m, о- и m-бензил-Н при С-13³), 6,53 (s, 13²-Н), 5,53 (s, СН ₂-группа 13³), 5,21, 5,16, 5,13, 5,03 (4 а s, 17³-СН₂), 4,47, 4,22, 4,15, 3,97 (4 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,06 (s, 3¹-СOСН₃ ), 3,41 (s, 12-СН₃), 3,38 (s, 2-СН₃), 2,36 (m, 17^1,2-CH₂), 1,63 (m, 7-СН₃ ), 0,95 (t, ³J_AB=7 Гц, 8¹-CH ₃), 1,65 (d, ³J_AB=7 Гц, 18-СН ₃), 1,2 и 1,8 (tbb-С(СН₃)₃).

MS (ESI): M⁺=992,3 (вычислено 992,5 для ¹²C¹₅₆H¹⁴₆₂ N¹⁶₄O¹⁰⁶₆Pd); 1015 (20%, M⁺+Na), 801,4 (24%, М⁺ - COO-tbb).

Пример 9. Получение 13³-н-пропил-Рd-бактериофеофорбид-а-17 ³-н-пропилового эфира (pr-Pd-BPheid-pr)

Трансэтерификацию начинают с Pd-BPheid-gg в пропаноле, следуя общей методике. Через 12 часов получают продукт pr-Pd-BPheid-pr с выходом, составляющим 71%, после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

Аналитические данные для pr-Pd-BPhe-pr: r_f=0,54 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 10:90 (об./об.).

UV/Vis: (DE) (A_rel задание) = 332 (0,48, B_y), 385 (0,41, В_х), 527 (0,15, Q_x), 755 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] = 9,58 (s, 5-H), 8,75 (s, 10-H), 8,65 (s, 20-H), 6,50 (s, 13²-H), 4,38, 3,97, 3,89, 3,80 (4 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,07 (s, 3¹-СOСН₃), 3,89-3,83 (m, 2H, пропил-OСН₂ при 17³), 3,42 (s, 12-СН₃), 3,39 (s, 2-СН₃), 2,80-2,00 (m, 17^1,2-CH₂), 1,74-1,56 (m, Н пропил-ОСH ₂ при 17³ и 13³), 1,63 (m, 7-СН₃ ), 1,70 (s, 18-СН₃), 0,98 и 0,62 (t, ³J _AB=7 Гц, пропил-СН₃ при 17³ и 13³).

MS (ESI): M⁺=784,7 (вычислено 784,4 для ¹²С¹₄₀H¹⁴ ₄₆N¹⁶₄O¹⁰⁶₆ Pd); 697,5 (17%, M⁺ - СOOС₃Н₇ ).

Пример 10. Пиробактериохлорофиллид-а-17³-н-пропиловый эфир (пиро-BChlide-pr) (формула V на схеме В, центральный металл Мg вместо Pd)

Через 6 дней из пиро-BChlide-gg получают пиро-BChlide-pr (30%) после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

Аналитические данные для пиро-BChlide-pr: r_f=0,76 на C₁₈ двуокиси кремния с обращенной фазой с HEPES/KOH (20 мМ, рН 7,5)/ацетон = 15:85 (об./об.).

UV/Vis: (DE) _mах [нм] (A_rel, задание) - 357 (0,75, B _y), 391 (0,52, B_x), 575 (0,21, Q_x ), 771 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,48 (s, 5-Н), 8,65 (s, 10-H), 4,50-4,00 (4 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,11 (3 ¹-СOСН₃), 3,57 (s, 12-СН₃), 3,46 (s, 2-СН₃), 2,73-2,09 (m, 17-СН₂-группы), 1,63 (m, 7-СН₃), 0,81 (s, 8¹-CH₃ ), 1,70 (s, 18-СН₃), 1,75 (m, H, пропил-OСН₂ при 17³).

MS (ESI): M⁺=616,5 (вычислено 616,3 для ¹²С¹₃₆H¹⁴ ₄₀N¹⁶₄O²⁴₄ Mg)

Пример 11. Пиро-Рd-бактериофеофорбид-а-17³ -трет-бутилбензиловый эфир (пиро-Pd-BPheid-tbb) (формула V на схеме В)

(а) Пиро-Pd-BPheid-me подвергают взаимодействию в течение 48 часов с пара-трет-бутилбензиловым спиртом для получения пиро-Pd-BPheid-tbb. (b) Применяя в качестве исходного материала пиро-Pd-BPhe-gg, получают такой же продукт при прочих равных условиях, выход которого составляет 70% после хроматографии на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом =5:95 (об./об.).

Аналитические данные для пиро-Pd-BPheid-tbb: r_f=0,25 на двуокиси кремния с ацетоном/толуолом = 5:95 (об./об.).

UV/Vis: (DE) _mах [нм] (A_rel, задание) = 332 (0,50, B _y), 384 (0,37, B_x), 530 (0,15, Q_x ), 755 (1, Q_y)

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,63 (s, 5-Н), 8,73 (s, 10-H), 7,31 (s, о- и m-бензил-Н при С-13³), 5,09 и 5,18 (dd ³J_AA'=12 Гц, 13² -H), 5,12 и 5,17 (dd, ³J_AA'=6 Гц, СН ₂ С-17³), 4,8, 4,36, 4,25, 4,02 (4 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,07 (s, 3¹-СOСН₃), 3,48 (s, 12-СН₃), 3,40 (s, 2-СН₃), 2,78-2,33 (m, 17^1,2-CH₂), 1,58 (m, 7-СН₃ ), 0,99 (t, ³J_AB=8 Гц, 8-СН₃ ), 1,68 (d, ³J_AB=7 Гц, 18-СН₃ ), 1,17 (ttbb-C (СН₃)₃).

MS (FAB): M⁺=802,1 (вычислено 802,4 для ¹²C¹ ₄₄H¹⁴₄₈N¹⁶ ₄O¹⁰⁶₄Pd).

Пример 12. Получение Pd-бактериофеофорбид а-17³-N-глюкозамида (Pd-BPheid-Nglc) (формула VI на схеме С)

Другой механизм реакции приводит к получению производных, в которых сложноэфирная группа в положении С-17³ замещена более устойчивой амидной связью (см. схему С).

В аккуратно просушенном устройстве растворяют 60 мг (88 мкмоль) свободного от кислоты Pd-BPheid в 20 мл сухого ДМФ. После охлаждения колбы до 0°С добавляют 70 мг (324 мкмоль) глюкозамина гидрохлорида. Величину рН доводят до 8-9, применяя 31,2 мкл (317 мкмоль) диизопропилэтиламина. Для определения рН каплю реакционной смеси и каплю воды смешивают на полоске рН-индикаторной бумаги. Добавляют 30 мг (91 мкмоль) TBTU (2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторбората) и колбу выдерживают в течение 16 часов при комнатной температуре. В течение ночи колбе дают возможность нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь распределяют между хлороформом и водой. Любой образующийся осадок удаляют фильтрацией. Хлороформную фазу удаляют и пигмент сушат толуолом в роторном испарителе. После хроматографии в системе SII получают продукт с выходом, составляющим 20%.

Аналитические данные для Pd-BPheid-Nglc: r_f=0,75 на C₁₈ двуокиси кремния с обращенной фазой с метанолом.

UV/Vis: (СНСl₃) _mах [нм] (A_rel, задание) = 334 (0,32, B _y), 388 (0,27, B_x), 537 (0,11, Q_x ), 763 (1, Q_y).

¹H-NMR: [частей на млн] (мультиплетность, задание) = 9,58 (s, 5-Н), 8,95 (s, 10-Н), 8,46 (s, 20-Н), 6,37 (s, 13²-H), 4,51, 4,41, 3,83 (3 m, 7-H, 8-Н, 17-Н и 18-Н), 3,07 (s, 3¹ -СOСН₃), 3,43 (s, 12-СН₃), 3,37 (s, 2-СН ₃), 1,68 (m, 7-СН₃), 3,85 (s, 13² -СOOСН₃), 2,8-2,0 (m, 17^1,2-CH₂ ).

MS(ESI): M⁺=875,1 m/z (вычислено 875,3 для ¹²C¹_4lH¹⁴₄₇ N¹⁶₅O¹⁰⁶₁₀Pd); 898,1 (M⁺+Na⁺).

Пример 13. Фототоксичность производных М-BChl по отношению к клеткам меланомы в культурах

Получение липосом

Липосомы L--дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) в качестве системы-носителя для пигментов, нерастворимых в воде, получают в соответствии со способом Toledano, 1998, и способом Cuomo et al., 1990. 1,4×10^-8 мол. ( 130 мкг) фотосенсибилизатора и 5 мг DPPC растворяют в 400 мкл хлороформа. Сверху помещают 250 мкл Н₂O и 250 мкл фосфатного буфера (рН 7,2; 1,5 мМ КН₂РO₄ ; 7,6 мМ Na₂HPO₄; 0,15 M NaCl). Хлороформ удаляют в течение 5 минут быстрым потоком аргона, в то время как смесь обрабатывают ультразвуком и сохраняют при температуре, составляющей 45°С. Обработку ультразвуком продолжают еще в течение 20 минут и липосомы, нагруженные пигментом, получают в надосадочной жидкости после центрифугирования (16000×g, 10 мин). Концентрацию липосом определяют фотометрически при 750 нм (в соответствии со способом Grossweiner and Grossweiner, 1982).

Фотодинамическая активность в однослойной клеточной культуре

Клетки меланомы (мышей) M₂R культивируют в виде монослоев в 96-луночных планшетах для титрования в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла)/F₁₂ 1/1 (об./об.) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 8% СO₂. Среду (рН 7,4) дополняют буфером HEPES (25 мМ), фетальной бычьей сывороткой (FBS) (10%), глютамином (2 мМ), пенициллином (0,06 мг/мл) и стрептомицином (0,1 мг/мл). В течение 24 часов плотность клеток увеличивается от 1×10⁴ до 2×10⁴ клеток/100 мкл. К клеткам добавляют увеличивающиеся количества липосомного препарата, содержащего производное BChl. (Pd-BPheid-ser или Pd-BPheid-Nglc добавляют в виде этанольного раствора (10^-4 M) таким образом, чтобы максимальная концентрация этанола составляла <1%). Вначале клетки держат в темноте в течение 4 часов, промывают 100 мкл среды, обрабатывают 100 мкл свежей среды, а затем облучают снизу через дно планшетов русской лампой BS LS3-PDT, оборудованной фильтром (600-1300 нм). В течение 10 минут клетки облучают дозой света, составляющей 10 mW × s × см^-2. Еще через 24 часа в темноте при 37°С жизнеспособность клеток определяют при помощи микроскопа (размер клеток и форма) и путем введения в ДНК [³H]-тимидина (Chen et al. 1988). Для этого клетки инкубируют в конце эксперимента в течение 2 часов при 37°С с 1 мкСi/мл [³H]-тимидина (в воде). Затем их дважды промывают фосфатным буфером, инкубируют с 7,5% холодной трихлоруксусной кислотой в течение 30 минут при 4°С, вновь промывают 95% этанолом и наконец обрабатывают 200 мкл 1N NaOH в течение 10 минут при 37°С. 100 мкл готовой суспензии в NaOH удаляют, нейтрализуют 100 мкл 1N HCl, смешивают с 4 мл сцинтилляционной жидкости (20,8 (об./об.) ксилен: смесь для сцинтиллятора Lumax) и 5 мл имидозольного буфера (0,1 М).

Результаты представлены на фиг.1(A-D) и 2. Три из сенсибилизаторов, представленных на фиг.1 (A-D) и 2, оказались фототоксичными по отношению к клеткам меланомы мышей M₂R (Pd-BPheid-et (LD₉₀=0,02 мкМ) и tbb-Pd-BPheid-me (LD₉₀=1,1 мкМ)), Pd-BPheid-ser ((LD₉₀=0,1 мкМ). tbb-Pd-BPheid-tbb и Pd-BPheid-NgIc неэффективны в данных условиях, потому что они образуют агрегаты в липосомах, не эффективные для PDT.

Схема А

Таблица 1. [M]-BPhe Франсэтерифицирует селективно в положении С-133 или одновременно в положениях С-13 3 и С-173
Соединение	Формула (схема В)	R2	R1	R 1	M
Me-BChl-gg	I	gg	me	-	Mg
Me-Pd-BPhe-me	I	me	me	-	Pd
Me-Pd-BPhe-gg	I	gg	me	-	Pd
Tbb-Pd-BPhe-tbb	III	tbb	-	tbb	Pd
Tbb-Pd-BPhe-me	II	me	-	tbb	Pd
Tbb-Pd-BPhe-gg	II	gg	-	tbb	Pd
NtBoc-ser-Pd-BPhe-me	II	me	-	ser	Pd
Pr-Pd-Bphe-pr	III	pr	-	pr	Pd
Me-Pd-Bphe-pr	II	pr	-	me	Pd
Pr-Pd-Bphe-gg	II	gg	~	pr	Pd
Pr-BChl-pr	III	pr	-	pr	Mg

Таблица 2. Трансэтерификация продуктов пиро-[M]BPhe
Соединение:	Формула (схема В)	R1	R1	М
Пиро-BCh1-gg	IV	gg		Mg
Пиро-Pd-BPhe-gg	IV	gg		Pd
Пиро-Pd-BPhe-tbb	V	-	tbb	Pd
Пиро-Pd-BPhe-pr	V	-	pr	Pd
Пиро-BChl-pr	V	-	pr	Mg

Схема В. Реакционная схема для получения производных бактериохлорофилла, трансэтерифицированных в положении С-13³ и/или С-17 ³

VI-R₄ представляет остаток глюкозамина

Схема С. Сочетание глюкозамина с С-17³ Pd-Bpheid

ССЫЛКИ

Beems, E. M., Dubbelman, T.M.A.R, Lugtenburg, J., van Best, J.A., Smeets, M.F.M.A., & Boegheim, J.P.J. (1987) Photochem. Photobiol. 46, 639-644.

L. Chen, S. Gross, V. Rosenbach-Belkin, A. Brandis, Y. Salomon and A. Scherz (1988) Microbial photoinactivation by serine and IgG conjugates of chlorophyll and bacteriochlorophyll. In: Proceedings of the 7th Biennial Congress., International Photodynamic Association (ed. T. Patrice).

Cuomo, V.; Jori, G.; Rither, B. and Denney, M.E.R.M. A.J. (1990). Br. J. Cancer. 62:966-970.

Dougherty, T.J. (1992) Bacteriochlorophyll a Derivatives Useful in Photodynamic Therapy., Pat No. 5171741, USA. Int. Class A 61 K 31/40, Appl. No. 341,591.

Fiedor, L., Gorman, A.A, Hamblett, I., Rosenbach-Belkin, V., Salomon, Y., Scherz, A., & Tregub, I. (1993) Photochem. Photobiol. 58, 506-511.

Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., M. Sai and A. Scherz (1996) Preparation of tetrapyrrole-amino acid covalent complexes. Plant Physiol. Biochem. 34, 393-398.

S.Gross, A.Brandis, L.Chen, V.Rosenbach-Belkin, S.Roehrs, A. Scherz and Y. Salomon (1997) Protein A mediated Bacteriochlorophyll-IgG targeting to Staphylococcus aureus:

A model for enhanced site-specific photocytotoxicity. Photochem. Photobiol 66, 872-878.

Grossweiner, L.I.P.A.S. and Grossweiner, J.B. (1982). Photobiol. 36: 159-167.

Hunt, J.E., & Michalski, T.J. (1991). Chlorophylls, H.Scheer. (ed.) Boca Raton: CRC Press.

Hynninen, P.H. (1991) in 'Chlorophylls' (Scheer, H., ed.), pp 145-210, CRC-Press, Boca Raton.

Imwinkelried, R., Schiess, M., & Seebach, D. (1987). Org. Synth. 65, 230-235.

S. Katz, Y.Vakrat, V.Brumfeld, L.Weiner, E.Gabelman, A. Brandis, A. Paul, M. Hild, R.Lendt, D.Leopold, J.R. Norris, Y.Salomon and A.Scherz (1998), Bacteriochlorophyll-serine generates only hydroxy radicals under near infra-red illumination In: Proceedings of the 7th Biennial Congress., International Photodynamic Association (ed. T. Patrice).

D.K. Kelleher, O.Thews, J.Rzeznik, A.Scherz, Y.Salomon and P.Vaupel (1999) Water-filtered infrared-A radiation: a novel technique for localized hyperthermia in combination with bacteriochlorophyll-based photodynamic therapy, Int.J. of Hyperthermia (In press).

Kessel, D., Smith, K.M., Pandey, R.K., Shiau, F.Y., & Henderson, B. (1993) Photochem. Photobiol. 58, 200-203.

Moser, J.G. (ed.) (1998) Photodynamic Tumor Therapie, 2^nd and 3^rd Generation Photosensitisers, Harwood Academic Publishers, Netherlands.

Neises, B. & Steglich, W. (1978). Angew. Chem. 90, 556.

Pandey, R.K, Shiau, F.Y., Sumlin, A. B., Dougherty, T.J. & Smith, K.M. (1994) Bioorg Med. Chem. Let. 4, 1263-1267.

Pennington, F.C., Strain, H.H., Svec, W.A., & Katz, J.J. (1963). J.Am.Chem.Soc. 86:1418-26.

Rehwinkel, H. & Steglich, W. (1982) Synth. Comm. 827.

V. Rosenbach-Belkin, L.Chen, L.Fiedor, Y.Salomon and A. Scherz (1998) Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives as photodynamic agents. In: Photodynamic Tumor Therapy; 2nd and 3rd Generation Photosensitizers (ed. J.G. Moser), Harwood Academic Publishers, Australia, 117-125.

Scheer, H. (ed.) (1991), Chlorophylls, CRC-Press, Boca Raton.

A.Scherz, S.Katz, Y.Vakrat, V.Brumfeld, E.Gabellman, J.Zilberstein, D.Leopold, J.R. Norris, H.Scheer, and Y.Salomon (1998) Bacteriochlorophyll-serine based photochemotherapy; type III PDT? In: "Photosynthesis: Mechanisms and Effects" (Ed. G. Garab), Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, the Nederlands, V.V pp.4207-4212.

Schneider, C.H. & Eberle, A.N. (1992). Peptides. ESCOM Science Publishers B.V.

Schnurrenberger P., Züger M. F. & Seebach, D.(1982). Helv. Chim. Acta 65, 1197-201.

Seebach, D., E. Hungerbühier, R. Naef, P. Schnurrenberger, B. Weidmann, & M. Züger. (1982). "Titanate-Mediated Transesterifications with Functionalized Substrates." Comm. Synth., 139-141.

Spikes, J.D. & Bommer, J.C. (1991) in 'Chlorophylls' (Scheer, H., ed.), pp 1181-1204, CRC-Press, Boca Raton.

Struck, A., Snigula, H., Rau, H.-K., Hörth, P., Scheer, H., Haehnel, W. in G. Garab (ed.): Photosynthesis: Mechanisms and Effects, Kluwer, 1999, pp.4213-4216.

Toledano, F.; Edrei, R. and Kimel, S. (1998) J. Photochem. Photobiol. B: Biol.; 42:20-27.

Tregub, I., Rosenbach-Belkin, V., Fiedor, L., Azrad, A., Shai, E., Pavlotszky, F., Salomon, Y. & Scherz, A. (1993) Abstracts of the Fifth Congress of the European Society for Photobiology, 201.

J.Zilberstein, A.Bromberg, A. Franz, V. Rosenbach-Belkin, A.Kritzmann, R.Pfeferman, Y.Salomon and A.Scherz (1997) Light dependent oxygen consumption in bacteriochlorophyll-serine treated melanoma tumors: on line determination using a tissue inserted oxygen microsensor. Photochem. Photobiol 65, 1012-1020.

J.Zilberstein, V.Rosenbach-Belkin, A.Scherz, and Y.Salomon (1998) A novel tissue inserted optical oxygen microsensor: on-line determination of effective photodynamic therapy in solid melanotic melanoma tumors in: Photodynamic Tumor Therapy; 2nd and 3rd Generation Photosensitizers. (ed. J.G. Moser), Harwood Academic Publishers, Australia, 183-194.

J.Zilberstein, V.Rosenbach-Belkin, M.Neeman, P.Bendel, F. Kohen, B.Gayer, A. Scherz and Y. Salomon (1998) Bacteriochlorophyll-based PDT of solid tumors relies on vascular destruction. In: Proceedings of the 7th Biennial Congress., International Photodynamic Association, (ed. T. Patrice).

J.Zilberstein, M.C.W.M. Bloemers, M. Neeman, A. Scherz and Y. Salomon (1999) Therapy of solid melanoma tumors by vascular infarction and perfusion arrest in bacteriochlorophyll-serine vbase photochemotherapy, Cancer Res. Submitted.