1-этаноламид pgf₂ фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. 1-Этаноламид РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> формулы:

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252212/2252212-18.gif" BORDER="0">

или его фармацевтически приемлемые соли, снижающие внутриглазное давление у млекопитающих, проявляющие глазную гипотензивную активность не через FP-простагландиновый рецептор.

2. 1-Этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> по п.1, отличающийся тем, что представляет собой выделенное в основном чистое химическое вещество.

3. Фармацевтическая композиция, эффективная для снижения внутриглазного давления у млекопитающего при необходимости лечения такой композицией, включающая в качестве активного компонента эффективное количество 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252010/945.gif" BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> формулы:

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252212/2252212-19.gif" BORDER="0">

или его фармацевтически приемлемой соли, снижающих внутриглазное давление у млекопитающих, но проявляющих глазную гипотензивную активность не через FP-простагландиновый рецептор, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, пригодная для местного введения в глаз млекопитающего.

Описание изобретения к патенту

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к глазным гипотензивным липидам. В частности, настоящее изобретение относится к 1-этаноламиду PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ) и родственным соединениям, и к содержащим эти соединения фармацевтическим композициям, а также к способам применения этих соединений для снижения внутриглазного давления у млекопитающих.

2. Краткое описание уровня техники

Из уровня техники хорошо известно о многочисленных глазных гипотензивных агентах, применяемых для лечения различных гипертензивных состояний глаза, включая первичную и вторичную глаукому, представляющую серьезную проблему для здоровья человека. Лекарственные препараты, использующиеся для лечения глазной гипертензии (глаукомы), включают в себя антагонисты фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252212/2252212-8.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">-адренорецепторов и различные простагландины. Имеется значительный объем научной и патентной литературы, касающейся простагландинов и их использования для лечения глазной гипертензии. Например, см. Bito L.Z. Biological Protection with Prostaglandins Cohen, M.M., ed., Boca Raton. Fla., CRC Press Inc., 1985, pp. 231-252; и Bito, L.Z., Applied Pharmacology in the Medical Treatment of Glaucomas Drance, S.M. and Neufeld, A.H. eds., New York, Grune & Stratton, 1984, pp. 477-505.

Патент US 5288754 содержит, кроме того, ссылки на уже известный уровень техники, направленные на простагландины и родственные соединения, активные в качестве средств для снижения внутриглазного давления у млекопитающих. Сам патент США описывает "Polar С-1 Esters of Prostaglandins" ("Полярные С-1-эфиры простагландинов"), включая С-1-амиды и С-1-замещенные амиды карбоновой кислоты соединения, известного как PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Дополнительные производные простагландина, родственные PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , которые были выявлены из изучения уровня техники, проведенного в исследовательских лабораториях заявителя настоящей заявки, и которые проявляют высокую внутриглазную гипотензивную активность, показаны ниже формулой и идентифицированы произвольными номерами как "известное соединение 1 " и "известное соединение 2". Известное соединение 1 описано в патентах US 5352708, 5607978 и 5688819, а известное соединение 2 описано в патенте US 5545665.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 BORDER="0">

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 BORDER="0">

Значительное большинство глазных гипотензивных агентов, имеющих структуру простагландина или близко родственную ему структуру, действуют через известные "простагландиновые" рецепторы. В частности, известно, что соединение PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> проявляет свое глазное гипотензивное действие через FP-рецептор. Как раскрыто в работе Abramovitz с соавт. (J. Biol. Chem., 269:2632, 1994), включенной здесь в качестве ссылки, под термином "FP-рецептор" подразумевают рецептор к простагландину человека. Структура PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , содержащая нумерацию, обычно используемую в номенклатуре простагландинов и родственных соединений, изображена ниже.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">

Настоящее изобретение направлено на класс соединений, родственных 1-этаноламиду PGF₂, которые наряду с известными соединениями 1 и 2, были неожиданно обнаружены в качестве средств, обладающих сильной глазной гипотензивной активностью, но которые не проявляют своего глазного гипотензивного действия ни через FP-рецептор, ни через какой-либо другой известный к настоящему времени простагландиновый рецептор, например DP, ЕР, ЕP₂ , ЕР₃, ЕP₄, FP, IP и ТР.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на соединения Формулы 1, где пунктирные линии означают отсутствие связи или связь при условии, что в формуле нет двух соседних двойных связей;

присоединения волнистых линий означают альфа( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">, вниз)- или бета( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252212/2252212-8.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">, вверх)-конфигурацию, там, где волнистые линии присоединены к двойной связи, они означают либо Z(цис)-, либо Е(транс)-конфигурацию;

штриховые линии обозначают альфа( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">)-конфигурацию, а сплошные треугольники - бета( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="/images/patents/216/2252212/2252212-8.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">)-конфигурацию;

m представляет собой целое число от 0 до 5;

n представляет собой целое число от 1 до 6 при условии, что соединение, представленное формулой, не является 1-этаноламидом PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ;

q и r независимо друг от друга являются целыми числами от 0 до 6;

X представляет собой СН₂, O или S, при условии, что когда Х представляет собой O или S, пунктирная линия, примыкающая к X, обозначает отсутствие связи;

R означает СН₃, фенил, фурил, тиенил, С _3-8-циклоалкил, или фенил, фурил или тиенил, замещенные одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из F, C1, Вr, С_1-6-алкила, NO₂, CN, СOOН и СOO-(С_1-6-алкила);

R₁, R₂ , R₃ и R₄ независимо друг от друга представляют собой Н или C_1-6-алканоил с нормальной или разветвленной цепью, бензоил или низший С_1-6-алкил;

R ₅ представляет собой Н или С_1-6-алкил с нормальной или разветвленной цепью и

R₆ представляет собой Н или С_1-4-алкил с нормальной либо разветвленной цепью

или фармацевтически приемлемую соль данного соединения, причем указанные соединения снижают внутриглазное давление у млекопитающего, но не проявляют свою глазную гипотензивную активность ни через FP-простагландиновый рецептор, ни через какой-либо другой общеизвестный простагландиновый рецептор.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

Настоящее изобретение также относится к выделенному в основном чистому 1-этаноламиду PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , который, как было неожиданно установлено, присутствует в основных биологических системах в качестве природного соединения. Кроме того, настоящее изобретение направлено на фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного компонента 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и/или одно или более соединений в соответствии с Формулой 1, и на способ лечения млекопитающих, включая человека, при необходимости такого лечения, эффективным количеством фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента 1-этаноламид PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и/или одно или более соединений в соответствии с Формулой 1, для снижения внутриглазного давления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 представляет собой график влияния возрастающих доз 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на гладкую мышцу сфинктера радужной оболочки кошки. Точки обозначают средние значения ± SEM (среднеквадратичная ошибка, standard error of the mean); n=4.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий ингибирующее влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на область стимулированного сокращения изолированного сосуда семенного протока морской свинки. Точки обозначают средние значения ± SEM; n=4.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий влияние возрастающих доз 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную подвздошную кишку цыпленка. Точки обозначают средние значения ± SEM; n=4.

Фиг.4 представляет собой график, показывающий влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную подвздошную кишку морской свинки. Точки обозначают средние значения ± SEM; n=4.

Фиг.5 представляет собой график, показывающий влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную гладкую мышцу аорты крысы. Точки обозначают средние значения ± SEM; n=4.

Фиг.6 представляет собой график, показывающий увеличение концентрации внутриклеточного Ca²⁺ [Ca²⁺];, вызванное возрастающими дозами PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ) и 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) в клетках CRL 1497. Точки являются средними значениями ± SEM; n=4.

Фиг.7 представляет собой график, показывающий сосудорасширяющее действие 1-этаноламида простагландина F ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ) и простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) на предварительно сокращенный гистамином сегмент яремной вены кролика. Точки являются средними значениями ± SEM; n=6 для 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , n=7 для PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> .

Фиг.8 представляет собой график, показывающий увеличение концентрации внутриклеточного Ca²⁺ [Ca²⁺ ]_i, вызванное возрастающими дозами PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ) и 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Точки являются средними значениями ± SEM; n=3.

Фиг.9 представляет собой график, показывающий общее накопление инозитфосфата, вызванное возрастающими дозами 17-фенилпростагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ) и 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Даны средние значения ± SEM; n=3.

Фиг.10 представляет собой график, показывающий общее накопление инозитфосфата, вызванное возрастающими дозами 17-фенилпростагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ) и 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором человека. Даны средние значения ± SEM; n=3.

Фиг.11 представляет собой график, показывающий анализ конкуренции связывания меченого лиганда в сравнении с 5 нМ ³H-17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> с использованием клеток НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Изображена конкуренция, осуществленная с помощью немеченого 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) и немеченого 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ). Точки являются средними значениями ± SEM; n=3 экспериментам, выполненным с тремя повторностями.

Фиг.12 представляет собой график, показывающий анализ конкуренции связывания меченого лиганда в сравнении с 5 нМ ³H-17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> с использованием клеток НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором человека. Изображена конкуренция, осуществленная с помощью немеченого 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) и немеченого 17-фенил- PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0"> ). Точки являются средними значениями ± SEM; n=3 экспериментам, выполненным с тремя повторностями.

Фиг.13 представляет собой график, показывающий влияние 0,1% 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) на внутриглазное давление собаки. Контралатеральные глаза для контроля обрабатывали наполнителем (о). Точки являются средними значениями ± SEM; n=6.

Фиг.14 представляет собой график, показывающий влияние 0,1% 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) на диаметр зрачка собаки. Контралатеральные глаза для контроля обрабатывали наполнителем (о). Точки являются средними значениями ± SEM; n=6.

Фиг.15 представляет собой график, показывающий влияние 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ( фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">) на гиперемию поверхности глаза собаки. Контралатеральные глаза для контроля обрабатывали наполнителем (о). Точки являются средними значениями ± SEM; n=6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В связи с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> является природным соединением и может быть образован из анандамида, природного каннабиномиметика, с помощью рекомбинантной СОХ-2 и PGF-синтазы. Известно, что СОХ-2 (циклооксигеназа-2) представляет собой эндопероксидсинтазу простагландина, которая является индуцибельной и не обязательно присутствует в тканях (см. Meade et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6610-6614). Поскольку не ожидалось, что СОХ-2 будет присутствовать в нестимулированных тканях, полученные из настоящего изобретения данные о том, что значительные количества этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> образовывались после введения белым мышам анандамида, являются неожиданными. Кроме того, этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> также неожиданно был обнаружен у мышей, не получавших анандамида, что подтверждает тот факт, что 1-этаноламид PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> является конститутивным и может вести себя как эндогенно синтезируемый гормон.

В соответствии с изобретением, 1-этаноламид РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> был синтезирован с целью получения этого вещества в изолированном и химически чистом виде и для обеспечения возможности составления фармацевтических композиций, содержащих это вещество. Синтез этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> также дает возможность синтезировать все соединения в пределах Формулы 1, но лишь с такими модификациями в процессе синтеза, которые легко доступны для практикующего химика-органика и, в частности, для химика, работающего в области химии простагландинов и родственных соединений. Таким образом, настоящее изобретение охватывает соединения Формулы 1.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

Предпочтительные соединения в объеме правовой охраны изобретения представлены Формулой 1а, и особенно предпочтительными являются соединения в пределах Формулы 1а, где пунктирные линии между атомами углерода 10 и 11, 8 и 12, 17 и 18 означают отсутствие связи, а между атомами углерода 5 и 6 означают связь. Кроме того, поскольку представляет интерес замещение гидроксильных функциональных групп соединений Формулы 1а или Формулы 1 (от R₁-группы до R₄), в настоящий момент предпочтительными являются соединения, в которых одна или более гидроксильных групп не этерифицированы и не алкилированы (один или более заместитель от R₁ до R₄ представляет собой Н), или, если эти группы этерифицированы, этерифицирующая группа представляет собой алканоил, имеющий от 1 до 6 углеродных атомов (формил, ацетил, пропаноил, бутаноил, пентаноил, гексаноил или какой-либо С_3-6 -алканоил с разветвленной цепью). Поскольку представляет интерес заместитель, обозначенный как R₅ в Формуле 1а или Формуле 1, предпочтительными являются соединения, в которых R ₅ является Н или низшим С_1-3-алкилом, наиболее предпочтителен Н. R₆ предпочтительней представляет собой Н или низший С_1-3-алкил, наиболее предпочтителен Н, и n предпочтительно равно 2.

Вновь возвращаясь к Формуле 1а и Формуле 1, конфигурация групп OR₁, OR₂ и OR₃ предпочтительней представляет собой альфа(С-9, С-11 и С-15- фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">)-конфигурацию, а конфигурация двойной связи 5-6 - предпочтительней Z(цис)- конфигурацию.

Наиболее предпочтительными соединениями согласно настоящему изобретению являются 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и его ацилированные или алкилированные производные, представленные Формулой 2, где заместители от R₁ до R₄ определены как для Формулы 1, но ацилированные соединения являются более предпочтительными, чем алкилированные.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> =R₁=R₂=R₃=R₄ =H

Синтез соединений изобретения проиллюстрирован с помощью синтеза 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , представленного реакционной схемой 1, а также подробно раскрыт ниже. Обратимся теперь к схеме реакции. Коммерчески доступную триэтаноламмониевую соль (соль трометамина, трис(гидроксиметил)аминометана) карбоновой кислоты PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> обрабатывают кислотой для выделения свободной карбоновой кислоты. Свободную карбоновую кислоту PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> превращают в метиловый эфир обработкой метилирующим агентом (предпочтительно, йодистым метилом) в присутствии акцептора кислоты (предпочтительно, 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена) с получением метилового эфира РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Затем метиловый эфир PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> обрабатывают этаноламином для получения 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Таким образом, вся "амидная" группа вводится в молекулу в ходе реакции между метиловым эфиром PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и производным гидроксиалкиламина Формулы 3, где R ₅, R₆ и n такие, как определены выше для Формулы 1, и где Формула 3 представляет собой этаноламин, в котором R ₅ и R₆ означают Н, и n равно 2. Гидроксиалкиламины Формулы 3 доступны благодаря химической литературе и с успехом используются в работе практикующего химика-органика. Соединения, для которых в Формуле 1 одна или более пунктирных линий представляют собой связь, и/или где конфигурация гидроксильных групп или конфигурация заместителей около одной или более двойных связей иные, чем в 1-этаноламиде PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , могут быть получены с помощью реакций, аналогичных изображенным на реакционной схеме 1, но при использовании в качестве исходного соединения производного С-1-карбоновой кислоты простагландина соответствующей структуры и стереохимии. Эти исходные соединения доступны благодаря химической литературе и используются в работе практикующего химика-органика. Соединения, для которых в Формуле 1 одна или более групп от R₁ до R₄ отличается от Н, то есть соединения, где один или более атомов углерода С-9, С-11, С-15 и гидроксигруппа гидроксиалкильного фрагмента в амидной части этерифицированы или алкилированы, могут быть получены реакциями этерификации или алкилирования из "свободных гидроксильных" соединений. Вообще говоря, модификации а- и фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">-боковых цепей соединений Формулы 1, как определено для этой формулы, используются в работе практикующего химика-органика в соответствии с патентами США №5545665, 5834498 и 5352708 или по аналогии с ними. Описания этих патентов приводятся здесь в виде ссылок.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Соединения изобретения являются уникальными, поскольку представляют собой сильнодействующие глазные гипотензивные агенты, которые, тем не менее, не действуют через FP-рецептор. Это показано с помощью нескольких аналитических методов, которые хорошо известны в данной области и используются для определения внутриглазной гипотензивной активности, а также для определения рецептора, через который действуют эти соединения. Внутриглазная гипотензивная активность 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и его фактическая инертность в отношении FP- или других известных рецепторов простагландинов, продемонстрированная несколькими методами, являются особенно поразительными и неожиданными при сравнении биологического распределения этого соединения с "предшественником" PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> .

Описание биологических исследований и результаты исследований приведены ниже.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННОЙ ТКАНИ

Напряжение гладкой мышцы изолированных тканей измеряли изометрически с помощью датчиков силового смещения (Grass FT-03) и записывали на Grass Polygraphs (модели 7G и 79Е). Ванночки для органов содержали раствор Кребса, выдержанный при 37°С и насыщенный смесью газов 95% O₂/5% СO₂ для получения рН 7,4. Раствор Кребса имел следующий состав (мМ): NaCl, 118,0; КСl, 4,7; КН₂РO₄ 1,2; СаСl ₂, 1,9; MgSO₄, 1,18; NaHCO₃, 25,0; глюкоза, 11,7; индометацин, 0,001.

(а) РАДУЖНАЯ ОБОЛОЧКА КОШКИ

Взрослых домашних кошек умерщвляли введением внутривенно сверхдозы пентобарбитала натрия (Anthony, Arcadia, CA). Глаза сразу же энуклеировали и помещали в лед. Мышцу сфинктера радужной оболочки закрепляли вертикально с натяжением от 50 до 100 мг в ванночке для органов емкостью 10 мл, имеющей двойные стенки. Перед началом каждого эксперимента был предусмотрен период стабилизации длительностью 60 мин. Активность определяли по ответным реакциям сокращения. Соединения добавляли в ванночку кумулятивно и, по меньшей мере, 30 минут после полной отмывки отводили на восстановление и возвращение к исходному растяжению. В качестве контроля определяли ответную реакцию на 10^-7 М PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в начале и в конце каждого эксперимента и между кривыми зависимости "доза - ответ". Для каждой ткани было проанализировано не более двух соединений.

(б) АОРТА КРЫСЫ

Взрослых крыс Sprague Dawley весом 180-220 г подвергали наркозу с помощью ингаляции СО₂, после чего декапитировали и обескровливали. Грудную аорту извлекали и очищали от всех прилегающих тканей. Для удаления крови просвет аорты промывали. Аорту разделяли на три небольших сегмента длиной 5-8 мм. Каждый сегмент закрепляли с натяжением 2 г в ванночке для органов емкостью 10 мл, имеющей двойные стенки, с помощью двух проволочных крючков, размещенных вдоль просвета сосуда. Такое размещение позволяет измерять силу сокращений, развиваемых круговым слоем гладкой мышцы. Ткани уравновешивали в течение 1 часа перед кумулятивным добавлением соединений в ванночки для органов. В качестве контроля в начале и в конце каждого эксперимента определяли ответную реакцию на 10^-7 М U-46619 (тромбоксаномиметика). На восстановительный период после полной отмывки лекарственного препарата отводили 30-45 минут. Для каждой ткани было проанализировано только одно исследуемое соединение.

(в) ПОДВЗДОШНАЯ КИШКА ЦЫПЛЕНКА

Подвздошная кишка цыпленка представляет собой модель для изучения ЕР₃-рецептора. Участки подвздошной кишки цыпленка длиной 1,5 см подвешивали с натяжением 1 г. После 1 часового периода уравновешивания получали стандартную кривую "доза-ответ" для PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> с 30 минутными отмывками между отдельными дозами. Затем некумулятивно добавляли анализируемое соединение. Под конец в качестве второго контроля добавляли максимальную дозу РGЕ ₂ (10^-6 М). Затем для каждой концентрации вычисляли сократительную активность как % от максимального ответа на PGE ₂, достигнутого при концентрации 10^-6 М.

(г) ПОДВЗДОШНАЯ КИШКА МОРСКОЙ СВИНКИ

Подвздошная кишка морской свинки представляет собой модель для изучения EP ₁-рецептора. Сегмент подвздошной кишки морской свинки размером приблизительно 1,5 см подвешивали с натяжением 1 г в ванночке для органов, имеющей двойные стенки. После 1-часового периода уравновешивания получали кривую зависимости "доза - ответ" для PGE₂. Между дозами допускались 30-минутные периоды отмывки. Аналогичным образом получали кривую "доза - ответ" для 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . В качестве контроля в конце вводили 10^-6 М РGЕ₂. Данные выражали как % от максимального ответа на РGЕ₂.

(д) СОСУД СЕМЕННОГО ПРОТОКА МОРСКОЙ СВИНКИ

Активность в отношении подтипа простагландин-чувствительного ЕР₃-рецептора определяли также по способности простаноидов ингибировать судорожную реакцию гладкой мышцы, вызванную действием электрического тока на изолированный сосуд семенного протока морской свинки. Участки сосуда семенного протока морской свинки размером 1,5 см подвешивали с начальным натяжением 1 г и уравновешивали в течение, по меньшей мере, 30 минут. Затем каждые 30 секунд ткани подвергали раздражению электрическим импульсом 20 вольт. После стабилизации судорожной реакции для PGE₂ получали в кумулятивную стандартную кривую зависимости "доза - ответ". Затем с помощью кривой зависимости "кумулятивная доза - ответ" оценивали исследуемые соединения. Ткани промывали и уравновешивали в течение 1 часа между добавлением соединений. В качестве стандартного контроля в конце эксперимента снова оценивали PGE₂. Активность вычисляли как процент ингибирования пика судорожной реакции мышцы.

(е) ЯРЕМНАЯ ВЕНА КРОЛИКА

Новозеландским кроликам-альбиносам обоего пола весом 2-4 кг вводили 1000 ед. гепарина в маргинальную глазную вену, после чего умерщвляли с помощью углекислого газа. Внешние яремные вены очищали от жира и прилегающей соединительной ткани и извлекали. Вены рассекали и каждое кольцо длиной 3-4 мм подвешивали между двумя металлическими крючками в ванночке для органов, имеющей двойные стенки. Ткани уравновешивали в течение 1 часа с натяжением 0,75 г, которое повторно регулировали по мере расслабления тканей. Для сокращения ткани и определения ответной реакции применяли однократные дозы гистамина: 10^-5 М, затем 2-3×10 ^-6 M, с отмывкой после каждой дозы. Затем на 5 минут прикладывали антагонист ТР-рецептора SQ29548 в концентрации 10 ^-6 М (Ogletree et al. (1985) J. Pharmacol. Exp. Ther. 234 435-441), после чего добавляли 2-3×10^-6 М гистамина для стимуляции сократительной реакции. Через 30 мин после предварительной обработки гистамином анализировали реакцию расслабления путем добавления кумулятивных доз исследуемых соединений с 10^-8-10^-7 М PGE₂ в конце каждой кривой зависимости "доза - ответ" в качестве контроля. На восстановительный период после отмывки тканей отводили 30-50 минут. Релаксационную активность вычисляли как % от контрольного тонуса, вызванного гистамином.

(ж) ТРОМБОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА

Простаноидную активность по отношению к DP-, TP- и IP-рецепторам определяли по их способности вызывать агрегацию (ТР-рецепторная активность) или ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro (DP- и IP-рецепторная активность). Свежую цельную кровь получали от здоровых доноров-волонтеров и смешивали с цитратно-декстрозным раствором (ACD -(citric) acid, (sodium) citrate, dextrose). Кровь центрифугировали со скоростью 1000 об/мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). К 400 мкл PRP добавляли 4,5 мкл простаноида или наполнителя и инкубировали 2 мин при 37°С в агрегометре Пэйтона, наблюдая за агрегационной активностью. Для полной агрегации добавляли АДФ до конечной концентрации 2×10^-5 М. Ингибирование агрегации вычисляли как процентную разницу между агрегацией, вызванной 2×10^-5 М АДФ в отсутствие и в присутствии лекарственного препарата. Агрегационную активность вычисляли как процент агрегации, вызванной простаноидом, относительно агрегации, вызванной 2×10^-5 М АДФ. В начале и конце каждого эксперимента определяли контрольные агрегационные реакции лишь для 2×10^-5 М АДФ.

(з) КЛЕТКИ CRL 1497: Са²⁺-СИГНАЛ

Клетки человека CRL 1497 сеяли в культуральные флаконы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ 1-глутамина и 0,05 мг/мл гентамицина (все получено от Gibco, Grand Island, NY). Клеточные культуры поддерживали во влажной атмосфере (95% воздуха, 5% СO₂) и растили до получения монослоя.

Клетки извлекали из культуральных флаконов приблизительно через 1 мин после обработки смесью 0,05% трипсин/0,53 мМ ЭДТА в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) при 37°С. Протеолитическую активность ингибировали добавлением 5 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки последовательно промывали раствором Хенкса и средой, содержащей 140 мМ NaCl, 50 мМ КСl, 1 мМ MgCl₂, 1,5 мМ CaCl ₂, 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота): трис (тригидрооксиметиламинометан), 5 мМ глюкозы, 5 мМ пируватаМа, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, при рН 7,4.

Центрифугирование между промывками осуществляли при комнатной температуре в течение 15 минут при 200 g. Клетки подсчитывали, ресуспендировали в упомянутой выше среде и инкубировали с 2×10 ^-6 М смеси Fura 2 и ацетоксиметилового эфира на встряхиваемой водяной бане в течение 30 минут при 37°С. Далее клетки промывали в вышеуказанной среде и ресуспендировали до концентрации 2×10 ⁶ клеток/мл. Затем аликвоты по 0,5 мл клеточной суспензии добавляли в микропробирки с автоматическими крышками для того, чтобы на каждое экспериментальное определение концентрации внутриклеточного свободного Са²⁺ ([Са²⁺]_i) приходилось 10⁶ клеток.

Флюоресценцию измеряли на флюоресцентном спектрофотометре Perkin-Elmer LS-5 в интервале длин волн возбуждения и излучения от 340 до 492 нм, соответственно, с обеими щелями по 10 нм. Для каждого экспериментального определения 10⁶ клеток отмывали (при 200 g в течение 5 мин) и суспендировали в 2 мл кювете с буфером, содержащим 120 мМ NaCl, 6 мМ КСl, 1 мМ MgSO₄, 1,5 мМ СаСl₂, 20 мМ HEPES, 1 мг/мл глюкозы и 1 мг/мл пиру вата Na. Перемешивание осуществляли с помощью установленной наверху лопастной мешалки, при температуре 37°С. Для получения f_max клетки лизировали дигитонином (10 мкл из 100 мг/мл ДМСО). Затем для получения f_min последовательно добавляли EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота) (100 мМ) и 10 N NaOH для подведения рН раствора до 8,5.

(и) РЕКОМБИНАНТНЫЙ FP-РЕЦЕПТОР КОШКИ И ЧЕЛОВЕКА; СТАБИЛЬНЫЕ ТРАНСФЕКТАНТЫ

Клетки НЕК-293 выращивали в DMEM с 10% сыворотки плода коровы (FBS), 250 мкг/мл G418 (Life Technologies) и 200 мг/мл гентамицина или пенициллина/стрептомицина. Отбор стабильных трансфектантов проводили с помощью 200 мкг/мл гигромицина, причем оптимальную концентрацию определяли, исследуя кривые гибели клеток в зависимости от концентрации гигромицина.

Клетки для трансфекции выращивали на 10 см чашках до 50-60% монослоя. Плазмиду рСЕР4, содержащую вставки кДНК для FP-рецептора человека (20 мкг), добавляли к 500 мкл 250 мМ CaCl₂. Затем по каплям прибавляли HBSS × 2 (280 мМ NaCl, 20 мМ HEPES кислоты, 1,5 мМ Na₂ HPO₄, pH 7,05-7,12) до 500 мкл при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Через 30 мин к смеси добавляли 9 мл DMEM. Затем к клеткам, предварительно отмытым 10 мл фосфдтно-солевого буфера (PBS), прибавляли смесь ДНК/ПМЕМ/фосфат кальция.

Клетки инкубировали в течение 5 часов при 37°С во влажной атмосфере (95% воздуха, 5% СO₂). Затем раствор фосфата кальция удаляли и клетки в течение 2 мин обрабатывали 10% раствором глицерина в DMEM. Раствор глицерина меняли затем на среду DMEM, содержащую 10% сыворотки плода коровы (FBS). Клетки инкубировали в течение ночи, и среду меняли на DMEM/10% FBS, содержащую 250 мкг/мл G418 и пенициллин/стрептомицин. На следующий день добавляли гигромицин В до конечной концентрации 200 мг/мл.

Через десять дней после трансфекции отделяли гигромицин В-устойчивые клоны и помещали их в отдельную лунку на 24-лу ночной плате. После достижения монослоя каждый клон переносили в одну лунку 6-луночной платы, а затем в 10 см чашку. Клетки поддерживали в условиях селекции гигромицином до использования.

Стабильные трансфектанты, содержащие FP-рецептор кошки, получали аналогичным образом, используя липофектамин. Клетки также выращивали до 50-60% монослоя в 10 см чашках и с помощью липофектамина трансфицировали плазмидой рСЕР4, включающей вставки кДНК, кодирующей FP-рецептор кошки. Селекцию с помощью гигромицина В начинали через 48 часов после трансфекции. Через восемь дней после трансфекции устойчивые к гигромицину В клоны отделяли и переносили в 24-лу ночные платы.

Исследования Са²⁺-зависимой передачи сигналов на рекомбинантных FP-рецепторах кошки и человека проводили аналогично тому, как описано для клеток CRL 1497.

(к) ОБРАЗОВАНИЕ ИНОЗИТФОСФАТА

Рецептор-опосредованный гидролиз фосфоинозитида (PI) определяли измерением накопления суммарного инозитфосфата (IP) в клетках, предварительно инкубированных с ³H-миоинозитом. Постоянные клеточные линии НЕК 293, экспрессирующие FP-рецепторы человека или кошки, засевали в 10 см чашки (по 10⁶ клеток на каждую чашку в DMEM с 10% FBS). На следующий день клетки инкубировали с 18 мкКи мио-[2 ³H]инозита (Amersham; 10-20 мкКи/ммоль) в 6 мл DMEM с 10% FBS при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), инкубировали в течение 5 мин с 1 мл трипсин-ЭДТА и суспендировали в 10 мл DMEM, содержащей 25 мМ HEPES. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и ресуспендировали в DMEM/25 мМ HEPES с 10 MMLiCI в течение 10 мин. Аликвоты по 200 мкл клеточной суспензии инкубировали с 50 мкл лекарственного препарата в течение 30 мин при 37°С (двойное определение), после чего с помощью 750 мкл смеси хлороформ-метанол-4 н. НСl=100:200:2 останавливали стимуляцию агониста с последующим добавлением 250 мкл хлороформа и 0,5 N HCl для экстракции инозитфосфатов. 750 мкл водного слоя наносили на колонку, заполненную 0,5 мл анионобменной смолы Dowex AG 1-X8 (формиатная форма, 100-200 меш, BioRad) для отделения компонентов с радиоактивной меткой. Процедура элюирования состояла из трех 3 мл промывок с 5 мМ инозита, затем двух 750 мкл элюций 1,3 М формиатом аммония с 0,1 М муравьиной кислоты. Элюат смешивали с 10 мл сцинтилляционной жидкости Аквазоль (Packard Instrument Co.) и с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика определяли общую концентрацию ³Н] инозитфосфатов.

(л) СВЯЗЫВАНИЕ МЕЧЕНОГО ЛИГАНДА

Препараты плазматической мембраны клеток НЕК 293, стабильно трансфицированных FP-рецептором человека или кошки, получали следующим образом. Клетки, промытые ТМЕ-буфером, соскабливали со дна флакона и гомогенизировали в течение 30 с с помощью Brinkhman PT 10/35 политрона. При необходимости, для подведения объема до 40 мл в центрифужные пробирки добавляли ТМЕ-буфер, содержащий 100 мМ трис-основания, 20 мМ MgCl₂ , 2 мМ ЭДТА; физиологическое значение рН получали прибавлением 10 н. HCl.

Клеточный гомогенат центрифугировали со скоростью 19000 об/мин при 4-6°С в течение 20 мин на роторе Ti-60 Beckman. Осадок затем ресуспендировали в ТМЕ-буфере для получения конечной концентрации белка 1 мг/мл, как определено с помощью Biorad анализа. Количественные анализы связывания радиоактивных лигандов выполняли в объеме 200 мкл.

Связывание [³ Н](N)17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (удельная активность 85 Ки/ммоль) определяли в двух повторностях, и опыты повторяли три раза. Инкубации проводили в течение 60 мин при 25°С и останавливали добавлением 4 мл ледяного 50 мМ трис-НСl буфера с последующей быстрой фильтрацией через фильтры Whatman GF/B и тремя дополнительными промывками по 4 мл в клеточном коллекторе (Brandel). Проводили анализы конкурентного связывания, используя конечную концентрацию 5 нМ [³H](N)17-фенил-РGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , а неспецифическое связывание определяли с помощью 10 ^-5 М немеченого 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> .

(м) ВНУТРИГЛАЗНОЕ ДАВЛЕНИЕ (ВГД)

Исследования внутриглазного давления у собак с привлечением пневматонометрии проводили на находящихся в сознании собаках породы коротконогая гончая обоего пола (10-15 кг). Животные оставались в сознании на протяжении всего исследования и слегка удерживались рукой. Лекарственные препараты вводили местно в один глаз в виде капли объемом 25 мкл, другой глаз для контроля обрабатывали 25 мкл наполнителя (0,1% полисорбата 80-10 мМ трис). Для анестезии роговицы во время тонометрии использовали 0,1%-ный раствор пропаракаина. Внутриглазное давление определяли непосредственно перед введением препарата и через 2, 4 и 6 часов после введения каждый день на протяжении 5 дней исследования. Лекарство вводили сразу после регистрации первого значения ВГД.

(н) ДИАМЕТР ЗРАЧКА

Диаметр зрачка собаки измеряли с помощью оптического стержня (миллиметровой линейки, содержащей полукруглые отметки стандартной ширины (мм) в качестве контроля. Слегка придерживая собаку рукой, при нормальном комнатном освещении измеряли диаметр зрачка путем подбора полукруга к зрачку. Для собак с очень темными зрачками использовали специальный точечный фонарик, но только очень быстро во избежание сужения зрачка. Диаметр зрачка измеряли в то же время, что ВГД и гиперемию.

(о) ГИПЕРЕМИЯ ГЛАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Гиперемию глазной поверхности определяли визуально и рассчитывали по системе, использующейся в обычной клинической практике.

фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0">

Гиперемию глазной поверхности оценивали одновременно с измерением внутриглазного давления. Необходимо отметить, что необработанные глаза собак часто имели розовато-красный оттенок. Таким образом, следовая и даже слабая гиперемия не обязательно выходит за пределы нормального диапазона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эффекты 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на сфинктер радужной оболочки кошки изображены на Фиг.1 и представлены в виде таблицы (Таблица 1). 1-Этаноламид простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (1-этаноламид РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ) вызывал дозозависимое сокращение гладкой мышцы сфинктера радужной оболочки кошки. Была получена величина эффективной концентрации (ЭК)₅₀, равная 58 нМ. Данные указывают на критическую концентрацию в области 10 нМ.

1-Этаноламид простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> был умеренно эффективен при ингибировании области раздражения, вызвавшего сокращение изолированного препарата сосуда семенного протока морской свинки. Данные показыны на Фиг.2 и представлены в виде таблицы (Таблица 2).

Фиг.3 показывает влияние 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную подвздошную кишку цыпленка. Сравнение реакции с контрольным соединением (простагландином Е₂ , 10^-6 М) подтверждает, что 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> может вести себя отчасти как слабый агонист. Данные представлены в Таблице 3. 1-Этаноламид РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> оказался менее эффективным для подвздошной кишки цыпленка (Фиг.4, Таблица 4), которая, как сообщалось, является моделью для изучения EP₁-рецептора.

Эффекты возрастающих доз 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную аорту крысы показаны на Фиг.5 и в Таблице 5. При высоких дозах, 10^-6 и 10^-5 М, наблюдалась остаточная активность. Поскольку аорта крысы является моделью для изучения ТР-рецептора, активность в отношении ТР-рецептора дополнительно оценивали во время агрегации тромбоцитов. Кроме того, определяли ингибирование АДФ, вызывающего агрегацию тромбоцитов человека, для того, чтобы обнаружить какое-либо взаимодействие с DP- или IP-рецепторами. Никакого влияния на тромбоциты не наблюдалось. Данные представлены в Таблице 6; график не прилагается, так как никакой реакции не было.

Са²⁺-сигнал, продуцируемый возрастающими дозами 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в фибробластах кожи человека (клетки CRL 1497), сравнивают с сигналом, продуцируемым простагландином F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , на Фиг.6. Данные также представлены в виде таблицы (Таблица 7). Полученные значения ЭК₅₀ составляли 16 нМ для PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 1586 нМ для 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , показывая почти стократное различие в активности по отношению к FP-рецептору человека.

Недавние исследования показали, что простагландин F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> может вызывать эндотелийзависимое, NO (окись азота)-опосредованное расширение сосудов (Chen et al. (1995) Br. J. Pharmacol. 116: 3035-3041). Таким образом, эффекты 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> сравнивали с эффектом PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> при продуцировании эндотелийзависимого расширения сосудов (вазорелаксации) предварительно сокращенного под действием гистамина изолированного сегмента яремной вены кролика. В то время как PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> продуцировал заметную вазорелаксацию, 1-этаноламид PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> проявлял относительно низкую активность (Фиг.7). Данные также представлены в виде таблицы (Таблица 8). Были получены следующие значения ЭК₅₀ для предварительно сокращенного сегмента яремной вены кролика: 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> =2000 нМ, PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> =5,3.

Поскольку заметная активность наблюдалась для 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в отношении препарата сфинктера радужной оболочки кошки, его активность сравнивали с активностью РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в отношении рекомбинантного FP-рецептора кошки. Фиг.8 дает сравнение активности 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> при стимуляции Са²⁺-сигнала в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Были получены значения ЭК₅₀, равные 14 нМ для РGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 1458 для 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , которые указывают на почти стократное различие в активности. Данные также представлены в виде таблицы (Таблица 9).

Эффекты 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на общее накопление инозитфосфата в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки, показаны на Фиг.9. Снова очевидно большое различие в активности. Значения ЭК₅₀ составили 9 нМ для 17-фенил-PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 524 нМ для 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Данные также представлены в виде таблицы (Таблица 10).

Кроме того, были исследованы эффекты 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 17-фенил-PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на общее накопление инозитфосфата в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором человека. Были получены значения ЭК₅₀, равные 8 нМ для 17-фенил PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 1003 нМ. Данные представлены на Фиг.10 и в Таблице 11. Результаты были аналогичны результатам, полученным для рекомбинантного FP-рецептора кошки.

Согласно функциональным исследованиям, использующим стабильно трансфицированные FP-рецепторами препараты, 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> имел относительно умеренную аффинность (химическое сродство) к FP-рецептору. Таким образом, 1-этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (известное соединение 1) имел лишь слабое сродство к рецептору кошки, тогда как 17-фенил- PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> проявлял высокое сродство (Фиг.11; Таблица 12). 50%-ная ингибирующая концентрация (ИK₅₀) для полученного 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> составила 882 нМ, по сравнению с величиной ИК₅₀ , равной 43,5, для 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Аналогичные результаты были получены для рекомбинантного FP-рецептора человека: в случае 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ИК₅₀=2015 нМ, 17-фенил- РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> -ИK₅₀=2,3 нМ. Эти данные по связыванию меченого лиганда изображены на Фиг.12 и представлены в виде таблицы (Таблица 13).

Глазное действие 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> изучали на собаках. 1-Этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в 0,1%-ной дозе вызывал заметное и очень значительное снижение внутриглазного давления (Фиг.13; Таблица 14). Действие сохранялось в течение всего 24-часового экспериментального периода. 1-Этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> также вызывал заметное сужение зрачка (миоз) (Фиг.14; Таблица 15). В отличие от глазного гипотензивного действия, уменьшение диаметра зрачка устранялось к 24 ч временной точке. 1-Этаноламид PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> вызывал слабую гиперемию глазной поверхности, сравнимую со следовой для наполнителя, в течение всего 24-часового экспериментального периода (Фиг.15; Таблица 16).

В следующих Таблицах, если не указано особо, концентрация исследуемых или контрольных соединений показана в виде логарифмической экспоненты. В соответствии с этим и в качестве примера, "-8" в таблицах означает концентрацию 10^-8 М исследуемого или контрольного соединения.

Таблица 1
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального сократительного ответа фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	2,7±1,7	77±5,5	119,2±6,0	126,0±3,6

ТАБЛИЦА 1. Влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную гладкую мышцу сфинктера радужной оболочки кошки. Контрольное сокращение создавали с помощью 10^-7 М PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Даны средние значения ± SEM; n=4.

Таблица 2
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального ингибирования сокращений фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	2,2±1,3	12,5±6,2	37,7±8,4	98,5±1,0

ТАБЛИЦА 2. Ингибирующее влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на область стимулированного сокращения изолированного сосуда семенного протока морской свинки.

Таблица 3
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального сократительного ответа фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	0±0	15,0±8,4	50,7±4,0	66,5±9,4

ТАБЛИЦА 3. Влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную подвздошную кишку цыпленка. Контрольное сокращение создавали с помощью 10^-6 М PGE₂ . Даны средние значения ± SEM; n=4.

Таблица 4
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального ответа фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	0±0	0±0	1,7±1,0	15,8±1,6

ТАБЛИЦА 4. Влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную подвздошную кишку морской свинки. Контрольное сокращение создавали с помощью 10^-6 М PGE₂ . Даны средние значения ± SEM; n=4.

Таблица 5
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального сократительного ответа фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SЕМ	0±0	0±0	4,0±2,6	9,7±4,2

ТАБЛИЦА 5. Влияние возрастающих доз 1-этаноламида PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на изолированную аорту крысы. Контрольное сокращение создавали с помощью 10^-7 М U-46619. Даны средние значения ± SEM; n=4.

Таблица 6
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-7	-6	-5
% Агрегация тромбоцитов	0±0	0±0	0±0
% Ингибирование агрегации тромбоцитов	0±0	0±0	0±0

ТАБЛИЦА 6. Влияние возрастающих доз 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на агрегацию тромбоцитов и ингибирование агрегации, индуцированной АДФ. Контрольный ответ вызывают с помощью 2×10^-5 М АДФ. Даны средние значения ± SEM; n=4.

Таблица 7
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-9	-8	-7	-6	-5
Среднее значение фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">[Са 2+]i фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	-	3,4±1,5	13,5±3,9	45,8±11,5	97,9±10,8
	Концентрация простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-9	-8	-7	-6	-5
Среднее значение фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">[Ca 2+]i фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	5,6±2,4	47,7±9,4	124,1±6,5	127,4±7,6	136,7±11,2

ТАБЛИЦА 7. Увеличение внутриклеточной концентрации свободного Ca²⁺ [Ca²⁺];, вызванное возрастающими дозами 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в CRL 1497 кожных фибробластов человека.

Таблица 8
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-10	-9	-8	-7	-6	-5
% среднее значение релаксации фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	100±0	99,7±0,3	93,2±2,2	80,3±3,2	54,3±10,2	38,4±11,3
	Концентрация простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-11	-10	-9	-8	-7	-6
% среднее значение релаксации фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SЕМ	98±1,1	92,5±2,3	71,9±7,2	25,8±7,8	8,3±3,0	6,7±2,7

ТАБЛИЦА 8. Вазорелаксация предварительно сокращенного сегмента яремной вены кролика под действием 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Контрольное расширение сосудов обеспечивают с помощью 10^-7 М PGE₂. Даны средние значения ± SEM; n=6 для 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , n=7 для РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> .

Таблица 9
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ; log [M]
	-10	-9	-8	-7	-6	-5
Среднее значение фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">[Са 2+]i фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	-	-	0±0	28,5±3,1	45,2±6,4	77,2±14,7
	Концентрация простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-10	-9	-8	-7	-6	-5
Среднее значение фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">[Ca 2+]i фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	6,5±5,0	22,2±6,4	45,7±5,3	78,8±7,3	87,9±9,0	85,0±9,6

ТАБЛИЦА 9. Увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са²⁺ [Са²⁺]_i, вызванное возрастающими дозами 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Даны средние значения ± SEM; n=3.

Таблица 10
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-9	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального образования инозитфосфата фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	-	3,4±3,2	14,9±4,7	63,0±16,4	89,2±4,8
	Концентрация 17-фенилпростагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-9	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального образования инозитфосфата фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	17,8±6,4	5б,8±10,8	89,7±2,4	99,9±1,1	-

ТАБЛИЦА 10. Общее накопление инозитфосфата, вызванное возрастающими дозами 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 17-фенилпростагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором кошки. Контрольное раздражение создают с помощью 10^-6 М 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Даны средние значения ± SEM. n=3 для 1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 4 для 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в опытах, выполненных с двумя повторностями.

Таблица 11
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-9	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального накопления инозитфосфата фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	-	0,3±0,6	10,0±1,6	48,4±3,3	85,0±1,9
	Концентрация 17-фенилпростагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-9	-8	-7	-6	-5
% Среднее значение максимального накопления инозитфосфата фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	14,7±3,3	57,8±2,0	92,3±0,9	100,0±1,3	-

ТАБЛИЦА 11. Общее накопление инозитфосфата, вызванное возрастающими дозами 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> 17-фенилпростагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , в клетках НЕК-293, стабильно трансфицированных рекомбинантным FP-рецептором человека. Контрольное раздражение создают с помощью 10^-6 М 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> . Даны средние значения ± SEM. n=3 для 1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 4 для 17-фенил-PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> в опытах, повторенных дважды.

Таблица 12
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [M]
	-9	-8		-7		-6	-5
% Среднее значение удельного связывания фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	89,6±3,2	93,7±3,8		89,7±4,9		48,0±2,9	8,3±4,8
	Концентрация 17-фенилпростагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-10	-9	-8		-7	-6	-5
% Среднее значение удельного связывания фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	92,7±6,9	80,7±7,1	43,7±1,5		17,0±6,5	10,3±8,9	0±0

ТАБЛИЦА 12. Изучение конкурентного связывания меченого лиганда (1-этаноламида РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> против 5 нМ ³H-17-фенил-РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ) с рекомбинантным FP-рецептором кошки. Даны средние значения ± SEM; n=3 опытам, повторенным дважды.

Таблица 13
	Концентрация 1-этаноламида простагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-9		-8		-7		-6		-5
% Среднее значение удельного связывания фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	94,7±1,4		103,3±0,3		95,9±1,5		63,7±2,7		19,7±1,2
	Концентрация 17-фенилпростагландина F2 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> , log [М]
	-10	-9		-8		-7		-6		-5
% Среднее значение удельного связывания фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	98±1,1	65,0±1,0		24,0±1,2		5,3±1,5		1,7±1,7		0±0

ТАБЛИЦА 13. Изучение конкурентного связывания меченого лиганда (1-этаноламида PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> и 17-фенил- PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> против 5 нМ ³H-17-фeнил-PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ) с рекомбинантным FP-рецептором человека. Даны средние значения ± SEM; n=3 опытам, выполненным дважды.

Таблица 14
		Время измерения внутриглазного давления (час)
		0	2	4	6	24
Среднее значение внутриглазного давления (мм рт. ст.) фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">±SEM	Тестируемый глаз	19,1±0,9	16,2± 1,1**	14,6± 0,9**	14,0± 0,9**	15,2± 0,7**
	Контрольный глаз	20,3±0,7	20,4±1,0	20,0±1,0	20,8±0,6	20,0±0,9

ТАБЛИЦА 14. Влияние 0,1%-ного раствора 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на внутриглазное давление собаки. Даны средние значения ± SEM; n=6. **р<0,01 существенное отклонение по сравнению с базовым внутриглазным давлением согласно t-распределению Стьюдента.

Таблица 15
		Время измерения диаметра зрачка (час)
		0	2	4	б	24
Диаметр зрачка (мм)	Тестируемый глаз	6,7±0,2	1,0±0,4**	1,0± 0,3**	1,5± 0,4**	7,0±0,3
	Контрольный глаз	6,3±0,2	6,3±0,2	6,3±0,2	6,3±0,2	6,3±0,2

ТАБЛИЦА 15. Влияние 0,1%-ного раствора 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на диаметр зрачка собаки. Даны средние значения ± SEM; n=6. **р<0,1 существенное отклонение по сравнению с базовым диаметром зрачка согласно t-распределению Стьюдента.

Таблица 16
		Время измерения гиперемии глазной поверхности (час)
		0	2	4	6	24
Показатель гиперемии глазной поверхности	Тестируемый глаз	0,3±0,1	1,3±0,2	1,2±0,2	1,2±0,2	1,1±0,2
	Контрольный глаз	0,2±0,1	0,5±0	0,5±0	0,5±0	0,4±0

ТАБЛИЦА 16. Влияние 0,1%-ного раствора 1-этаноламида простагландина F₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> на гиперемию глазной поверхности собаки. Даны средние значения ± SEM; n=6.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Фармацевтические композиции могут быть приготовлены путем комбинирования терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного компонента со стандартными, приемлемыми в офтальмологии, фармацевтическими наполнителями и путем приготовления стандартных лекарственных форм, пригодных для местного глазного применения. Терапевтически эффективное количество обычно составляет от примерно 0,0001 до 5% (вес./об.), предпочтительно, от примерно 0,001 до 1,0% (вес./об.) для жидкой лекарственной формы.

Для офтальмологического применения предпочтительно готовят растворы, используя в качестве основного наполнителя физиологический солевой раствор. Предпочтительней поддерживать рН таких офтальмологических растворов в интервале между 6,5 и 7,2 с помощью подходящей буферной системы, наиболее предпочтительным является нейтральное значение рН. Лекарственные средства могут также содержать стандартные, фармацевтически приемлемые консерванты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества.

Предпочтительные консерванты, которые могут использоваться в фармацевтических композициях настоящего изобретения, включают, но не исчерпываются перечнем, хлорид бензалкония, хлорбутанол, тимеросал (натриевая соль этилртутьтиосалициловой кислоты), ртутьацетофенил и ртутьнитрофенил. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является, например, Tween 80 (моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбитана). Предпочтительней использовать в офтальмологических препаратах настоящего изобретения также различные наполнители. Эти наполнители включают, но не исчерпываются перечнем, поливиниловый спирт, повидон (поливинилпирролидон), гидроксипропилметилцеллюлозу, полоксамеры, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу и очищенную воду.

При необходимости или для удобства могут быть добавлены регуляторы тонуса. Они включают, но не исчерпываются перечнем, соли, в частности хлорид натрия, хлорид калия, маннит и глицерин или какой-либо другой подходящий офтальмологически приемлемый регулятор тонуса.

Могут использоваться различные буферы и средства для регуляции рН при условии, что полученный препарат будет офтальмологически приемлемым. Соответственно, буферные композиции включают ацетатные буферы, цитратные буферы, фосфатные и боратные буферы. Для регуляции рН таких лекарственных препаратов, при необходимости, могут быть использованы кислоты или основания.

Аналогично, офтальмологически приемлемый антиоксидант для использования в настоящем изобретении включает, но не исчерпывается перечнем, метабисульфит натрия, тиосульфат натрия, ацетилцистеин, бутилированный гидроксианизол и бутилированный гидрокситолуол.

Другими наполнителями, которые могут быть включены в офтальмологические препараты, являются хелатирующие агенты. Предпочтительным хелатирующим агентом является динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, хотя другие хелатирующие агенты также могут использоваться вместо нее или в сочетании с ней.

Компоненты обычно используют в следующих количествах:

Компонент, количество (% вес/об.)

активный компонент около 0,001-5

консервант 0-0,10

наполнитель 0-40

регулятор тонуса 0-10

буфер 0,01-10

регулятор рН, количество для подведения рН до

4,5-7,5

антиоксидант, при необходимости

поверхностно-активное вещество, при необходимости

очищенная вода, при необходимости для доведения объема до 100%

Фактическая доза активных соединений настоящего изобретения зависит от конкретного соединения и от условия введения; выбор соответствующей дозы с успехом осуществляется в пределах знаний квалифицированного специалиста.

Офтальмологические лекарственные средства настоящего изобретения удобно упаковывают в формы, подходящие для дозированного применения, например, в контейнеры, снабженные капельницей для облегчения введения в глаз. Контейнеры, подходящие для капельного применения, обычно изготовлены из подходящего инертного нетоксичного пластического материала и, как правило, вмещают от 0,5 до примерно 15 мл раствора.

Растворы, особенно не содержащие консервантов, часто готовят в емкостях для одноразового применения, содержащие примерно до десяти, предпочтительно, примерно до пяти стандартных доз, где обычная стандартная доза содержит от одной до примерно 8 капель, предпочтительно, от одной до примерно 3 капель. Объем одной капли обычно составляет около 20-35 мкл.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБОВ СИНТЕЗА

Пример 1.

РGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (свободная карбоновая кислота)

К перемешиваемому раствору 20 г трометаминовой соли PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (трометамин -трис(гидроксиметил)аминометан) (51,9 ммоль) в 150 мл Н₂О прибавляли концентрированную НСl так, что рН раствора доводили до 2. Раствор экстрагировали 3×200 мл хлороформа и концентрировали в вакууме. Свободная карбоновая кислота PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> появлялась, главным образом, в виде осадка, наслаивавшегося между водной и органической фазами. Осадок с этого слоя собирали и объединяли с осадком, полученным фильтрацией концентрированного хлороформенного раствора, после чего объединенные осадки промывали 50% смесью хлороформ/метанол.

Метиловый эфир PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ; метил-(5Z,8 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,9 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,11 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,13E,15S)-9,11,15-тригидроксипроста-5,13-диен-1-оат

К перемешиваемому раствору свободной карбоновой кислоты PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (2,528 г, 7,13 ммоль) в 50 мл ацетона прибавляли 3,2 мл 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (21,39 ммоль) и 1,33 мл йодистого метила (21,39 ммоль). Раствор перемешивали в течение ночи, разбавляли 150 мл этилацетата, промывали 2×50 мл 0,5 м LiOH, 1×50 мл солевого раствора и концентрировали в вакууме для получения указанного соединения, чистого метилового эфира (чистота проверена с помощью ЯМР ¹Н).

¹H ЯМР (СDCl ₃): 5,56-5,34 (м, 4Н), 4,01 (м, 1Н), 3,87 (м, 1H), 3,63 (с, 1Н), 3,18 (т, 2Н, J=5,8 Гц), 2,31-2,02 (м, 8Н), 1,69-1,25 (м, 12Н), 0,849 (т, 3Н, J=6,7 Гц).

1-Этаноламид PGF ₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> ; (5Z,8 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,9 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,11 фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE">,13E,15S)-9,11,15-тригидрокси-N-(2-гидрокси-этил)проста-5,13-диен-1-амид

К перемешиваемому раствору метилового эфира PGF₂ фармацевтическая композиция, патент № 2252212" SRC="" height=100 height=100 height=100 BORDER="0" ALIGN="ABSMIDDLE"> (235,4 мг, 0,639 ммоль) в 4,5 мл безводного метанола прибавляли 771 мкл этаноламина (12,78 ммоль). Трубку, содержащую смесь, герметизировали и в течение ночи нагревали при 50°С. Отбирали аликвоту, концентрировали в вакууме при нагревании для удаления избытка этаноламина и анализировали методом ЯМР ¹H. Было показано, что реакция завершилась на 80%. Раствор для удаления остаточного этаноламина концентрировали в глубоком вакууме при 65°С в течение 1,5 часов, затем при 60°С в течение ночи с помощью перегонки Kugehlrohr'a. ¹H ЯМР и ТСХ в системе 5% метанол/этилацетат показали удаление этаноламина (метиловый эфир: R_f=0,41, 1-этаноламид: R_f =0,04). Технический продукт был подвергнут флэш-хроматографии смесью 5% метанол/этилацетат для извлечения оставшегося непрореагировавшего исходного вещества, метилового эфира, в фракциях 4-8, и 50% смесью метанол/этилацетат для получения требуемого указанного соединения в фракциях 11-18. Дополнительная флэш-хроматография фракций 11-18 смесью 15% метанол/этилацетат дала указанное соединение, не содержащее исходного вещества, но все еще загрязненное эпимером С 15 в некоторых фракциях (фракции 7-10), и требуемый продукт в чистом виде (фракции 11-20). Спектры ¹H ЯМР и ¹³С ЯМР указанного соединения и его С15-эпимера идентичны. Теоретический выход = 254,0 мг, фактически полученный выход 205,6 мг, 81%.

¹Н ЯМР (CD₃OD): 5,4-5,2 (м, 4Н), 3,98 (м, 1Н), 3,89 (м, 1Н), 3,72 (м, 1Н), 3,47 (т, 2Н, J=5,8 Гц), 3,18 (т, 2Н, J=5,8 Гц), 2,24-1,90 (м, 8Н), 1,50-1,21 (м, 12Н), 0,796 (т, 3Н, J=6,5 Гц).