3-фенил-6-r₁-7-r₂-1,2,4-бензотриазины, обладающие противовирусной активностью

Формула изобретения

3-Фенил-6-R₁-7-R₂-1,2,4-бензотриазины, обладающие противовирусной активностью и имеющие общую формулу (1)

где R₁ и R₂ - независимо друг от друга означают атом фтора или С₁-С₄-алкоксигруппу, незамещенную или замещенную галоидом или тетрагидрофурилрадикалом.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к области биологически активных соединений, касается разработки новых 3-фенил-1,2,4-бензотриазинов и их производных и предназначено для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, включая ортопоксвирусы, патогенные для человека, а также поствакцинальных осложнений.

Проблема разработки противовирусных препаратов актуальна на протяжении всего периода существования человечества. Среди вирусных инфекций выделяются такие возбудители особо опасных вирусных инфекций, как вирус натуральной оспы, вызывающий тяжелое заболевание у человека с летальность до 40-60%. Кроме того, данный вирус представляет особый интерес, так как относится к одному из наиболее вероятных агентов для использования в биотеррористических целях. Наиболее эффективным способом профилактики натуральной оспы является вакцинация с использованием вируса осповакцины, однако при проведении массовой вакцинации возможно появление значительного количества поствакцинальных осложнений. Кроме того, в природе циркулирует вирус оспы коров, который способен вызывать заболевание у человека. Кроме того, в экваториальной Африке в последние годы среди населения отмечаются вспышки оспы обезьян с летальность до 10-20%. Таким образом, необходимо наличие высокоэффективных противовирусных препаратов, которые бы обладали высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Предшествующий уровень техники

Существующий препарат метисазон (Марборан®) обладает только профилактической активностью, но не лечебной активностью в отношении вируса натуральной оспы. Препарат цидофовир (Vistide®) проходит в настоящее время исследования как профилактический или лечебный препарат, но пока его исследования не закончены. На фармацевтическом рынке в настоящее время практически нет препаратов, активных в отношении вирусов группы оспы, в этой связи разработка таких веществ может стать важным шагом в обеспечении фармакологической безопасности жизни людей.

Известны данные о биологической активности производных 1,2,4-бензотриазинов (J.G.Erickson, P.F.Wiley and V.P.Wystrach. The 1,2,3- and 1,2,4-Triazines, Tetrazines and Pentazines, Interscience Publishers, Inc., New York, N.Y. 1956, p.44) [1]. Известно, что 3-амино-7-хлор-1,2,4-бензотриазин 1-оксид обладает антималярийной активностью (J.K.Horner, D.W.Henry. Analogs of 3-Amino-7-chloro-1,2,4-benzotriazine 1-Oxide as Antimalarial Agents. J.Medicinal Chemistry, 1968, 11, p.946-949) [2]. 3-Амино-1,2,4-бензотриазин 1,4-диоксид (Tirazone®, tirapazamine, "Тирапазамин") - эффективный противоопухолевый препарат (Е.М.Zeman, J.M.Brown, M.J.Lemmon, V.K.Hirst and W.W.Lee. SR-4233: a new bioreductive agent with high selective toxicity for hypoxic mammalian cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1986 Jul; 12(7): 1239-42) [3]. Пиридо[3,4-е]-1,2,4-триазины обладают антибактериальной активностью (Reich, Marvin F.; Fabio, Paul F.; Lee, Ving J.; Kuck, Nydia A.; Testa, Ray T. Pyrido[3,4-e]-l,2,4-triazines and related heterocycles as potential antifungal agents. J.Medicinal Chemistry, 1989, 32(11), р.2474-2485) [4].

Однако вышеприведенные соединения [1-4] не обладают противовирусной активностью.

Известен ряд производных триазина, обладающие противовирусной активностью: производные 1,3,5-триазина, обладающих активностью против вирусного гепатит А (Международная заявка (WO) №96/04914, МПК А 61 К 31/53, опубл. 22.02.96) [5]; производные триазина, обладающие активностью против ретровирусов (Заявка Японии №6016561, МПК А 61 К 31/655, опубл. 25.01.94 г.) [6]; производные 1,3,5-триазина, обладающие активностью против гепатита В (Патент США №6335339, МПК А 61 К 31/53, опубл. 01.01.2002) [7].

Однако о данных соединениях нет сведений, что они обладают активностью в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека, а также эти соединения не обладают свойством устранения поствакцинальных осложнений.

Наиболее близким химическим соединением - прототипом является соединение 1,2,4-бензотриазин-3-амин-1,4-диоксид, обладающее противоопухолевым действием (Международная заявка (WO) №97/11699, МПК А 61 К 31/53, опубл. 03.04.1997) [8].

Однако данное соединение не обладает противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом предлагаемого изобретение является нахождение новых химических соединений на основе 1,2,4-бензотриазинов, обладающих противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению предложены новые соединения 3-фенил-6-R1-7-R2-1,2,4-бензотриазинов, обладающие противовирусной активностью и имеющие общую формулу (1)

где R₁ и R₂ - независимо друг от друга означают атом фтора или С₁-С₄-алкоксигруппу, незамещенную или замещенную галоидом или тетрагидрофурилрадикалом.

3-Фенил-6-R₁-7-R₂-1,2,4-бензотриазины общей формулы (1) (R₂ - фтор, R₁ - С ₁-С₄-алкоксигруппы, остатки 2,2,2-трифторэтанола или тетрагидрофурфурилового спирта) получают циклизацией соответствующих 1,3,5-трифенилформазанов в смеси уксусной и серной кислот. Кроме того, 3-фенил-6-R₁-7-R₂-1,2,4-бензотриазины общей формулы (1) (R₁ и R₂ - С₁ -С₄-алкоксигруппы) могут быть получены из 3-фенил-6-R ₁-7-фтор-1,2,4-бензотриазинов реакцией с алкоголятом натрия в среде соответствующего спирта (схема 1).

Схема 1

Ниже приведены примеры синтеза заявляемых соединений.

Пример 1.

3-Фенил-6-этокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-29)

1-(4-этокси-3-фторфенил)-3,5-дифенилформазан (10 ммоль) растворяли в 35 мл уксусной кислоты, охлаждали до 0°С и медленно добавили 10 мл серной кислоты. Реакционную массу нагревали 10 минут на кипящей водяной бане, наблюдали изменение окраски от фиолетовой до темно-коричневой. Реакционную массу охлаждали до 0°С и выливали в ледяную воду (50 мл). Выпавший осадок отфильтровывали, промывали ледяной водой, сушили и перекристаллизовывали из этанола или смеси этанол: хлороформ (2:1).

Выход 55%. Т. пл. 164-165°С. Найдено, %: С 67.13, Н 4.46, N 15.67. C₁₅H₁₂FN₃O. Вычислено, %: С 66.90, Н 4.49, N 15.61. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆ , , ppm, (J_HF): 1.54 (t, 3Н, ), 4.42 (q, 2H, ), 7.51-7.59, 8.59-8.62 (m, 5H, С₆Н₅), 8.18 (d, 1H, H-8, ³J_HF= 10.3 Гц), 8.62 (d, 1H, H-5, ⁴j_HF= 7.3 Гц).

Пример 2.

3-Фенил-6-метокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-277)

Получен аналогично из 1-(4-метокси-3-фторфенил)-3,5-дифенилформазана. Выход 80%. Т. пл. 194-195°С. Найдено, %: С 65.84, Н 3.91, N 16.71. С₁₄Н₁₀FN₃О. Вычислено, %: С 65.88, Н 3.92, N 16.47. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆ , , ppm, (J_HF): 4.14 (s, 3Н, СН₃О), 7.59-7.62, 8.57-8.61 (m, 5H, С₆Н₅), 8.27 (d, 1H, H-8, ³j_HF=10.9 Гц), 8.59 (d, 1H, H-5, ⁴ j_HF=6.8 Гц).

Пример 3.

3-Фенил-6,7-диметокси-1,2,4-бензотриазин (SK-278).

Растворяли 0.24 г (10 ммоль) натрия металлического в 70-80 мл абсолютного метилового спирта, к полученному раствору добавляли 3-фенил-6-метокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазина (10 ммоль), реакционную массу нагревали на водяной бане до полного растворения осадка (15-20 мин). Затем реакционную массу оставляли на 10-12 час при 20-25°С, осадок NaF отфильтровывали. Растворитель упаривали в вакууме, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре ледяной водой, высушивали и перекристаллизовывали из спирта. Выход 40%. Т. пл. 203-204°С. Найдено,%: С 67.35, Н 4.91, N 15.62. C₁₅H₁₃N₃O₂ . Вычислено, %: С 67.42, Н 4.87, N 15.37. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆, , ppm: 4.07 (s, 6H, 2СН₃О), 7.55-7.59, 8.55-8.59 (т, 5H, С₆Н₅), 7.35 (s, 1H, H-8), 7.72 (s, 1H, H-5).

Пример 4.

3-Фенил-6-пропокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-279).

Получен аналогично из 1-(4-пропокси-3-фторфенил)-3,5-дифенилформазана. Выход 40%. Т. пл. 128-129°С. Найдено, %: С 67.91, Н 5.06, N 14.81. C₁₆H₁₄FN₃O. Вычислено, %: С 67.84, Н 4.95, N 14.84. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆ , , ppm, (J_HF): 1.10 (t, 3Н, ), 1.93 (q, 2H, ), 4.31 (q, 2H, ), 7.55-7.60, 8.59-8.61 (m, 5H, С₆Н₅), 8.22 (d, 1H, H-8, ³j_HF= 10.5 Гц), 8.61 (d, 1H, H-5, ⁴j_HF=7.3 Гц).

Пример 5.

3-Фенил-6-бутокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-280).

Получен аналогично из 1-(4-бутокси-3-фторфенил)-3,5-дифенилформазана. Выход 65%. Т. пл. 124-125°С. Найдено, %: С 68.70, Н 5.43, N 14.16. C₁₇H₁₆FN₃O. Вычислено, %: С 68.69, Н 5.39, N 14.14. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆ , , ppm, (J_HF): 1.03 (t, 3Н, ), 1.57 (q, 2H, ), 1.89 (q, 2H, ), 4.35 (q, 2H, ), 7.57-7.61, 8.59-8.62 (m, 5H, С₆Н₅), 8.20 (d, 1H, H-8, ³j_HF=10.4 Гц), 8.61 (d, 1H, H-5, ⁴J_HF= 7.5 Гц).

Пример 6.

3-Фенил-6,7-диэтокси-1,2,4-бензотриазин (SK-281).

Получен аналогично из 3-фенил-6-этокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазина и этилового спирта. Выход 85%. Т. пл. 195-196°С. Найдено, %: С 69.17, Н 5.74, N 14.33. С₁₇Н₁₇N ₃О₂. Вычислено, %: С 69.15, Н 5.76, N 14.24. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆, , ppm: 1.54 (m, 6Н, ), 4.08 (q, 4Н, ), 7.52-7.57, 8.57-8.59 (M, 5Н, С₆Н₅), 7.30 (s, 1Н,), 7.67 (s, 1H, H-5).

Пример 7.

3-Фенил-6-этокси-7-метокси-1,2,4-бензотриазин (SK-282).

Получен аналогично из 3-фенил-6-этокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазина и метилового спирта. Выход 70%. Т. пл. 184-185°С. Найдено, %: С 68.02, Н 5.29, N 14.88. С₁₆Н₁₅N ₃O₂. Вычислено, %: С 68.33, Н 5.34, N 14.95. ¹H ЯМР в DMSO-d₆, , ppm: 1.53 (t, 3Н, ), 4.08 (s, 3Н, СН₃О), 4.34 (q, 2H, ), 7.53-7.58, 8.57-8.59 (m, 5Н, С₆Н₃), 7.31 (s, 1H, Н-8), 7.72 (s, 1H, H-5).

Пример 8.

3-Фенил-6,7-дифтор-1,2,4-бензотриазин (SK-300).

1-(3,4-дифторфенил)-3,5-дифенилформазан (2, R2=F) (10 ммоль) растворяли в 35 мл уксусной кислоты, охлаждали до 0°С и медленно добавили 10 мл серной кислоты. Реакционную массу нагревали 10 минут на кипящей водяной бане, наблюдали изменение окраски от фиолетовой до темно-коричневой. Реакционную массу охлаждали до 0°С и выливали в ледяную воду (50 мл). Выпавший осадок отфильтровывали, промывали ледяной водой, сушили и перекристаллизовывали из этанола или смеси этанол: хлороформ (2:1).

Выход 70%. Т. пл. 126°С. Найдено, %: С 64.18, Н 2.57, N 17.14. C ₁₃H₇F₂N₃. Вычислено, %: С 64.20, Н 2.88, N 17.28. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆ , , ppm: (J_HF): 7.59-7.64, 8.67-8.71 (m, 5Н, С₆ Н₃), [8.55 (dd, 1H), 8.70 (dd, 1H), H-8, H-5].

Пример 9.

3-Фенил-6-бутокси-7-этокси-1,2,4-бензотриазин (SK-301).

Получен аналогично из 3-фенил-6-бутокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазина и этилового спирта. Выход 75%. Т. пл. 138-139°С. Найдено, %: С 70.51, Н 6.48, N 12.94. C₁₉H₂₁N ₃O₂. Вычислено, %: С 70.59, Н 6.50, N 13.00. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆, , ppm: 0.98 (t, 3Н, ), 1.46 (t, 3Н, ), 1.51 (q, 2H, ), 1.82 (q, 2H, ), 4.33 (q, 4H, ), ), 7.59-7.64, 8.56-8.59 (m, 5Н, С₆Н₅), 7.41 (s, 1Н, Н-8), 7.75 (s, 1H, H-5).

Пример 10.

3-Фенил-6-(2-тетрагидрофурил)метокси -7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-302).

Получен аналогично из 1-[4-(2-тетрагидрофурил)метокси-3-фторфенил]-3,5-дифенилформазана. Выход 65%. Т. пл. 83-84°С. Найдено, %: С 66.29, Н 4.90, N 12.98. C₁₈H₁₆FN₃O₂ . Вычислено, %: С 66.46, Н 4.92, N 12.92. ¹Н ЯМР в DMSO-d₆, 5, ppm, (J_HP): [1.80-2.20 (m, 4H), 3.70-3.90 (m, 2H), 4.33-4.38 (m, 1H), тетрагидрофуран], 4.30 (q, 2H, ), 7.63-7.65, 8.60-8.63 (m, 5H, С₆Н₃), 7.64 (d, 1H, H-5, ⁴J_HP= 8.2 Гц), 8.24 (d, 1H, Н-8, ³J_HP=10.4 Гц).

Пример 11.

3-Фенил-6-(2,2,2-трифтор)этокси-7-фтор-1,2,4-бензотриазин (SK-303).

Получен аналогично из 1-(4-трифторэтокси-3-фторфенил)-3,5-дифенилформазана. Выход 30%. Т. пл. 150-151°С. Найдено, %: С 55.68, Н 2.69, N 13.07. С₁₅Н₉F₄N₃ О. Вычислено, %: С 55.73, Н 2.79, N 13.00. ¹Н ЯМР в DMSO-d⁶, 5, ppm, (J_HP): 5.26 (q, 2H, ), 7.64-7.67, 8.61-8.63 (m, 5H, С₆Н₃), 7.93 (d, 1H, Н-5, ⁴J_HP=8.3 Гц), 8.52 (d, 1H, Н-8, ³J_HP=10.6 Гц).

Пример 12. Исследование противовирусной активности заявляемых соединений

Для оценки противовирусной активности заявляемых соединений, полученных в соответствии с примерами 1-11, использовали следующую методику. Культуру клеток Vero или LLC MK-2 выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений и соответствующий вирус. После инкубирования в течение 3-5 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вирус не вносили (контроль токсичности соединений), в который вносили вирус без соединений (контроль вируса) и лунки, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространения от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный.

В качестве исследуемых вирусов использовали вирус натуральной оспы, штаммы variola major (летальность до 30-40%) различного географического происхождения India За (Индия), 6-58 (Пакистан), Congo-9 (Африка), и штамм Butler variola minor (летальность 1-2%). Из других, патогенных для человека штаммов, использовали вирус оспы коров (штамм Гришак) и вирус оспы обезьян (штамм Zair 599). Кроме того, использовали вирус осповакцины, штамм ЛИВП, используемый для вакцинации населения. Помимо ортопоксвирусов, патогенных для человека, для оценки противовирусной активности использовали вирус эктромелии (оспы мышей), штамм К-1.

Таблица 1
Противовирусная активность соединения СК-29 в отношении вируса натуральной оспы на культуре клеток Vero:
Штамм вируса	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл		Индекс селективности
India 3а	>300	3,28		>91
6-58	>300	4,76		>63
Congo-9	>300	1,36		>220
Butler	>300	2,90		>103
Таблица 2
Противовирусная активность соединения СК-29 в отношении вируса оспы коров на культуре клеток Vero:
Штамм вируса	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
Гришак	>300	2,23	>134

Таблица 3
Противовирусная активность соединения СК-29 в отношении вируса оспы обезьян на культуре клеток Vero:
Штамм вируса	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
Zaire 599	>300	3,23	>92
Таблица 4
Противовирусная активность соединения СК-29 в отношении вируса осповакцины на культуре клеток Vero:
Штамм вируса	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
ЛИВП	>300	0,50	>600
Таблица 5
Противовирусная активность соединения СК-29 в отношении вируса эктромелии на культуре клеток Vero:
Штамм вируса	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
К-1	>300	0,49	>600

Таблица 6
Противовирусная активность производных СК-29 в отношении вируса оспы обезьян на культуре клеток Vero
Соединение	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
СК-277	>100	0,50	>200
СК-278	>100	3,1	30
СК-279	>100	1,1	100
СК-280	>100	26,4	4
СК-281	>100	100	1
СК-282	>100	нет	0
СК-300	13,4	нет	0
СК-301	>100	нет	0
СК-302	5,02	0,48	10
СК-303	28,8	0,44	65

Таблица 7
Противовирусная активность производных СК-29 в отношении вируса осповакцины на культуре клеток Vero:
Соединение	Цитотоксическая активность, 50%, мкг/мл	Противовирусная активность, 50%, мкг/мл	Индекс селективности
СК-277	>100	0,39	250
СК-278	>100	11,35	8,8
СК-279	>100	1,74	57
СК-280	>100	22,48	4
СК-281	>100	25,60	4
СК-282	>100	нет	0
СК-300	13,93	нет	0
СК-301	>100	нет	0
СК-302	16,26	0,47	35
СК-303	3,5	0,41	8,5

Анализ таблиц 1-7 показывает, что заявляемые новые химические соединения на основе 1,2,4-бензотриазинов обладают противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Промышленная применимость

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии, лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях.