способ выделения мезенхимальных стволовых клеток

Формула изобретения

1. Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, включающий измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, очистку от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей фильтрацией полученной суспензии, отличающийся тем, что в качестве тканей человека используют жировую ткань, или децидуальную, или амниотическую оболочку плаценты, или хориальную строму плаценты, а фильтрацию проводят последовательно через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении ферментативной обработки жировой ткани, децидуальной или амниотической оболочек плаценты используют коллагеназу типа I, а при проведении ферментативной обработки хориальной стромы плаценты - коллагеназу типа IV.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к выделению мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, и может найти применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.

В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии, и наибольшую актуальность приобретают работы по выделению стволовых клеток из тканей человека.

В настоящее время выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма - гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимальные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, а также других зародышевых листков) и др.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение долгого времени in vitro и широким спектром дифференцировки. В связи с этим особое внимание уделяется способам изоляции МСК из тканей взрослого организма, однако универсального метода их получения до сих пор нет.

Впервые мезенхимальные стволовые клетки были получены из костного мозга по способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974. Vol. 2. P.83-92).

Недостатком данного метода является неоднородность получаемой популяции клеток, тем не менее адгезия МСК на пластике стала основой для последующих модифицированных способов выделения МСК.

Известен способ получения МСК, основанный на способности клеток прикрепляться к поверхности культуральной посуды и использовании определенных лотов бычьей эмбриональной сыворотки, в результате были изолированы клетки с большей адгезивной способностью, скоростью пролиферации и временем сохранения мультипотентности (Heynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M., Calplan A.I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow // Bone. 1995. Vol. 13. P.81-95).

Недостатком этого метода является длительность и трудоемкость анализа сыворотки в процессе поиска лота, подходящего для культивирования клеток, а также отсутствие воспроизводимости результатов.

Известен способ выделения МСК с помощью селекции на антитела к Stro-1, антигену с неизвестной функцией, временно экспрессирующемуся на поверхности МСК (Grontos S., Simmons P.J. The growth factors requirements of Stro-1 positive human stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro // Blood. 1995. Vol. 85. P.929-940).

Способ является очень трудоемким и требует длительного времени для предварительного выделения антител.

Известен способ выделения МСК, состоящий в получении мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте фиколла, селекции на антитела к поверхностному антигену CD105, экспрессирующемуся на поверхности МСК, и культивировании клеток, прикрепляющихся к пластику. Доля отобранных CD105 ⁺ клеток составила 2-3% от фракции моноядерных клеток. В результате была получена популяция клеток, обладающих морфологией и профилем экспрессии поверхностных антигенов, характерным для МСК, а также хондрогенным потенциалом (Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolation, characterization, and chondregenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells // J. Cell. Physiol. 2000. Vol. 185. P.98-106).

Способ приводит к выделению фракции клеток CD105⁺, обогащенной МСК, но это требует дополнительной стадии селекции с помощью антител, иммобилизованных на магнитных шариках, что ведет к потере части клеток и требует дополнительных затрат.

Известно, что количество МСК в организме, а также их способность к пролиферации и дифференцировке существенно снижается с возрастом (Rao M.S., Mattson M.P. Stem cell and aging: expanding the possibilities // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol. 122. P.713-734). В связи с этим разрабатываются методы выделения МСК с высокой пролиферативной активностью и дифференцировочным потенциалом, например, из фетальных тканей или провизорных органов.

Известен способ выделения МСК из фетальной крови плода. Для их изоляции выделяют фракцию мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте фиколла и культивируют в условиях, поддерживающих рост МСК. Полученные клетки обладают остеогенным и адипогенным потенциалом (Campagnoli С., Roberts I.A., Kumar S. et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver, and bone marrow // Blood. 2001. Vol. 98. P.2396-2402).

Недостатком метода получения МСК из данного источника является труднодоступность фетальных тканей, а также этические проблемы, связанные с их использованием. Кроме того, изолированные популяции клеток были неоднородными: 76% проб содержали остеокластоподобные клетки, экспрессирующие характерные антигены CD45, CD51/CD61, отрицательные по CD64 (маркер макрофагов), SH2 (маркер МСК), CD31 (маркер эндотелиальных клеток). Лишь 26% образцов состояли из МСК-подобных клеток, экспрессирующих SH2, SH3, SH4, МАВ1470, CD 13, CD29, CD49e, CD54, CD90, ASMA, отрицательных по CD31 и vWF (маркеры эндотелиальных клеток).

Известен способ выделения МСК из субэндотелиального слоя пуповинной вены (Romanov Y.A., Svinitskaya V.A., Smimov V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord // Stem Cells. 2003. Vol. 21. P.105-110). Для этого пуповинная вена была обработана изнутри раствором коллагеназы IV в течение короткого периода времени (15 минут), а полученные клетки культивировали в среде DMEM-LG, дополненной 10% FBS. В результате была получена популяция клеток с фибробластоподобной морфологией, которые экспрессировали набор антигенов, сходный с МСК: ICAM1^+/-, VCAM1⁺, CD34^- ; MуSM^- (smooth muscle myosine); CD31^-, vWF^- (маркеры эндотелиальных клеток); CD14^- , CD45^-, CD68^- (маркеры моноцитов/макрофагов), но экспрессировали гладкомышечный актин ASMA. Полученная популяция клеток обладала остеогенным и адипогенным потенциалом in vitro.

Недостатком данного метода является гетерогенность полученной популяции клеток: в первичной культуре присутствовали эндотелиальные и гладкомышечные клетки, причем эндотелиальные клетки не размножались при данных условиях, а примесь миоцитов сохранялась при культивировании.

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения МСК из липоаспирата человека, состоящий в том, что измельченную жировую ткань подвергают действию коллагеназы типа I, а после нейтрализации коллагеназы и промывки клеточной суспензии очищают с помощью фильтров с размером пор 100 мкм для удаления клеточных остатков. В результате получали популяцию МСК, обладавшую характерной морфологией, иммунофенотипом, а также способностью к дифференцировке в костную, хрящевую, жировую, мышечную и нервную ткани (Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.D., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraiser J.K., Benhaim P. and Hedrick M.H. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells // Molecular Biology of the Cell. 2002. Vol. 13. P.4279-4295).

Недостатками данного способа являются неоднородность получаемой клеточной суспензии и невысокий выход.

Изобретение решает задачу выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека с высокой однородностью клеточной суспензии.

Для решения поставленной задачи в способе выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, включающем измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, очистку от эритроцитов с помощью лизирующего буфера с последующей фильтрацией полученной суспензии, в качестве тканей человека используют жировую ткань или плаценту, а фильтрацию проводят последовательно через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

При проведении ферментативной обработки жировой ткани, децидуальной или амниотической оболочек плаценты используют коллагеназу типа I, а при проведении ферментативной обработки хориальной стромы плаценты - коллагеназу типа IV.

Технический результат изобретения - повышение однородности клеточной суспензии, выхода целевого продукта и повышение жизнеспособности клеток достигается за счет условий фильтрации: определенного размера пор фильтров и определенного соотношения размеров пор используемых фильтров. Изменение этих параметров в сторону увеличения или уменьшения не может привести к указанному техническому результату, т.к. при этом резко снижается выход целевого продукта и/или однородность получаемой суспензии клеток. Выход клеток по сравнению с ближайшим способом-аналогом увеличивается в несколько раз. По данным заявителя, выход в известном способе составляет 10⁴ клеток на образец ткани массой 1 г, в то время как в заявленном способе выход клеток составляет от 1.5-3×10⁴ до 10 ⁷ клеток на 1 г образцов тканей различных типов. Повышение однородности клеточной суспензии подтверждена данными морфологического анализа и иммунофенотипирования. По данным заявителя, в известном способе в популяции МСК, полученной из липоаспирата, присутствует много морфологических типов клеток, и только на 4 пассаже культура становится гомогенной по форме и гранулярности клеток, а также по экспрессии поверхностных маркеров.

Способ осуществляют следующим образом:

Образец ткани предварительно промывают физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS, phosphate buffered saline) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg ²⁺, дополненным антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) и антимикотиком (амфотерицин В 0.25 мкг/мл). Обрабатываемую ткань измельчают, добавляют среду Игла в модификации Дюльбекко (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle Medium), содержащую антибиотики и антимикотик, указанные выше, при объемном соотношении ткани и среды от 1:5 до 1:10. В суспензию вводят раствор коллагеназы до конечной концентрации 0.075% для ферментативной обработки. Суспензию инкубируют при 37°С 30 минут при медленном покачивании.

Полученную смесь перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют эквивалентный объем среды DMEM, содержащей 10% по объему фетальной бычьей сыворотки (FBS, fetal bovine serum) с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 1000g. Осадок ресуспендируют в буфере, лизирующем эритроциты (155 мM NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0,1 мМ Na₂EDTA). Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре.

Суспензию разбавляют эквивалентным объемом среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Клеточный осадок промывают средой DMEM и снова осаждают центрифугированием в том же режиме. Клетки суспендируют в среде DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 г/л, дополненной 20% FBS, антибиотиками и антимикотиком. Полученную клеточную суспензию пропускают через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм и высевают из расчета 1 млн клеток на 1 см².

Выделенная популяция клеток характеризуется высокой однородностью МСК, причем изменение параметров фильтрации в сторону увеличения и/или уменьшения размеров пор приводит к снижению однородности целевого продукта или выхода клеток.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Децидуальную оболочку отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 2 г промывают трижды в PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащем однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), в котором конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0.25 мкг/мл.

Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики и антимикотик, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar).

В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 2% раствора коллагеназы типа I (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут в при 37°С на шейкере при медленном покачивании.

Смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мM NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃ , 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре.

Полученную суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco), объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 г/л (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков и антимикотика (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, Gibco).

Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore) для удаления клеточных остатков и дебриса.

Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁸/1 г ткани. Клетки высевают во флаконы площадью 75 см² из расчета 1 млн/1 см ². Доля прикрепившихся клеток составляет около 1%, т.о. выход МСК из децидуальной оболочки - примерно 10⁶/1 г ткани.

Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации.

По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 15-35 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 90 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для МСК человека.

Митотический индекс рассчитывают в фазе логарифмического роста как соотношение количества митозов к общему количеству клеток, его величина составляет 29.5%. Время цитогенерации 29 часов.

Полученные клетки имунофенотипируют окраской антителами к поверхностным антигенам CD10, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD117 (Becton Dickinson) с использованием непрямой флуоресценции, анализ проводят с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter). Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК: клетки положительны по CD13, CD44, CD90, CD105 и отрицательны по CD31, CD34, CD45, CD117. Экспрессия CD10 умеренно положительна (таблица 1).

Таблица 1 Экспрессия поверхностных антигенов на поверхности МСК из децидуальной оболочки плаценты
Иммунофенотип МСК децидуальной оболочки
CD	%
CD10	50,30
CD13	87,00
CD31	1,50
CD34	1,30
CD44	95,90
CD45	3,40
CD90	93,70
CD105	95,50
CD117	7,00

Пример 2

Хориальную строму отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 5 г промывают трижды PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg ²⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0.25 мкг/мл.

Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики и антимикотик, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar).

В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 2% раствора коллагеназы типа IV (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут в при 37°С на шейкере при медленном покачивании.

Полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мM NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃ , 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре.

Суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco), объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 мг/мл (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков и антимикотика (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, Gibco).

Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore) для удаления клеточных остатков и дебриса.

Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁹/1 г ткани. Клетки высевают во флаконы площадью 75 см² из расчета 1 млн/1 см ². Доля прикрепившихся клеток составляет около 1%, т.о. выход МСК из хориальной стромы - примерно 10⁷/1 г ткани.

Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации.

По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 20-40 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 100 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для МСК человека.

Митотический индекс рассчитывают в фазе логарифмического роста как соотношение количества митозов к общему количеству клеток, его величина составляет 31.8%. Время цитогенерации 28 часов.

Полученные клетки иммунофенотипируют окраской антителами к поверхностным антигенам CD10, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD117 (Becton Dickinson) с использованием непрямой флуоресценции, анализ проводят с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter). Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК: клетки положительны по CD13, CD44, CD90, CD 105 и отрицательны по CD31, CD34, CD45, CD117. Экспрессия CD10 умеренно положительна (таблица 2).

Таблица 2 Экспрессия поверхностных антигенов на поверхности МСК из хориальной стромы плаценты
Иммунофенотип МСК хориальной стромы
CD	%
CD10	84,40
CD13	90,90
CD31	0,20
CD34	0,30
CD44	97,60
CD45	1,50
CD90	95,30
CD105	92,70
CD117	3,90

Пример 3

Амниотическую оболочку отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 2 г промывают трижды в PBS (Gibco) при рН 7,2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ содержащим однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0.25 мкг/мл.

Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики и антимикотик, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar).

В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 1% раствора коллагеназы типа I (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут в при 37°С на шейкере при медленном покачивании.

Полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мM NH₄Cl, 10 мM КНСО₃ , 0.1 мM Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Полученную суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco) объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с содержанием глюкозы 1 г/л (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков и антимикотика (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, Gibco).

Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore). Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁸/1 г ткани. Клетки высевают во флаконы площадью 75 см² из расчета 1 млн/1 см ². Доля прикрепившихся клеток около 1%, т.о. выход МСК из амниотической оболочки - примерно 10⁶/1 г ткани.

Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации.

По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 10-30 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 80 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для МСК человека.

Митотический индекс рассчитывают в фазе логарифмического роста как соотношение количества митозов к общему количеству клеток, его величина составляет 31.6%. Время цитогенерации 25.7 часа.

Полученные клетки имунофенотипируют окраской антителами к поверхностным антигенам CD10, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD117 (Becton Dickinson) с использованием непрямой флуоресценции, анализ проводят с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter). Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК: клетки положительны по CD13, CD44, CD90, CD105 и отрицательны по CD31, CD34, CD45, CD117. Экспрессия CD10 умеренно положительна (таблица 3).

Таблица 3 Экспрессия поверхностных антигенов на поверхности МСК из амниотической оболочки плаценты
Иммунофенотип МСК амниотической оболочки
CD	%
CD10	58,70
CD13	93,20
CD31	1,70
CD34	1,40
CD44	98,30
CD45	0,00
CD90	92,60
CD 105	96,90
CD117	1,70

Пример 4.

Образец жировой ткани массой 10 г трижды промывают PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0.25 мкг/мл, и удаляют примеси плотной соединительной ткани.

Далее проводят механическую фрагментацию ткани медицинскими ножницами в культуральных чашках диаметром 10 см (Costar) до получения мелкодисперсной массы, которую переносят в две пробирки объемом 50 мл с коническим дном (Costar) и суспендируют каждый образец в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик.

Далее проводят стадию обработки ферментом: в полученные суспензии вводят по 1 мл 2% раствора коллагеназы I типа (Gibco) в буферном растворе PBS без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, до конечной концентрации фермента 0.075%, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут при медленном покачивании.

Полученную смесь тщательно перемешивают, затем добавляют эквивалентный объем DMEM, содержащую 10% FBS и антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость и жировые капли удаляют, осадки объединяют и суспендируют в 10 мл холодного лизирующего буфера (+4°С), содержащего 155 мM NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре.

Далее в клеточную суспензию добавляют 10 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g.

Надосадочную жидкость удаляют и проводят стадию промывания. Клеточный осадок ресуспендируют в 30 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в режиме 1000 g в течение 10 минут.

Полученный осадок ресуспендируют в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик.

Полученную клеточную суспензию пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм и центрифугируют в течение 10 минут при 300 g. Осадок ресуспендируют в среде DMEM, дополненной антибиотиками и антимикотиком, 10% FBS и однократным раствором заменимых аминокислот (Non-Essential Amino Acids, Gibco) в объеме 25 мл. Суспензию пропускают через фильтр с размером пор 10 мкм.

Таким образом, получают гомогенную фракцию клеток, свободную от клеточного дебриса и клеток крови.

Полученную клеточную суспензию оценивают подсчетом в камере Горяева и высевают во флаконы площадью 75 см² из расчета 10⁶ клеток/см². Доля прикрепившихся клеток составляет приблизительно 1-1,5%. Таким образом, количество мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из 1 г жировой ткани, составляет около 1,5-3×10⁴ клеток.

По истечении 24 часов проводят смену среды на DMEM, содержащей антибиотики (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco), 10% FBS и однократный раствор заменимых аминокислот (Nоn - Essential Amino Acids, Gibco).

По достижении монослоя клетки субкультивируют, проводят визуальную оценку морфологии клеток посредством методом фазово-контрастного микроскопирования, оценивают митотический индекс и время цитогенерации.

По результатам морфологического анализа в полученной после выделения фракции клеток выявлено две субпопуляции. Первый тип клеток представляет собой субпопуляцию малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм, с четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй тип представлен клетками округлой формы с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы, размер клеток достигает 40 мкм; отмечается темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области.

В фазе логарифмического роста клеток подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. Соотношение количества митотических клеток к общему количеству клеток составляет 34%. Время удвоения 54-62 час.

Полученные клетки иммунофенотипируют методом непрямой иммунофлуоресценции. Посредством проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter) выявлен высокий уровень экспрессии следующих антигенов CD10, (CALLA), CD 13 (APN), CD44 (hyaluronic acid receptor), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin) (Becton Dickinson). Также показано отсутствие экспрессии маркеров гематопоэтических клеток CD34, CD45 и CD117 (Becton Dickinson) (таблица 4). Результаты иммунофенотипирования показывают, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимальным стволовым клеткам.

Таблица 4 Экспрессия поверхностных антигенов на поверхности МСК из жировой ткани
Иммунофенотип МСК из жировой ткани
CD	%
CD10	68,08
CD13	96,53
CD34	4,38
CD44	93,08
CD45	3,28
CD90	98,36
СD105	90,18
CD117	2,30