способ получения искусственной матрицы кожи

Формула изобретения

Способ получения искусственной матрицы кожи, включающий смешивание коллагена и хитозана с добавлением поверхностно-активного вещества и сшивающего агента, розлив полученной смеси, ее замораживание, сублимационную сушку и гамма-стерилизацию, отличающийся тем, что перед получением полиэлектролитного комплекса коллагена и хитозана в хитозан вводят последовательно водные растворы 1,8 г/г сухого хитозана аскорбиновой кислоты, 5-100 мг/г сухого хитозана хондроитинсерной кислоты, 10-100 мг/г сухого хитозана гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты, 11-220 мкг/г сухого хитозана сывороточного фактора роста крупного рогатого скота и 2,5-5 мг/г сухого хитозана гепарина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической хирургии, комбустиологии, трансплантологии, косметологии, и может быть использовано для восстановления полнослойных кожных дефектов различной площади в качестве искусственной матрицы дермально-эпидермального эквивалента кожи.

Известен способ получения композиций для приготовления раневых покрытий на основе альгината натрия (Чумаков А.А., Комнова З.Д. // Журнал “Стоматология”. - 1984. - №4, С.28; Чумаков А.А., Дмитриева Л.А., Комнова З.Д. и др. // Журнал “Стоматология”. - 1985. - №5, С.6-9) с включенными в них различньми антисептическими, анестезирующими, противомикробными, стимулирующими препаратами, композиций для получения биоматериала, состоящего из N-ацилхитозана и коллагена (US 5116824 от 26.05.1992 г., кл. А 61 К 31/70; A 61 L 15/22 M). Известные раневые покрытия обладают ранозаживляющим эффектом при комбинации их с антисептическими препаратами, например, фурагином, диоксидином, хлоргексидином или анестетиками, например, анилокаином, тримеклином или шиконином. Эти известные раневые покрытия относятся к медицинским материалам на основе природных полисахаридов, содержащих интерполимерный полиэлектролитный комплекс катионного или амфотерного линейного полисахарида с анионным линейным полисахаридом, химически сшитый полифункциональными альдегидами или эпоксисоединениями, который обладает гемостатическим и репаративньм действием. Медицинский материал может быть композицией для создания различных типов перевязочных средств (повязок, раневых покрытий, перевязочных пакетов, тампонов) в форме гелей, пленок, губок, коллоидных растворов, которые дополнительно могут содержать составы для лечения ран, ожогов, лекарственные средства, дерматологические композиции, растительные экстракты, а также служить основой для косметических масок и накладок для компрессов. Однако использование раневых покрытий в таких составах не создает условий, для полноценного восстановления плоскостных раневых дефектов кожи, в частности не образует в сроки эпителизации раневых дефектов полноценного подкожного соединительнотканного комплекса, не формирует микрососудистый комплекс в коже в полном объеме, не создает достаточного объема, числа и строгой ориентации коллагеновых и ретикулярных волокон соединительной ткани в сосочковом и сетчатом слоях кожи.

Наиболее близким к предложенному является раневое покрытие “Коллахит” (патент РФ №2108114; А 61 L 15/28 от 10.04.98, Бюл. №10). Способ его получения заключается в смешивании анионного белка коллагена с линейным катионным полисахаридом хитозаном с последующим добавлением поверхностно-активного вещества - твина 80 и сшивающего агента - глутарового альдегида, розливом полиэлектролитной смеси в контейнеры, глубоким замораживанием в условиях вакуума, лиофильным высушиванием, гамма-стерилизацией полученного продукта - губки.

Однако использование продукта в таком составе не создает условия для полноценного восстановления плоскостных раневых дефектов кожи, в частности не образует в сроки эпителизации раневых дефектов сосочкового слоя кожи, достаточного объема, числа и строгой ориентации коллагеновых и ретикулярных волокон соединительной ткани в сосочковом и сетчатом слоях кожи, не позволяет усилить пролиферативную активность клеток фибропластического ряда, сформировать многослойный плоский эпителий, близкий по строению к нормальной коже. Отличительные особенности заявляемого изделия от “Коллахита” состоят в том, что при приготовлении “Коллахита” используют хитозан, растворимый в уксусной кислоте, а при приготовлении искусственной матрицы кожи - хитозан, растворимый в аскорбиновой кислоте, что позволяет значительно улучшить регенерационные возможности получаемого материала, усилить пролиферативную активность клеток фибропластического ряда. Заявляемое техническое решение в отличие от “Коллахита” наиболее приближено по составу к естественной коже и является ее искусственным заменителем (добавлен сывороточный фактор роста, компоненты соединительной ткани - гиалуроновая (глюкуроновая) кислота, хондроитинсульфат, гепарин). Биологическая совместимость продукта выше, чем у Коллахита. Добавленные сывороточный фактор роста и гепарин обеспечивают более эффективное заживление раны благодаря дополнительному усилению пролиферативной активности клеток фибропластического ряда и, как следствие этого, формируется многослойный плоский эпителий, близкий по строению к нормальной коже. Раневое покрытие идеально подходит для культивирования клеток.

Цель изобретения - получение структуры, приближенной к коже, идеально замещающей кожный дефект.

Цель достигают за счет того, что перед получением полиэлектролитного комплекса коллагена и хитозана в хитозан вводят последовательно водные растворы 1,8 г/г сухого хитозана аскорбиновой кислоты, 5-100 мг/г сухого хитозана хондроитинсерной кислоты, 10-100 мг/г сухого хитозана гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты, 11-220 мкг/г сухого хитозана сывороточного фактора роста крупного рогатого скота и 2,5-5 мг/г сухого хитозана гепарина.

Способ осуществляют следующим образом: перед образованием интерполимерного полиэлектролитного комплекса (изделие медицинского назначения “Коллахит”) (ТУ 9393-003-26252986-00) предварительно и последовательно в хитозан вводят водные растворы аскорбиновой кислоты (ФС 42-2668-95) (1,8 г/г сухого хитозана), хондроитинсерной кислоты (5-100 мг/г сухого хитозана), гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты (10-100 мг/г сухого хитозана), сывороточного фактора роста крупного рогатого скота (гликопротеид с ММ около 20000 Да, сахаридная часть - 25%, белковая часть - класс S-белков) (11-220 мкг/г сухого хитозана) и гепарина (2,5-5 мг/г сухого хитозана), добавляют к смеси коллагена и модифицированного таким образом хитозана дистиллированную воду, поверхностно-активное вещество - твин 80, сшивающий агент - глутаровый альдегид, смесь замораживают, лиофилизируют в вакууме (губка), производят гамма-стерилизацию, продукт наносят на раневую поверхность.

Все расчеты по загрузке компонентов композиционных смесей проводят так, чтобы конечная массовая доля коллагена и хитозана в композиционной смеси составляла 0,65%.

Приготовление раствора аскорбиновой кислоты

В реактор-смеситель, снабженный мешалкой и рубашкой, заливают 800 мл дистиллированной воды, при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 36 граммов сухой аскорбиновой кислоты. Массу перемешивают в течение 5 минут. Полученный раствор используют для приготовления раствора хитозана.

Приготовление 2% раствора аскорбата хитозана

В приготовленный раствор аскорбиновой кислоты при перемешивании и температуре плюс 20±5°С добавляют 20 граммов хитозана марки “М” с ММ от 10 кДа (ТУ 9289-001, 52741007-01,ТИ) до 1000 кДа (ТУ 9289-004-26252986-2000) со степенью дезацетилирования от 90% до 98%. Массу перемешивают в течение 4-5 часов до полного растворения хитозана. В полученный 2% раствор хитозана при постоянном интенсивном перемешивании с помощью быстроходной мешалки последовательно добавляют водные растворы хондроитинсерной кислоты (5-100 мг/г сухого хитозана), гиалуроновой кислоты (10-100 мг/г сухого хитозана), сывороточного фактора роста крупного рогатого скота (11-220 мкг/г сухого хитозана) и гепарина (2,5-5 мг/г сухого хитозана). Введение каждого последующего ингредиента осуществляют только после гомогенного смешивания предыдущего.

Приготовление водного раствора хондроитинсерной кислоты

К 50 мл дистиллированной воды добавляют 100-2000 мг хондроитинсерной кислоты, перемешивают в течение 5 минут до полного растворения.

Приготовление водного раствора гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты

К 50 мл дистиллированной воды добавляют 200-2000 мг гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты, перемешивают в течение 5 минут до полного растворения.

Приготовление водного раствора сывороточного фактора роста

К 50 мл дистиллированной воды добавляют 220-4400 мкг сывороточного фактора роста крупного рогатого скота в растворе, перемешивают в течение 5 минут до полного растворения.

Приготовление водного раствора гепарина

К 50 мл дистиллированной воды добавляют 50-100 мг гепарина в растворе, перемешивают в течение 5 минут до полного растворения.

Приготовление водного раствора глутарового альдегида и твина-80

В реактор-смеситель, снабженный мешалкой и рубашкой, заливают 730 мл дистиллированной воды, при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 5,8 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и 0,224 г (8 капель) твина-80. Массу перемешивают в течение 5-10 минут. Полученный раствор идет на приготовление композиционной смеси заданного состава.

Приготовление интерполимерной полиэлектролитной композиционной смеси

В реактор-смеситель, снабженный мешалкой, рубашкой и мерником, заливают 2,46 кг (2,65 литра) 2%-ного раствора бычьего коллагена (ФСП 42-0282-1221-01). Далее при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 265 мл 2%-ного раствора аскорбата хитозана с введенными в него компонентами: хондроитинсерной кислотой, гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислотой, сывороточным фактором роста и гепарином, водный раствор глутарового альдегида и твина 80.

Розлив композиционной смеси на противни

Противни предварительно протирают спиртом из расчета 40-50 мл/противень. Затем композиционную смесь разливают мерным стаканом на противни так, чтобы толщина слоя смеси составляла 4±1 мм. Разлитую на противни композиционную смесь можно хранить до замораживания не более 1 часа. В противни с композиционной смесью при необходимости устанавливают делительные решетки.

Замораживание композиционной смеси

Противни с композиционной смесью устанавливают в холодильную камеру для заморозки (КТК-800, НС 700 или в сублимационную установку - TG-15) при температуре плит плюс 20±5°С. Смесь замораживают до температуры минус 40±3°С. Время замораживания 2-3 часа.

Сублимационная сумка

По окончании процесса замораживания продукт перегружают в сублимационную установку для установок LZ, затем камеру вакуумируют до остаточного давления 133 Па (1 мм рт. ст.), после чего начинают процесс сушки продукта за счет подвода тепла от теплоносителя к замороженному продукту через поверхность греющих плит.

Процесс сублимации осуществляют при остаточном давлении от 44,3 до 133 Па (от 0,33 до 1 мм рт. ст.) и температуре теплоносителя 45±5°С. Температура продукта не должна превышать плюс 50°С. Полный цикл сушки продукта составляет 8±2 часа. По окончании процесса сублимационной сушки проводят девакуумирование установки.

Экспериментальное применение. На белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносились в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм ² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны последняя закрывалась искусственной матрицей кожи. Контроль репарации кожи осуществлялся после полной эпителизации дефекта с помощью анализа парафиновых срезов рубцовой зоны, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон в модификации Н.М. Dodds (коллагеновые волокна и фибробласты), резорцином и фуксином по Вейгерту с тонированием световым зеленым по А.П.Сорокину (эластические волокна), импрегнацией азотнокислым серебром по Карупу (ретикулярные волокна).

Результаты исследования показали, что в зоне рубца при использовании искусственной матрицы кожи полностью восстанавливается объем кровеносных сосудов. Хорошая васкуляризация рубцовой ткани способствует более раннему закрытию раневого дефекта с образованием зрелой соединительной ткани, близкой к строению нормальной кожи, полноценного многослойного плоского эпителия. В коже животных отмечается образование сосочкового слоя в зоне рубца с наличием зрелых ретикулярных и коллагеновых волокон и отсутствием воспалительной реакции. Сетчатый слой рассматриваемой зоны толщиной, соответствующей нормальному строению аналогичного участка кожи, имеет достаточный объем ретикулярных и коллагеновых волокон, причем количество последних соответствует интактной коже. Клеточно-воспалительная реакция в группе крыс при использовании искусственной матрицы кожи, не выражена. При этом во всех слоях отмечается более плотная укладка волокнистых элементов, а ход волокон строго ориентирован поперечно оси тела и перпендикулярно друг другу.

Пример. На 10 белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносились в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны последняя закрывалась искусственной матрицей кожи в виде губки. Контрольная группа животных (10 крыс) получала на раневую поверхность изделие медицинского назначения ИМН “Коллахит”. Контроль рубцового участка кожи осуществлялся на 26-е сутки с помощью анализа парафиновых срезов. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таким образом, на 26-е сутки заживления раневого дефекта формирование качественной соединительной ткани, близкой к нормальной здоровой за счет правильной архитектоники волокнистых структур и межуточного матрикса, происходит за счет создания для клеток фибропластического и эпителиального ряда благоприятных условий жизнедеятельности на коллаген-хитозановой подложке, содержащей аскорбиновую, хондроитинсерную и гиалуроновую (глюкуроновую) кислоты, сывороточный фактор роста крупного рогатого скота, гепарин. Применение такой искусственной матрицы кожи приводит к образованию сосочкового слоя на 26-е сутки заживления (Фото 1. На фотографии видна зона рубца кожи крысы на 26 сутки послеоперационного периода при применении искусственной матрицы кожи. Увел. 10×15. Окр. гематоксилином и эозином. Видно множество новообразованных кровеносных сосудов, сформированный сосочковый слой кожи) в отличие от использования ИМН “Коллахит” (Фото 2. На фотографии видна зона рубца на 26 сутки послеоперационного периода при применении раневого покрытия “Коллахит”. Увел. 10×15. Окр. гематоксилином и эозином. Частичное восстановление сосудов, массивная плазмоклеточная воспалительная инфильтрация, отсутствие сосочкового слоя кожи). Полное восстановление кровеносных сосудов в зоне рубца (Фото 1) в отличие от частичного в контроле (Фото 2) приводит к раннему созреванию молодой грануляционной ткани, образованию ее объема, равного интактной коже, строго ориентированных коллагеновых (Фото 3. На фотографии показаны строго ориентированные коллагеновые волокна зоны рубца кожи крысы на 26 сутки послеоперационного периода при применении искусственной матрицы кожи. Увел. 10×15. Окр. пикрофуксином и гематоксилином по Ван-Гизону; образование полного объема грануляционной ткани) и ретикулярных волокон (Фото 4. На фотографии изображены ориентированные ретикулярные волокна зоны рубца кожи крысы на 26 сутки послеоперационного периода при применении искусственной матрицы кожи. Увел. 10×15. Окр. азотнокислым серебром по Карупу; образование полного объема волокон), как в сосочковом, так и в сетчатом слоях дермы в отличие от контроля (Фото 5. На фотографии изображены коллагеновые волокна зоны рубца кожи крысы на 26 сутки послеоперационного периода при применении раневого покрытия “Коллахит”. Увел. 10×15. Окр. пикрофуксином и гематоксилином по Ван-Гизону; неполный объем восстановления без строгой ориентации волокон) и (Фото 6. На фотографии изображены ретикулярные волокна зоны рубца кожи крыс на 26 сутки послеоперационного периода при применении раневого покрытия “Коллахит”. Увел. 10×15. Окр. азотнокислым серебром по Карупу; неполный объем восстановления без строгой ориентации волокон).