способ получения бактериального ферментного препарата пектин-лиазы

Формула изобретения

Способ получения бактериального ферментного препарата пектин-лиазы, включающий в себя последовательное проведение глубинного культивирования Bacillus circulans, стандартизацию культуральной жидкости или ее фильтратов хлоридом кальция в количестве 0,1% и хлоридом натрия в количестве 5-15% и их сушку, отличающийся тем, что при культивировании используют питательную среду, где в качестве углеводного компонента применяют крахмалосодержащее сырье в количестве 2,75-4,0% и значение водородного показателя объекта обезвоживания устанавливают на уровне 6,0-7,8 единиц рН.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам производства бактериальных ферментов мацерирующего действия.

К таким ферментам относится пектин-лиаза, получаемая в процессе глубинного культивирования Bacillus circulans. Из культуральной жидкости (далее по тексту - к.ж.) в дальнейшем получают технический ферментный препарат Мацеробациллин ГЗх-СХ по ТУ 9291-037-34588571-2001.

Данный препарат предназначен для использования в составе мультиэнзимных композиций для обработки комбикормовой продукции преимущественно пшеничной основы с введением зерна овса, проса, пшеничных отрубей, а также в других отраслях, где необходима мацерация растительных материалов.

Исходной стадией получения Мацеробациллина Г3х-СХ является глубинное культивирование бактерий Bacillus circulans в ферментационных аппаратах. Полученную к.ж. фильтруют и стандартизованный солями фильтрат обезвоживают на распылительной сушилке типа СРЦ.

Результативность получения товарного препарата пектин-лиазы во многом зависит от состава питательной среды, условий культивирования и последующей сушки подготовленной к.ж. Способы глубинного культивирования бактериальных продуцентов Bacillus circulans и составы питательных сред хорошо изучены на лабораторном и полупромышленном уровнях.

Так, в работе "Способ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего действия", Г.Б.Бравова, В.И.Дуда и др., Авторское свидетельство СССР №817052, кл. С 12 N 9/06, от 15.10.79 г., выращивание культуры Bacillus circulans 31 проводят в ферментере вместимостью 250 дм³ при температуре от 37 до 42°С в течение от 20 до 24 ч на питательной среде со значением водородного показателя от 8,0 до 8,4 единиц рН состава, %:

свекловичный жом 2,0

мел 0,5

гидрофосфат аммония 0,75

дигидрофосфат калия 0,1

кукурузный экстракт 0,5

Полученную к.ж. с содержанием пектин-лиазы до 2,0 ед/см³ подают на фильтрацию для отделения биомассы и нерастворимых остатков питательной среды, фильтрат концентрируют при температуре 30 °С на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ (далее по тексту - СВ) 11.5%. К концентрату добавляют 0,1% хлорида кальция и 11,5% хлорида натрия и высушивают на распылительной сушилке.

В работе Г.Б.Бравовой, Т.Е.Смирновой и др. "Питательная среда для культивирования продуцента мацерирующих ферментов Bacillus circulans-31", Авторское свидетельство СССР №1116058, кл. С 12 N 1/20, 30.09.1984, авторы используют для культивирования Bacillus circulans-31 питательную среду следующего состава, %:

свекловичный жом 1-4

гидроокись калия 0,1-0,3

сернокислый калий 0,1-0,4

углекислый кальций 0,02-0,3

мочевина 0,2-0,8

кукурузный экстракт 0,2-1,5

сернокислый марганец 0,02-0,12

оксигенальное комплексное

соединение кобальта (II) с

углеродсодержащим лигандом

(по металлу) 0,0003-0,0042

При этом достигается накопление пектин-лиаз до 890 ед/см³.

Данный метод получения пектин-лиазных ферментов принимаем за прототип.

Целью изобретения является увеличение выхода ферментного препарата пектин-лиазы путем применения более продуктивной и технологичной питательной среды, в которой углеводные компоненты не образуют заторов и хорошо подвергаются термической стерилизации, и которая, в сочетании с найденным режимом подготовки объекта к обезвоживанию (по значению водородного показателя), обеспечивает резкое снижение термических потерь на стадии распылительной сушки. Поставленная цель достигается тем, что предлагается способ получения пектин-лиазы с использованием ферментационной среды, где в качестве источника углеводов используют муку кукурузную или смесь муки кукурузной и отрубей пшеничных, или крахмал кукурузный (картофельный), гидролизованные до доступных сахаров амилазой бактериальной, что при ферментации резко повышает выход пектин-лиазы до 34100 ед/см³, также резко повышает термическую устойчивость фермента при обезвоживании.

Одновременное изменение режима подготовки к.ж. или фильтрата из нее по значению водородного показателя путем введения растворов кислот (соляной, фосфорной) до 6,0-7,8 единиц рН позволяет дополнительно повысить термоустойчивость пектин-лиазы до 12,2%.

Сущность изобретения заключается в использовании вместо продуктов щелочной деградации пектина свекловичного жома в составе питательной среды крахмалосодержащего сырья - мука кукурузная (от 2,75 до 3,0%) или крахмал кукурузный (картофельный) (2,75%), или смесь муки кукурузной (до 3%) с отрубями пшеничными (до 4%) - и изменении значения водородного показателя стандартизованных солями фильтрата или к.ж. перед обезвоживанием.

Кукурузную муку с содержанием крахмала 65-70%, отруби пшеничные с содержанием крахмала 50-55%,кукурузный или картофельный крахмал, идущие на приготовление питательных сред, обрабатывают амилазой бактериальной при определенных условиях. Используют препарат амилосубтилин с активностью 1000 ед/г из расчета 2-3 ед на 1 г крахмала. Сырье вносят в нагретую до температуры 40-45°С воду, добавляют 2/3 расчетного количества амилосубтилина. Кислотность среды поддерживают на уровне 6,5-6,7 едким натром. Суспензию нагревают до 80-85°С и выдерживают при этой температуре 30 минут. Затем ведут нагрев до кипения и выдерживают в течение часа, после чего охлаждают до 70-75°С, добавляют оставшуюся часть амилосубтилина. Гидролиз крахмала ведут в течение 2 часов до образования продуктов неокрашивающихся йодом. При этом уровень свободных сахаров, замеренных по Бертрану, увеличивается в 10-15 раз. Белки, входящие в состав крахмалосодержащего сырья в этом процессе гидролизу не подвергается, содержание аминного азота остается без изменения. Гидролиз клейстеризованного крахмала до декстринов ведется для снижения вязкости питательной среды.

Указанные составы питательных сред обеспечивают в оптимальных регламентных условиях культивирования получение к.ж. с содержанием пектин-лиазы до 34100 ед/см³. В полученную к.ж. или фильтраты из нее после фильтрования добавляют 0,1% хлорида кальция и хлорида натрия до значения 10-15% по СВ, доводят значение водородного показателя от 6,0 до 7,8 единиц рН растворами соляной или фосфорной кислот. Все это приводит к снижению термических потерь до 3%, получению концентрата с активностью фермента до 329000 ед/г и достижению общего выхода в готовом препарате до 89,3%.

В качестве примеров рассмотрим процессы получения препарата Мацеробациллин Г3х-СХ с применением бактериального продуцента Bacillus circulans ВКМП-В-5622.

Пример 1

Получение пектин-лиазы с применением культуры Bacillus circulans ВКМП-В-5622 проводят в ферментере вместимостью 500 дм³ при объеме питательной среды 250 дм³, имеющей следующий состав, %: мука кукурузная 3,0; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,1. Кукурузную муку предварительно гидролизуют амилазой бактериальной при соотношении муки и водопроводной воды 7,5:140. Полученный гидролизат подщелачивают концентрированным раствором едкого натра до значения водородного показателя 7,5 единиц рН, вводят пеногаситель и стерилизуют. После охлаждения до температуры 60°С в эту порцию среды стерильно вносят вторую порцию среды, состоящую из кукурузного экстракта, мочевины, калия сернокислого, мела и части пеногасителя. Затем среду охлаждают до температуры 42°С, значение водородного показателя начальной среды 8,4 единиц рН. Среду засевают споровым посевным материалом. Культивирование первые 2 ч проводят без подачи воздуха; в фазе ускорения роста аэрацию проводят 0,6 объемами воздуха на объем к.ж./мин при температуре 40°С; в экспоненциальной и стационарной фазах роста осуществляют аэрацию 1,0 объемом воздуха на объем к.ж./мин при температуре 39°С. В течение всего процесса ферментации проводят перемешивание к.ж. Избыточное давление в течение всего культивирования составляет (0,4-0,5) кгс/см ². Время роста 18,0 ч.

В результате через 18 ч получают культуральную жидкость с содержанием пектин-лиазы 34100 ед/см ³, СВ 3,0% и значением водородного показателя 8,6 единиц рН. К.ж. фильтруют через металлическую сетку с размером ячеек 1 мм для удаления твердых частиц. В полученный фильтрат с содержанием СВ 2,8% вносят по 0,1% хлорида кальция и до 10% хлорида натрия. Значения водородного показателя в образцах стандартизованного фильтрата устанавливают концентрированным раствором соляной кислоты на уровне от 6,0 до 8,6 (исходный) единиц рН. Подготовленные фильтраты высушивают на распылительной сушилке "Ангидро" в режиме: температура сушильного агента на входе в сушильную камеру (135±3)°С, температура отходящего воздуха из камеры (65±3)°С. В результате сушки получают образцы концентратов, свойства которых отражены в таблице 1.

Таблица 1
Свойства концентратов из к.ж., полученной на кукурузной муке
№ образца	Свойства исходного фильтрата		Свойства концентрата		Термические потери при сушке %
	рН	ПлА, ед/см3	ПлА, ед/г	СВ, %
1	8,6	33600	264000	98,2	14,9
2	7,8	33800	286000	98,0	6,3
3	7,2	32900	320000	98,3	3,8
4	6,8	32700	311000	98,2	2,7
5	6,5	31500	329000	97,9	4,6
6	6,0	30800	275000	98,1	8,7

Полученные данные свидетельствуют в целом о резком снижении термических потерь пектин-лиазы при обезвоживании подготовленных фильтратов, полученных на среде с использованием кукурузной муки, при исходных значениях водородного показателя к.ж. составляют 14,9%.

Обезвоживание фильтратов из к.ж., полученной на кукурузной муке, в более узком интервале значений водородного показателя от 6,0 до 7,8 единиц рН позволяет дополнительно снизить термические потери пектин-лиазы до уровня от 2,7 до 8,7%.

Общий выход процесса для образцов 1-6 составлял от исходного в к.ж. от 73,6 до 78,4%.

Пример 2

Культивирование бактерий Bacillus circulans ВКМП-В-5622 осуществляют в ферментерах вместимостью 16 дм³ при объеме питательной среды 8 дм³, имеющей следующий состав, %: крахмал кукурузный или картофельный 2,75; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,1. Крахмал предварительно гидролизуют амилазой бактериальной. Полученный гидролизат подщелачивают концентрированным раствором едкого натра до значения водородного показателя 7,4 единиц рН, вводят пеногаситель и стерилизуют. После охлаждения до температуры 55°С в эту порцию среды вносят вторую порцию среды, состоящую из кукурузного экстракта, мочевины, калия сернокислого, мела и части пеногасителя. После охлаждения до температуры 43°С среду засевают споровым материалом и режим ферментации осуществляют, как описано в примере 1.

В результате через 17,5 ч процесса получают партии к.ж. с содержанием пектин-лиазы 32050 ед/см³ (на кукурузном крахмале) и 33900 ед/см³ (на картофельном крахмале). Значение водородного показателя в образцах к.ж. составляет соответственно 8,0 и 8,1 единиц рН. Объекты отфильтровывают под вакуумом и в полученные фильтраты вносят по 0,1% хлорида кальция и 9% хлорида натрия. Значение водородного показателя в стандартизованных фильтратах устанавливают концентрированным раствором фосфорной кислоты на уровне 6,8 и 6,9 единиц рН соответственно. Подготовленные фильтраты высушивают на распылительной сушилке в режиме: температура сушильного агента на входе в сушильную камеру (135±5)°С; температура отходящего воздуха (65±5)°С. В результате обезвоживания получают концентраты светло-серого цвета со свойствами:

- из к.ж. на кукурузном крахмале - ПлА 302000 ед/г, СВ 98,3%, термические потери 5,4%;

- из к.ж. на картофельном крахмале - ПлА 314000 ед/г, СВ 98,0%, термические потери 4,7%.

Общий выход препарата по пектин-лиазе от исходного в к.ж. составляет соответственно 76,3 и 77,2%.

Пример 3

Выращивание культуры Bacillus circulans ВКМП-В-5622 проводят в серии испытаний в ферментерах вместимостью 16 дм³ при объеме среды 9 дм³, имеющей следующие составы, %: мука кукурузная до 3,0; отруби пшеничные до 4,0; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,05. Смесь муки и отрубей предварительно и готовят питательную среду, как описано в примере №1. Затем стерильную среду охлаждают до температуры 41°С и засевают споровым посевным материалом. Режим ферментации осуществляют, как описано в примере №1. В результате через 17-19 ч получают партии к.ж. с содержанием пектин-лиазы от 25800 до 31600 ед/см³ и значением водородного показателя от 8,6 до 8,9 единиц рН. Образцы к.ж. отфильтровывают под вакуумом и в полученные фильтраты вносят по 0,1% хлорида кальция и 8% хлорида натрия. Значение водородного показателя устанавливают концентрированным раствором фосфорной кислоты на уровне от 7,0 до 7,3 единиц рН. Подготовленные фильтраты сушат, как описано в примере №1. В результате обезвоживания получают образцы концентратов светло-серого цвета без явной тенденции к слеживанию, свойства которых представлены в таблице 2.

Таблица 2
Свойства партий к.ж., полученной на смеси кукурузной муки и отрубей, и свойства обезвоженных концентратов
Дозировка углеводного компонента от массы среды, %		Свойства стандартизованного фильтрата		Свойства концентрата		Термические потери от исходного в к.ж., %
мука	отруби	ПлА, ед/см 3	рН	ПлА, ед/г	СВ, %
0	4,0	25200	7,1	256000	98,7	7,9
1,0	2,0	28700	7,0	284000	97,6	5,6
1,5	1,5	29900	7,2	273000	98,9	6,4
2,0	1,0	30800	7,3	295000	98,3	4,8
3,0	1,0	31600	7,2	301000	98,0	4,1

Общий выход пектин-лиазы в обезвоженных концентратах составил от исходного в к.ж. от 74,6 до 79,8%.

Пример 4

Культивирование бактерий Bacillus circulans ВКМП-В-5622 осуществляют в ферментере вместимостью 0,5 м³ при объеме питательной среды 0,25 м³. Состав питательной среды, условия ее приготовления и стерилизации, а также режим культивирования те же, что и в примере 1 за исключением дозировки кукурузной муки 2,75% в составе питательной среды. В результате ферментации через 17,5 ч роста получают к.ж. с содержанием пектин-лиазы 27200 ед/см³ , СВ 2,9% и значением водородного показателя 8,8 единиц рН. В полученную к.ж. вносят 0,1% хлорида кальция и 9% хлорида натрия. Значение водородного показателя в стабилизированной к.ж. доводят раствором соляной кислоты до 6,7 единиц рН. Подготовленный образец высушивают, как описано в примере №1.

В результате обезвоживания получают концентрат с содержанием пектин-лиазы 257000 ед/г светло-серого цвета. Термические потери при сушке составляют 4,9%. Общий выход в концентрате составляет 89,3% от исходного в к.ж.