раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса

Формула изобретения

Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса для восстановления дефектов кожи в виде губки, геля, коллоидного раствора, пленки, отличающееся тем, что хитозановая составляющая содержит хитозан со степенью деацетилирования 0,95-0,99 и молекулярной массой 100-1000 kDa в виде аскорбата хитозана при содержании аскорбиновой кислоты 1,8 г/г сухого хитозана, а также хондроитинсерную кислоту - 5-100 мг/г сухого хитозана, гиалуроновую кислоту - 10-100 мг/г сухого хитозана, гепарин - 2,5-5 мг/г сухого хитозана и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота - 11-220 мкг/г сухого хитозана.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической хирургии, трансплантологии, и может быть использовано для восстановления полнослойных кожных дефектов различной площади в качестве искусственной матрицы дермально-эпидермального эквивалента кожи.

Известны способы лечения плоских гранулирующих вялотекущих неинфицированных и инфицированных ран в стадии регенерации, ожогов II и IIIa степеней, трофических язв, пролежней, временного закрытия ожоговых ран IIIб степени после хирургической обработки с целью их подготовки к аутодермопластике, донорских участков, а также ногтевого ложа после удаления ногтей, пораженных онихомикозом, с помощью раневых покрытий на основе хитозана и коллагена, таких как «Коллахит» (RU 2108114 (13) С1; А 61 L 15/28. Бюл. №10, 10.04,98), на основе альгината натрия (Чумаков А.А., Комнова З.Д.// Журнал «Стоматология». - 1984. - №4, с.28; Чумаков А.А., Дмитриева Л.А., Комнова З.Д. и др.// Журнал «Стоматология». - 1985. - №5, с.6-9) с включенными в них различными антисептическими, анестезирующими, противомикробными, стимулирующими препаратами. Известные раневые покрытия обладают хорошим ранозаживляющим эффектом, при комбинации их с антисептическими препаратами, например фурагином, диоксидином, хлоргексидином или анестетиками, например анилокаином, тримеклином или шиконином. Эти известные раневые покрытия относятся к медицинским материалам на основе природных полисахаридов, содержащих интерполимерный полиэлектролитный комплекс катионного или амфотерного линейного полисахарида с анионным линейньм полисахаридом, химически сшитый полифункциональными альдегидами или эпоксисоединениями, который обладает гемостатическим и репаративным действием. Медицинский материал может быть композицией для создания различных типов перевязочных средств (повязок, раневых покрытий, перевязочных пакетов, тампонов) в форме гелей, пленок, губок, коллоидных растворов, которые дополнительно могут содержать составы для лечения ран, ожогов, лекарственные средства, дерматологические композиции, растительные экстракты, а также служить основой для косметических масок и накладок для компрессов.

Однако при использовании этих раневых покрытий жизнеспособность и пролиферативная активность клеток фибропластического ряда в стендовых опытах и в ране невысока, что отражается на качественных и количественных характеристиках новообразованной соединительной ткани, которые не соответствуют строению нормальной здоровой кожи. Следовательно, эти известные полиэлектролитные композиции не могут быть использованы в качестве искусственной матрицы дермально-эпидермального эквивалента кожи. Введение фибробластов животных в эти конструкции в стендовых исследованиях показывает, что интенсивность синтетических процессов в ядрах клеток недостаточно высокая. Это означает, что предлагаемая для клеток полиэлектролитная подложка не создает достаточно благоприятные условия для их размножения и дифференцировки. Благоприятные условия жизнедеятельности фибробластов как источников коллагена - волокнистой основы соединительной ткани - при восстановлении раневого дефекта являются причиной формирования правильной архитектоники околорубцовой и рубцовой зон репарации. Введение известных коллаген-хитозановых конструкций в раневые дефекты сокращает сроки их заживления, однако не приводит к строго ориентированной волокнистой структуре соединительной ткани, полному восстановлению сосудистой архитектоники в глубоких слоях дермы, формированию полного объема молодой грануляционной ткани, полноценной эпителизации.

Цель изобретения - улучшить качественные и количественные характеристики восстанавливаемых раневых дефектов кожи рубцовой и околорубцовой зон, близкой к нормальной здоровой.

Цель достигают за счет того, что хитозановая составляющая содержит хитозан со степенью деацетилирования 0,95-0,99 и молекулярной массой от 100 до 1000 кДа в виде аскорбата хитозана при содержании аскорбиновой кислоты 1,8 г/г сухого хитозана, а также хондроитинсерную кислоту 5-100 мг/г сухого хитозана, гиалуроновую кислоту 10-100 мг/г сухого хитозана, гепарин 2,5-5 мг/г сухого хитозана и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота 11-220 мкг/г сухого хитозана.

Для доказательств роли аскорбиновой кислоты в пролиферативных потенциях кожных клеток - фибробластов были использованы пленки и губки «Коллахит», содержащие КоллахитП - коллаген-хитозановая пленка; коллахит-ФА(п) - пленка с фурагином калия и анестетиком анилокаином; Коллахит-Ш(п) - пленка с антисептиком шиконином; Коллахит-ФА - губка с фурагином калия и анестетиком анилокаином; Коллахит-Ш - губка с антисептиком шиконином; Коллахит Ас(п) - пленка с присутствием ацетата хитозана; Коллахит Аск(п) - пленка с присутствием аскорбата хитозана; Коллахит Ac - губка с присутствием ацетата хитозана; Коллахит Аск - губка с присутствием аскорбата хитозана. В качестве плацебо для клеток использована стеклянная подложка.

В исследовании в качестве тест-объекта использовались клетки первичной культуры фибробластов мыши, обладающих свойствами нормальных нетрансформированных клеток. В связи с тем, что важнейшим показателем жизнеспособности клеток является их матричная активность, при оценке цитотоксичности коллаген-хитозановых композиций анализировали динамику синтеза ДНК, характеризующую пролиферацию клеток. Известно, что матричные процессы наиболее интенсивно протекают в клетках, стимулированных к пролиферации из состояния покоя, такие клетки наиболее чувствительны к повреждающим воздействиям цитотоксических факторов. Клетки культивировали на среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1,0 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера и добавлением антибиотиков (пенициллин, 100 ед/мл, стрептомицин, 100 мкг/мл, или канамицин сульфат, 100 мкг/мл) (Flow Lab, Mc Clean, VA, USA или BDSL, UK) (полная среда) в гумидной атмосфере с 4-5% СО₂, при 37°С. Пассирование клеток проводили с помощью 0,25% раствора трипсина, разбавленного 0,02% раствором Версена (1:1). Между пассажами производили одноразовую смену питательной среды на свежую. Культуру покоящихся клеток получали на среде с добавлением 10% сыворотки. Через 24-48 ч после посева клеток среду удаляли, клетки трижды промывали теплым (37°С) раствором Хенкса и помещали в среду с 0,2% или 0,5% ЭТС. Срок инкубации клеток в среде с низким содержанием сыворотки в течение 3 суток считался достаточным для получения покоящихся клеток (за 24 ч инкубации ³H-тимидин включало 3-7% клеток). Стимуляцию клеточной пролиферации проводили путем смены среды на свежую, содержащую 10% ЭТС и ³H-тимидин или ³H-уридин (3,7 кБк/флакон).

Получали пленки из биополимеров или пористые пластины (губки), используя лиофильную технологию. Образцы пленок и губок стерилизовались радиационным способом, нарезались равными фрагментами размерами 3×10 см и помещались во флаконы Кареля, в которые потом наслаивалась суспензия клеток. Клетки культивировали сутки в полной среде ДМЕМ, затем переводили в состояние пролиферативного покоя, в котором удерживали трое суток. После чего меняли на среду с 10% ЭТС, содержащую ³H-тимидин (3,7 кБк/мл). Клетки культивировали в течение 0-16 часов, после чего снимали с подложки раствором Версена, наносили на фильтры GF, последовательно промывали фосфатным буфером, ТХУ, этанолом. Включившуюся радиоактивность просчитывали в толуольном сцинтилляторе на счетчике «Бета-1».

Изучение динамики синтеза ДНК (см. рис.1; примечание: обозначения 0-16 - часы культивирования клеток фибробластов) при стимуляции покоящихся клеток линии NIH3T3, культивируемых на Коллахите, показало, что большинство исследуемых полимерных композиций не подавляли пролиферативную активность клеток. Анализ активности и синтеза ДНК в фибробластах установил, что только на композициях «Коллахит ФА» в виде губчатых пластин и пленок не происходило значительного увеличения включения ³ H-тимидина. Наиболее ярко выраженный эффект на пролиферативную активность клеток проявляла композиция с хитозаном-аскорбатом. Культивирование клеток на пленке коллахита через 16 часов инкубации приводило к достоверному увеличению пролиферативной активности культуры фибробластов и соответствовало 7215 имп/мин, на пленке коллахита с включением антисептика фурагина и анестетика анилокаина 1257 имп/мин, на пленке коллахита с включением антисептика шиконина (продукт из морских бурых водорослей) 7154 имп/мин, на пленке коллахита-ацетата 7567 имп/мин, на пленке коллахита-аскорбата 9105 имп/мин (Рис.1). Исследование пролиферативной активности фибробластов на губчатом материале коллахита выявило стимулирующий эффект при включении в коллаген-хитозановую композицию аскорбиновой кислоты. Пролиферативная активность клеток соответствовала 8900 имп/мин по сравнению с пролиферацией на стекле 6900 имп/мин, что составило 29% прироста. Таким образом, включение в гель хитозана аскорбиновой кислоты и последующее получение коллаген-хитозанового комплекса по известной технологии приводит к получению губки или пленки, способной создавать благоприятные условия жизнедеятельности клеток фибропластического ряда.

В целях доказательтства роли молекулярной массы хитозана, присутствия в Коллахите мукополисахаридов, сывороточного фактора роста крупного рогатого скота были исследованы 7 видов губки Коллахит, состоящих из 1% бычьего коллагена (9 частей), 2% аскорбата хитозана молекулярной массы 100 и 1000 кДа (степень деацетилирования 0,95 и 0,99 соответственно)(1 часть), с включением в них хондроитинсульфата (ХС) (5-100 мг/г сухого хитозана), гиалуроновой кислоты (ГК) (10-100 мг/г сухого хитозана), гепарина (Г) (1-2,5 мг/г сухого хитозана) и сывороточного фактора роста (СФР) (11 и 220 мкг/г сухого хитозана). Коллаген-хитозановая губка была изготовлена согласно ТУ 9393-003-26252986-2000 с последующей холодной вакуумной лиофилизацией, гамма-стерилизацией. Полученные образцы губок были исследованы в качестве подложек в первичной культуре пролиферирующих фибробластов мыши.

Первичную культуру фибробластов мыши пассировали во флаконах Кареля (культивировали) в среде ДМЕМ, содержащей глутамин, канамицин 100 мкг/мл, 10% ЭТС в течение 3 суток. Затем клетки трижды отмывали чистой средой от сыворотки и помещали в среду с 0,2% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка). В этой среде клетки находились 3 суток (переводились в состояние пролиферативного покоя для синхронизации культуры). После этого клетки снимали с флаконов раствором Версена и высевались во флаконы в среду с 10% ЭТС, содержащей радиоактивный предшественник ДНК - ³Н-тимидин (объемная активность 3,7 кБк/мл) (стимулировали пролиферацию), в которые помещали исследуемые образцы. В этих условиях клетки культивировали 16 часов, после чего отмывали фосфатным буфером от среды, 5% ТХУ и фиксировали спиртом. Включившуюся радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе на сетчике Бета-1 (Рис.2. Включение ³ H-тимидина в первичной культуре пролиферирующих фибробластов мыши, культивируемых на различных субстратах в течение 16 часов; варианты 1-6. Примечание: образцы: ХС, ГК, Г и СФР рассчитаны на 100 мл 2% геля аскорбата хитозана:

1 - хитозан СД 0,95, MM 100 кДа +10 мг хондроитинсульфат, 200 мг гиалуроновая кислота, 22 мкг СФР,

2 - хитозан СД 0,95, MM 100 кДа +10 мг хондроитинсульфат, 200 мг гиалуроновая кислота,

3 - хитозан СД 0,95, MM 100 кДа +10 мг хондроитинсульфат, 200 мг гиалуроновая кислота,

4 - хитозан СД 0,99, MM 1000 кДа +10 мг хондроитинсульфат, 200 мг гиалуроновая кислота,

5 - хитозан СД 0,99, MM 1000 кДа +200 мг хондроитинсульфат, 20 мг гиалуроновая кислота,

6 - хитозан СД 0,99, MM 1000 кДа +200 мг хондроитинсульфат, 20 мг гиалуроновая кислота, 5 мг гепарин, 22-440 мкг СФР).

Таким образом, результаты исследований указывают на то, что молекулярная масса хитозана 100 и 1000 кДа, а также изменение степени деацетилирования (СД) полимера на несколько единиц (от 0,95 до 0,99) практически не влияли на уровень пролиферативной активности фибробластов. Включение в Коллахит СФР в образцах 1 и 6 приводило к росту пролиферации клеток в 1,6-2 раза. Присутствие гепарина в 6 образце увеличивало уровень пролиферации клеток на 32% по сравнению с образцом 1. Увеличение концентрации СФР с 22 до 440 мкг/100 мл 2% геля хитозана достоверно не изменяло величину синтеза ДНК. Таким образом, присутствие в Коллахите аскорбиновой, хондроитинсерной, гиалуроновой кислот, гепарина, а также сывороточного фактора роста создает благоприятные условия для пролиферации клеток фибропластического ряда, максимально стимулируя в ядрах синтез ДНК.

Восстановление полнослойных плоскостных дефектов кожи и их качественная и количественная характеристика были изучены с использованием коллахитовых губок, содержащих аскорбиновую, хондроитинсерную, гиалуроновую кислоты, гепарин и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота.

Способ осуществляют следующим образом. На белых крысах популяции Wistar (животные были разделены на 4 серии по 5 особей в каждой) массой 200 г наносились в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны последняя закрывалась одним из вариантов коллаген-хитозановой губки. Контрольная группа животных получала на раневую поверхность сухую марлевую повязку. Контроль репарации кожи осуществлялся на 26-е сутки с помощью анализа парафиновых срезов двух участков кожи: околорубцового и рубцового, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон в модификации Н.М. Dodds (1985) (коллагеновые волокна и фибробласты), резорцином и фуксином по Вейгерту с тонированием световым зеленым по А.П.Сорокину (1964) (эластические волокна), импрегнацией азотнокисльм серебром по Карупу (ретикулярные волокна).

Морфологический анализ показал, что в околорубцовой зоне при применении раневого покрытия «Коллахит» с включенными мукополисахаридами и сывороточным фактором роста полностью восстанавливается подкожный соединительнотканный комплекс к 26-му послеоперационному дню. Данная композиция приводит к образованию соединительной ткани, в объеме равному нормальному ее содержанию, а также восстанавливает объем сосудов, превышающий показатели группы животных, леченных раневым покрытием «Коллахит». В сосочковом слое собственно кожи полностью восстанавливается объем коллагеновых волокон, а ретикулярные волокна имеют диаметр, соответствующий аналогичному слою интактной кожи. При этом отмечается отсутствие клеточно-воспалительной реакции в околорубцовой зоне сосочкового слоя. В сетчатом слое дермы регистрируются более толстые ретикулярные волокна, чем в группе, где применяли раневое покрытие «Коллахит», что указывает на их зрелость в момент отпадения первичного струпа. Волокнистые элементы всех слоев представленной зоны имеют направление, схожее со строением интактной кожи.

В зоне рубца при использовании коллаген-хитозановой конструкции с добавлением мукополисахаридов и фактора роста полностью восстанавливается объем кровеносных сосудов, и их показатели превосходят данные, где применяли для заживления раневого дефекта покрытие «Коллахит». Лучшая васкуляризация способствует более раннему закрытию раневого дефекта с образованием зрелой соединительной ткани, близкой к строению нормальной кожи. Также в этой группе отмечается образование сосочкового слоя в зоне рубца к 26 суткам послеоперационного периода с наличием зрелых ретикулярных и коллагеновых волокон и отсутствием воспалительной реакции. Сетчатый слой рассматриваемой зоны толщиной, соответствующей нормальному строению аналогичного участка кожи, имеет больший объем ретикулярных и коллагеновых волокон, причем количество последних соответствует интактной коже. Клеточно-воспалительная реакция в группе крыс, где использовали раневое покрытие «Коллахит», с включенными компонентами соединительной ткани не выражена, чем в рубцовой зоне при лечении раневой композицией «Коллахит». При этом во всех слоях отмечается более плотная укладка волокнистых элементов, а ход волокон строго ориентирован поперечно оси тела и перпендикулярно друг другу.

В контрольной группе животных, лечение ран которых осуществлялось наложением сухой марлевой повязки, морфологическая картина новообразовавшейся соединительной ткани характеризуется отсутствием подкожного соединительнотканного комплекса, недостаточньм развитием кровеносных сосудов в околорубцовой зоне и зоне рубца, присутствием в малом количестве тонких ретикулярных волокон и толстых коллагеновых волокон в обоих исследуемых участках. Причем волокнистые структуры к 26-м суткам послеоперационного периода не имеют четкой направленности, характерной для соединительной ткани кожного покрова. При этом как в околорубцовой, так и в рубцовой зонах к моменту заживления кожного дефекта регистрируется яркая картина клеточно-воспалительной реакции.

Пример. Белым крысам популяции Wistar (каждая группа составляла 5 животных) массой 200 г под нейролептанальгезией (кетамин+дроперидол) наносились в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм ² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны последнюю закрывали одним из вариантов коллаген-хитозановой губки. Контрольная группа животных получала на раневую поверхность сухую марлевую повязку. Распределение животных по сериям представлено в таблице 1.

Таблица 1 Структурная схема серийного распределения экспериментального материала
Группы исследования	Состав раневого покрытия	Кол-во животных
Контроль 1	Интактные животные.	5
Контроль 2	Сухая марлевая повязка.	5
Контроль 3	Коллаген-хитозановый комплекс «Коллахит»	5
Опыт 4	«Коллахито+Г+ХС+ГК+СФР	5

Контроль репарации кожи осуществлялся на 26-е сутки с помощью анализа парафиновых срезов кожных лоскутов вместе с подкожным соединительнотканным комплексом. В ходе исследования образцов кожи было выделено два гистологических ее участка (околорубцовый, на расстоянии 250 мкм по обе стороны от рубца, и собственно рубец), отличающихся по строению друг от друга и от интактной кожи, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон в модификации Н.М.Dodds (1985) (коллагеновые волокона и фибробласты), резорцином и фуксином по Вейгерту с тонированием световьм зеленьм по А.П.Сорокину (1964) (эластические волокна), импрегнацией азотнокисльм серебром по Карупу (ретикулярные волокна). Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таким образом, на 26-е сутки заживления раневого дефекта формирование качественной, близкой к нормальной здоровой, за счет правильной архитектоники волокнистых структур и межуточного матрикса, соединительной ткани, происходит за счет создания для клеток фибропластического ряда благоприятных условий жизнедеятельности на коллаген-хитозановой подложке, с добавлением мукополисахаридов и сывороточного фактора роста. Это подтверждается тем, что соединительная ткань в околорубцовой зоне в полной мере соответствует нормальному строению кожного покрова как в поверхностном, так и в глубоком ее слоях (на фиг. 1 изображен сосочковый и сетчатый слои околорубцовой кожи крыс. А: интактная кожа; В: околорубцовая зона на 26-е сутки послеоперационного периода при применении коллаген-хитозановой губки, содержащей Г+ХС+ГК+Г+СФР. Увел. 10×15. Окр. гематоксилином и эозином).

Качественные и количественные характеристики коллагеновых волокон исследуемых слоев в околорубцовой зоне к моменту заживления ран не имеют отличий от интактной кожи (на фиг. 2 изображены коллагеновые волокна сетчатого слоя кожи крыс. А: кожа интактных животных; В: околорубцовая зона кожи крыс на 26-е сутки послеоперационного периода при применении коллаген-хитозановой губки, содержащей ХС+ГК+Г+СФР. Увел. 10×15. Окр. пикрофуксином и гематоксилином по Ван-Гизону).

Ретикулярные волокна по своим морфологическим параметрам в околорубцовой зоне схожи с нормальной здоровой кожей в группе, где использовали раневое покрытие «Коллахит» с присоединенными мукополисахаридами и фактором роста (на фиг. 3 изображены ретикулярные волокна сетчатого слоя кожи крыс. А: кожа интактных животных; В: околорубцовая зона кожи крыс на 26-е сутки послеоперационного периода при применении коллаген-хитозановой губки, содержащей ХС+ГК+Г+СФР. Увел. 10×15. Окр. азотнокислым серебром по Карупу).

Применение коллаген-хитозановой конструкции с содержанием мукополисахаридов и сывороточного фактора роста приводит к образованию сосочкового слоя на 26-е сутки заживления в отличие от других групп эксперимента. Полное восстановление кровеносных сосудов в зоне рубца приводит к раннему созреванию коллагеновых и ретикулярных волокон как в сосочковом, так и в сетчатом слоях дермы (на фиг. 4 изображены коллагеновые (А) и ретикулярные (В) волокна зоны рубца кожи крыс на 26-е сутки послеоперационного периода при применении коллаген-хитозановой губки, содержащей ХС+ГК+Г+СФР. Увел. 10×15. Окр. пикрофуксином и гематоксилином по Ван-Гизону; В- окр. азотнокислым серебром по Карупу).