препарат для лечения мышечных дистоний из токсина культуры clostridium botulinum и способ его получения

Формула изобретения

1. Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, включающий растворенную в физиологическом растворе с рН 4,9-6,9 жидкую субстанцию ботулинического токсина, выделенную из культуры Clostridium botulinum, и альбумин, отличающийся тем, что, он содержит жидкую субстанцию ботулинического токсина типа В штамм №364, или типа С штамм №20, или типа Е штамм №188, или типа F штамм №470, или типа G штамм №89, или их смеси в различных сочетаниях при следующем соотношении компонентов, мг/мл:

Натрий хлористый 0,8-1,0

10%-ный Pаствор альбумина 0,6-0,9

Субстанции ботулинического токсина 0,000001-0,00005

2. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что, дополнительно содержит жидкую субстанцию ботулинического токсина типа А №98.

3. Способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний из токсина культуры Clostridium botulinum, включающий культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку в два этапа, на первом из которых используют металлосорбент, и стерилизацию посредством мембранной фильтрации, отличающийся тем, что жидкую субстанцию ботулинического токсина типа В, или типа С, или типа Е, или F, или G получают из культуры Clostridium botulinum соответственно из штаммов №№98, 364, 20, 188, 470 и 89, культивирование которых проводят при температуре 29-33°С в течение 3-6 суток, второй этап очистки их жидких субстанций осуществляют посредством гель-фильтрации при рН 5,5-6,0, при этом стерилизацию жидких субстанций фильтрацией производят путем их пропускания через мембрану, размеры пор которой составляют 15-25 МК, причем полученные субстанции ботулинических токсинов при необходимости смешивают в различных сочетаниях.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что жидкая субстанция дополнительно содержит ботулинический токсин типа А №98.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве металлосорбента используют металлосорбент на основе никеля.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что культуру Clostridium botulinum выращивают на питательной среде следующего состава:

Триптон 25-33 г/л

Дрожжевой экстракт 25-33 г/л

Тиогликолят 0,2-0,6 г/л

2н NaOH До рН 7,1-7,5

Глюкоза 4-6 мг

Дистиллированная вода До 1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-формацевтической промышленности и касается создания препарата, предназначенного для лечения мышечных дистоний человека, таких как косоглазие, кривошея, непроизвольное мигание и т.п.

Известен из Schantz E.J., Johnson E.A. Properties and use of botulinum toxin and other neurotoxins in medicine. Microbial.Rev., 1992, 56, 80-99 лекарственный препарат (препарат "ВОТОХ" используют для лечения мышечных дистоний) и способ его получения на основе ботулинического токсина типа А, включающий культивирование штамма Clostri-dium botulinum типа А, осаждение токсина вместе с бактериальными клетками при рН 3,7, экстракцию 1М NaCl, осаждение этанолом (конечная концентрация 15%), растворение в фосфатном буфере и последующую кристаллизацию при диализе против 0,9 М сульфата аммония. После повторной кристаллизации ботулинический токсин разводят в 0,15 М NaCl до концентрации 100Ld₅₀/мл, добавляют сывороточный альбумин человека до концентрации 500 мкг/мл, стерилизуют и лиофилизируют.

Недостатком данного лекарственного средства является его относительно низкая активность вследствие неполной очистки последнего, с одной стороны, а с другой - потеря активности в результате проведения процесса лиофилизации и возможность возникновения к нему аллергии у пациентов.

Известен из Das Gupta B.R., Sathyamoorthy V. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. Toxicon, 1984, 32, 415-434 лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, содержащий ботулинический токсин типа А, выделенный из культуры Clostridium botulinum, и альбумин, и способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, включающий культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку с помощью ДЭАЭ-целлюлозы, стерилизацию и лиофилизацию.

Недостатками известного лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний и способа его получения является то, что он содержит в своем составе не только ботулинический токсин, который устойчив к протеолитической деградации в организме, но и ботулинический нейротоксин, который является очень чувствительным к инактивации протеолитическими ферментами, при этом он не сохраняет свою активность при хранении в жидкой форме и потому требует включения этапа лиофилизации и возможность возникновения к нему аллергии у пациентов.

Наиболее близкими по своей сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому лекарственному препарату для лечения мышечных дистоний и способу его получения являются известный из патента Российской Федерации №2206337, Кл.⁷ А 61 К 39/08, 2002 г. лекарственный препарата для лечения мышечных дистоний, включающий жидкую субстанцию ботулинического токсина, выделенного из культуры Clostridium botulinum, и альбумин, и способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, выделенного из культуры Clostridium botulinum, включающий культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку в два этапа, на первом из которых используют металлосорбент, и стерилизацию посредством мембранной фильтрации.

Недостатками этого лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний и способа его получения являются то, что он хранится не более 6-ти месяцев, а получение его сопровождается повышенным удельным расходом материалов и возможность возникновения к нему аллергии у пациентов.

Задачами изобретения является получение лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, не теряющего свою активность в течение не менее чем двух лет при хранении в жидкой форме, уменьшение риска возникновения непереносимости при его приеме и снижение удельного расхода материалов, необходимых для его производства.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Указанные задачи достигаются тем, что лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, включающий растворенную, преимущественно в 0,87% 0,005 М физиологического раствора с рН 4,9-6,9, жидкую субстанцию ботулинического токсина, выделенную из культуры Clostridium botulinum, и альбумин, содержит жидкую субстанцию ботулинического токсина типа В штамм №364, или типа С штамм №20, или типа Е штамм №188, или типа F штамм №470, или типа G штамм №89, или их смеси в различных сочетаниях при следующем соотношении компонентов, мг/мл:

Натрий хлористый - 0,8-1,0

10% раствор альбумина - 0,6-0,9

субстанции ботулинического токсина - 0,000001-000005

а в способе получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний из токсина культуры Clostridium botulinum, включающем культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку в два этапа, на первом из которых используют металлосорбент, и стерилизацию посредством мембранной фильтрации, жидкую субстанцию ботулинического токсина типа В, или типа С, или типа Е, или F, или G получают из культуры Clostridium botulinum соответственно из штаммов №№98, 364, 20, 188, 470 и 89, культивирование которых проводят при температуре 29-33° С в течение 3-6 суток, второй этап очистки их жидких субстанций, осуществляют посредством гель-фильтрации при рН 5,5-6,0, при этом стерилизацию жидких субстанций фильтрацией производят путем их пропускания через мембрану, размеры пор которой составляют 15-25 мк, причем полученные субстанции ботулинических токсинов при необходимости смешивают в различных сочетаниях.

Примечание: *концентрация токсина зависит от удельной активности конкретного вида очищенного токсина и составляет 80-100 ед/мл.

Кроме того, в перечень штаммов ботулинического токсина, указанных в отличительных частях пп.1 и 3 формулы, дополнительно может быть включен ботулинический токсин типа А №98, а в способе получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний из токсина культуры Clostridium botulinum в качестве металлосорбента на первом этапе очистки может быть использован металосорбент на основе никеля, а культуру Clostridium botulinum могут выращивать на питательной среде, следующего состава:

Триптон - 25-33 г/л

Дрожжевой экстракт - 25-33 г/л

Тиогликолят - 0,2-0,6 г/л

2N NаОН - до рН 7,1-7,5 г/л

Глюкоза - 4-6 мг

Дистиллированная вода - до 1 л

Для приготовления посевных материалов используют замороженные маточные культуры штаммов №№98, 364, 20, 188, 470 и 89 Clostridium botulinum. Каждую маточную культуру в количестве 0,5 мл засеивают на триптоно-дрожжевую среду, разлитую по 50 мл во флаконы емкостью 100 мл. Культуры выращивают при температуре 33° С в течение 3-5 суток. Посевные материалы можно использовать для посева в течение 6-ти месяцев; хранят при 4° С. Из флаконов с маточными культурами производят посевы на среду ТД с целью получения нативного токсина.

Для этого в емкость с 2,5 л стерильной триптоно-дрожжевой среды вносят 2,5 мл посевного материала и производят выращивание каждой отдельной культуры в термостате при температуре 33° С в течение 6 дней.

Затем определяют токсичность полученных культуральных жидкостей. Для каждого штамма отбирают 2 пробы его культуральной жидкости по 1,0 мл каждая. В обеих пробах определяют биологическую активность в ДЛМ/мл титрованием на беспородных белых мышах. Для этого препарат разводят в желатин-фосфатном буфере в соответствии с предполагаемым титром. Например, для определения титра токсина в пределах 5× 10⁵ ДЛМ/мл его разводят последовательно с десятикратным интервалом до 1× 10⁵ и далее 2× 10⁵ , 4× 10⁵. Из каждого разведения одним шприцом вводят 0,5 мл токсина внутрибрюшинно двум мышам весом 16-30 г, начиная с большего разведения. Максимальное разведение токсина, вызвавшее гибель мышей в течение 4 суток, содержит 1 ДЛМ. Биологическая активность препарата равна величине разведения, умноженная на 2, и выражается в ДЛМ /мл. На данном этапе определяют также типоспецифичность каждого штамма. Сущность определения типоспецифичности показано на примере определения ее для штамма №98 токсина типа А. Для этого культуральную жидкость после активации трипсином разводят до концентрации 100000 ДЛМ/мл и ставят реакцию нейтрализации на белых мышах с диагностическими противоботулиническими сыворотками А, В и Е. В три пробирки разливают по 1 мл приготовленного разведения культуральной жидкости с концентрацией 100000 ДЛМ/мл. В первую пробирку добавляют 1 мл диагностической сыворотки типа А, во вторую - типа В, в третью - типа Е (все сыворотки с концентрацией не менее 100 МЕ/мл). Смесь перемешивают и выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,5 мл смеси токсина с сывороткой и разными шприцами вводят внутрибрюшинно двум мышам. В течение нескольких часов должны погибнуть 4 мыши, которым были введены смеси токсина с сыворотками типов В и Е, а мыши, получившие смесь токсина с сывороткой типа А, должны выжить. В этом случае токсин считается типоспецифичным. Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, строго типоспецифичен (тип А) и токсичность 1 мл раствора составляет не менее 4-7× 10⁵ ДЛМ/мл. К полученному объему культуральной жидкости в бутыли добавляют 3 N Н₂SO₄ до рН 3,5-4,0. Контроль рН осуществляют с помощью бумажного индикатора рН на первых этапах, а затем окончательно на рН-метре. Смесь оставляют на 2-18 ч при комнатной температуре для формирования осадка. Культуральную жидкость центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют для дальнейшей работы.

Для экстракции токсина используют 0.2 М ацетатный буфер, рН 6.5-6.7, содержащий 1 М NaCl. К осадку добавляют буфер для экстракции (1/20 от исходного объема, например, к осадку от 2,5 л, культуральной жидкости добавляют 125 мл буфера), суспедируют тщательно пипетрированием и экстрагируют в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают. На данном этапе получают 120-135 мл препарата с активностью от 6× 10⁶ до 1,2× 10⁷ ДЛМ/мл.

На каждый литр надосадочной жидкости медленно добавляют 313 г сухого аммония сернокислого, тщательно перемешивая стеклянной палочкой. Для формирования осадка раствор оставляют на 17-24 часа при температуре 3-5° , после чего препарат может быть использован для дальнейшей работы. Препарат токсина в растворе сульфата аммония может храниться при 3-5° С в течение 2 лет.

Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в дальнейшей работе. К осадку от 60 мл токсина добавляют 40 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, тщательно перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения осадка и доводят до 50 мл 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Препарат центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан. К раствору токсина добавляют 10 мл 50% суспензии металлосорбента и инкубируют в течение 30 мин при постоянном перемешивании в шейкере при 60 об/мин и температуре 4° С. Затем металлосорбент осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об/мин, а надосадочную жидкость отбрасывают. Для промывания сорбента от несвязавшегося токсина к сорбенту добавляют 10 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, и повторяют этап центрифугирования. Для элюции токсина к сорбенту добавляют 5 мл элюирующего буфера (0,05 М фосфатный буфер, рН 6.5, 0,05 M NaCl, 0,05 М ЭДТА), инкубируют в течение 15 мин при 22° С при постоянном перемешивании при 30 об/мин. Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для дальнейшей работы.

Низкомолекулярные примеси в препарате удаляют гель-фильтрацией. Например, колонку размером 1,0× 50 см (объем колонки 50 мл) заполняют 50 мл гелем для гель-фильтрации - Sephacryl S-300 и промывают 100 мл 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, рН-5,5. Раствор токсина наносят на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/1 мин.

Токсин элюируют с помощью 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,5. Фракции собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки. Фракции, содержащие очищенный токсин, объединяют, объем доводят с помощью 0,1М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,5, до 10 мл и помечают как очищенный ботулинический токсин типа А. Очищенный токсин помещают в шприц и фильтруют через насадку с фильтром 0,22 в стерильную стеклянную пробирку в ламинарном боксе.

На данном этапе в препарате определяют белок, активность в ДЛМ на мышах, активность в LD₅₀ и удельную активность.

Белок определяют спектроскопически при 280 нм, исходя из того, что концентрация очищенного ботулинического токсина 0,1% дает поглощение 1,65 при 280 нм. Концентрация белка очищенного ботулинического токсина составляет 0,2-0,3 мг/мл.

Активность препарата в ДЛМ определяют на мышах, как описано выше. Активность очищенного препарата ботулинического токсина составляет от 3× 10 ⁶ до 1× 10⁷ ДЛМ/мл. Активность препарата в LD₅₀ определяют на мышах следующим образом: 1 мл препарата разводят до концентрации 1000 ДЛМ/мл и в нем определяют LD₅₀. Активность определяют, исследуя токсичность препарата на мышах. С этой целью используют желатин-фосфатный буфер, рН 6,5, и беспородных мышей, масса тела которых находится в пределах от 17 до 23 г.

Для определения Ld₅₀ используют 2 мл препарата. К каждому 1 мл препарата добавляют 1,8 мл физиологического раствора и затем делают следующие разведения:

Разведение 0: к 2,2 мл препарата добавляют 4,4 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 1: к 4,4 мл из разведения 0 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 2: к 4,4 мл из разведения 1 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 3: к 4,4 мл из разведения 2 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 4: к 4,4 мл из разведения 3 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 5: к 4,4 мл из разведения 4 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

Разведение 6: к 4,4 мл из разведения 5 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера.

Каждому животному вводят 0,1 мл каждого разведения внутрибрюшинно каждой мыши (в группе из не менее 6 животных). Число погибших животных регистрируется в течение 96 часов после введения препарата.

Расчет: LD ₅₀ и 95% доверительный интервал рассчитывают по методу Ашмарина - Кербера при выполнении следующих условий:

а) во всех группах должно быть одинаковое число животных,

б) в группе, которой вводили наиболее концентрированный препарат, должна наблюдаться 100% гибель животных,

в) в группе, которой вводили наименее концентрированный препарат, не должна наблюдаться гибель животных,

г) все растворы должны иметь постоянную кратность разведения.

Расчет LD₅₀ осуществляется по формуле: m=L-d( pj-0.5), где

LD₅₀ - разведение, при котором происходит гибель 50% животных;

m - логарифм LD₅₀ (log LDso);

L - логарифм разведения наивысшей концентрации препарата во вводимой серии;

d - log кратности разведений;

pj - доля гибели животных в j разведении;

pj - сумма долей гибели животных.

Стандартную ошибку рассчитывают по следующей формуле:

где

[Pj(1-pj)] - сумма долей гибели животных при j разведении, умноженная на (1 - сумма долей гибели животных при] разведении);

n - число животных на группу для испытуемой дозы;

95% - интервал достоверности рассчитывают по следующей формуле:

Верхняя граница = М+(1,96 × стандартная ошибка)

Нижняя граница = М-(1,96 × стандартная ошибка).

Результаты переводятся в единицы LD₅₀ с помощью таблиц антилогарифмов. В связи с тем, что каждой мыши вводят лишь 0,1 мл раствора, значения единиц LD₅₀ умножаются на 10, чтобы выразить результаты в единицах LD₅₀ на 1 мл.

Активность очищенного препарата ботулинического токсина составляет от 9× 10 ⁶ до 3× 10⁷ LD₅₀/мл.

Удельную активность препарата рассчитывают по формуле:

Удельная активность (LD₅₀/мг)=количество LD₅₀/мг белка.

Удельная активность очищенных препаратов ботулинического токсина составляет от 3× 10⁷ до 1× 10 ⁸ LD₅₀/мг. Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" или 0,05 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,5 и "Раствор альбумина 10% внутривенно". С этой целью в стерильных условиях к раствору натрия хлористого или буфера добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 500 мкг/мл: к 1194 мл раствора натрия хлористого добавляют 6 мл раствора альбумина. В стерильных условиях к 1200 мл буферного раствора добавляют расчетное количество субстанции с тем, чтобы конечная активность объема серии составляла 100 ед/мл.

Фактор разведения рассчитывают по следующей формуле:

V _b × U_e

Х=V_f × U

где

Х - количество мл субстанции,

V_b - объем серии препарата (мл),

V _f - объем препарата во флаконе,

U_e - количество единиц во флаконе,

U_s - количество единиц/мл в V_b.

Пример расчета: если объем серии препарата составляет 1200 мл, объем препарата во флаконе - 1 мл, количество единиц во флаконе - 100, а раствор субстанции содержит 2,2× 10⁶ ед/мл, то

1200х100=120000

Х=1× 2,2× 10⁶=2,2× 10⁵

X=0,545 мл.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Операции проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе.

После розлива флаконы закрывают стерильной пробкой и закупоривают фольгой.

Полученный препарат сохраняет свою активность в течение не менее 2-х лет при хранении при 4-8° С.

Пример 1

Состав питательной среды для культивирования Clostridium botulinum, штамма В 364:

Триптон 30

Дрожжевой экстракт 25-33

Тиогликолят натрия 0.5

2N NaOH до рН 7.3

Глюкоза 5

Дист. вода до 1 литра

Среда делается из коммерческих ингредиентов, которые не имеют животное происхождение.

Приготовленную среду автоклавируют при 110° С в течение 30 мин при 0,5 атм.

Для приготовления посевного материала используют замороженную маточную культуру штамма Clostridium botulinum. Маточную культуру в количестве 0,5 мл, засевают на триптоно-дрожжевую среду, разлитую по 50 мл во флаконы емкостью 100 мл. В каждый флакон перед посевом добавляют глюкозу до конечной концентрации 0,5%. Культуру 15 выращивают при температуре 34° С в течение 4-5 суток. Посевной материал можно использовать для посева в течение 6 месяцев; хранят при 4° С.

Из флаконов с маточной культурой производят посев на среду ТД с целью получения нативного токсина. Перед использованием в питательную среду добавляют 40% стерильный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,5%. В 2,5 л стерильной триптоно-дрожжевой среды вносят 2,5 мл посевного материала, выращивание культуры производят в термостате. Приготовленную среду автоклавируют при 110° С в течение 30 мин при 0,5 атм.

Отбирают 2 пробы культуральной жидкости по 1,0 мл каждая. В обеих пробах определяют биологическую активность в ДЛМ/мл титрованием на беспородных белых мышах. Для этого препарат разводят желатин-фосфатным буфером в соответствии с предполагаемым титром.

Например, для определения титра токсина в пределах 5× 10⁵ ДЛМ /мл его разводят последовательно с десятикратным интервалом до 1× 10⁵ и далее 2× 10⁵, 4× 10⁵. Из каждого разведении одним шприцом вводят 0,5 мл токсина внутрибрюшинно двум мышам весом 16-30 г, начиная с большего разведения.

Максимальное разведение токсина, вызвавшее гибель мышей на 3-и сутки, содержит 1 ДЛМ. Биологическая активность препарата равна величине разведения, умноженная на 2, и выражается в ДЛМ /мл.

Определение типоспецифичности проводят после определения токсичности по соответствующей НТД.

К полученному объему культуральной жидкости в бутыли добавляют 3 N H₂SO₄ до рН 3,5-4,0. Контроль рН осуществляют с помощью бумажного индикатора рН на первых этапах, а затем окончательно на рН-метре. Смесь оставляют на 2-18 ч при комнатной температуре для формирования осадка.

Далее осуществляют центрифугирование, при этом перед центрифугированием осадка центрифугу и ротор охлаждают до 5-7° С.

Приготавливают посуду для сливания центрифугата. Суспензию помещают в центрифужные по 250 мл стаканы и центрифугируют в среднескоростной центрифуге при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают.

На каждый литр культуральной жидкости медленно добавляют 313 г сухого аммония сернокислого, тщательно перемешивая стеклянной палочкой. Для формирования осадка раствор оставляют на 17-24 часа при температуре 5-3° С, после чего препарат может быть использован для дальнейшей работы. Препарат токсина в растворе сульфата аммония может храниться при 3-5° С в течение 2 лет в питательной среды для культивирования Clostridium botulinum, штамма В 364:

Триптон 30

Дрожжевой экстракт 25

Тиогликолят натрия 0.5

2 N NaOH до рН 7.3

Глюкоза 5

Дист. вода до 1 литра

Определение типоспецифичности проводят после определения токсичности по соответствующей НТД.

Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, строго типоспецифичен и токсичность 1 мл раствора составляет не менее 4-7× 10⁵ ДЛМ/мл для типов А и В, 4-7× 10⁵ ДЛМ/мл 1-2× 10 ⁵ ДЛМ/мл для типов Е и F и 0,4-0,6× 10⁵ ДЛМ/мл для типа G.

К полученному объему культуральной жидкости в бутыли добавляют 3 N H₂SO₄ до рН 3,5-4,0. Контроль рН осуществляют с помощью бумажного индикатора рН на первых этапах, а затем окончательно на рН-метре. Смесь оставляют на 2-18 ч при комнатной температуре для формирования осадка.

Далее осуществляют центрифугирование, при этом перед центрифугированием осадка центрифугу и ротор охлаждают до 5-7° С.

Приготавливают посуду для сливания центрифугата.

Культуральную жидкость помещают в стаканы по 500 мл и центрифугируют в среднескоростной центрифуге при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в бутыль, а осадок используют для дальнейшей работы. Для экстракции токсина используют 0,2М ацетатный буфер, рН 6,5-7,0, содержащий 1М NaCl. Готовят 0.2М раствор уксусной кислоты: ледяная уксусная кислота 1,13 мл, вода дистиллированная - до 100 мл. Делают навеску натрия уксуснокислого 3Н₂O 27,2 г, натрия хлористого - 58 г, к которым добавляют 4 мл 0.2М раствора уксусной кислоты и дистиллированной воды до 1 л. Величину рН буфера контролируют с помощью потенциометра. К осадку добавляют буфер для экстракции (1/20 от исходного объема, например к осадку от 2,5 л культуральной жидкости добавляют 125 мл буфера), суспедируют тщательно пипетрированием и экстрагируют в течение 1 часа при постоянном перемешивании.

Перед центрифугированием осадка центрифугу и ротор охлаждают до 5-7° С. Приготавливают посуду для сливания центрифугата.

Суспензию помещают в центрифужные по 250 мл стаканы и центрифугируют в среднескоростной центрифуге при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают.

На данном этапе получают 120-125 мл препарата с активностью от 6× 10⁶ до 1,2× 10⁷ ДЛМ/мл. Зная объем экстрагированного токсина, готовят навеску аммония сернокислого из расчета 313 г соли на литр жидкости (50% насыщения).

Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в дальнейшей работе.

К осадку от 60 мл токсина добавляют 40 мл стартового фосфатного буфера, рН 6,8, тщательно перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения осадка и доводят до 50 мл 50 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Суспензию помещают в центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан.

Удельная активность очищенных лекарственных препаратов ботулинического токсина составляет от 3 х 10⁷ до 8x10 ⁷LD₅₀/мг для типов А и В, от 1× 10 ⁷ до 3× 10⁷ LD₅₀/мг для типов С, Е, F и G.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" производства ОАО "Восток", пос. Восточный, Кировской области или 0,05М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,5, и "Раствор альбумина 10% внутривенно" производства ГУП "Иммунопрепарат" г. Уфа.

С этой целью в стерильных условиях к буферу добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 5 мг/мл: к 1200 мл буферного раствора.

На каждый литр культуральной жидкости медленно добавляют 40 мл стартового фосфатного буфера, рН 6,8, тщательно перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения осадка и доводят до 50 мл 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Суспензию помещают в центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4° С. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан.

К раствору токсина добавляют 10 мл 50% суспензии металлосорбента на основе никеля и инкубируют в течение 60 мин при 4° С и при постоянном перемешивании в шейкере при 30 об/мин. Затем металлосорбент осаждают центрифугирование в течение 5 мин при 3000 об/мин, а надосадочную жидкость отбрасывают. Для промывания сорбента от несвязавшегося токсина к сорбенту добавляют 10 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, и повторяют этап центрифугирования. Для элюции токсина к сорбенту добавляют 5 мл элюирующего буфера (0,05 М фосфатный буфер, рН 6.5, 0,05 М NaCl, 0,05 М ЭДТА), инкубируют в течение 15 мин при 22° С при постоянном перемешивании при 30 об/мин. Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для дальнейшей работы.

Низкомолекулярные осадки удаляют гель-фильтрацией. Колонку размером 1,0× 50 см (объем колонки 50 мл), предварительно вымытую и укрепленную в штативе, заполняют 50 мл гелем Sephacryl S-300 и промывают 100 мл 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,5.

Операцию проводят при 4° С. Раствор токсина наносят на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/1 мин.

Токсин элюируют с помощью 0,1М цитрат-фосфатного буфера, рН 5,5. Фракции собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки. Фракции, содержащие очищенный токсический комплекс, объединяют объем и помечают как очищенный ботулинический токсин соответствующего типа.

Очищенный токсин помещают в шприц на 10 мл и фильтруют через насадку с фильтром 0,22 ц (Costar, Cambridge, NA, Саt. №8110 Corning, NY, 1431) в стерильную стеклянную пробирку в ламинарном боксе.

На данном этапе в лекарственном препарате определяют белок спектроскопически, активность в ДЛМ на мышах, активность в LD₅₀ удельной активности.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" производства ОАО "Восток", пос. Восточный, Кировской области или 0,05М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,5, и "Раствор альбумина 10% внутривенно" производства ГУЛ "Иммунопрепарат" г. Уфа. С этой целью в стерильных условиях к буферу добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 0,5 мг/мл: к 1200 мл буферного раствора добавляют 6 мл раствора альбумина.

Удельная активность очищенных лекарственных препаратов ботулинического токсина типа В составляет 3× 10⁷ до 8× 10⁷ LD₅₀/мг. Фактор разведения рассчитывают по следующей формуле:

V_b × U_e

X=V_f × U_s

где

Х - количество мл субстанции,

V_b - объем серии препарата (мл),

V_f - объем препарата во флаконе,

U_e - количество единиц во флаконе,

U_s - количество единиц/мл в V_b.

Пример расчета: если объем серии препарата составляет 1200 мл, объем препарата во флаконе - 1 мл, количество единиц во флаконе - 100, а раствор субстанции содержит 2,2× 10⁶ ед./мл, то

1200× 100=120000

Х=1× 2,2× 10⁶=2,2× 10⁵

x=0,545 мл.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Операции проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе.

Полученный лекарственный препарат сохраняет свою активность в течение не менее 2-х лет при хранении при 4-8° С.

Пример 2

Штамм типа типа Е №188 Clostridium botulinum культивируют на среде, а токсин концентрируют и очищают, как описано в примере 1.

Удельная активность очищенного лекарственного препарата ботулинического токсина типа Е составляет 1× 10 ⁷ до 3× 10⁷ LD₅₀/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют раствор 0,9% натрия хлористого, содержащего раствор альбумина в конечной концентрации 0,5 мг/мл, к которому добавляют расчетное количество единиц токсина до конечной концентрации 100 ед.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Пример 3

Штамм типа типа С20 №188 Clostridium botulinum культивируют на среде, а токсин концентрируют и очищают, как описано в примере 1.

Удельная активность очищенного лекарственного препарата ботулинического токсина типа С составляет 1× 10⁷ до 3× 10⁷ LD₅₀/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют раствор 0,9% натрия хлористого, содержащего раствор альбумина в конечной концентрации 0,5 мг/мл, к которому добавляют расчетное количество единиц токсина до конечной концентрации 100 ед.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Пример 4

Штамм типа типа F №470 Clostridium botulinum культивируют на среде, а токсин концентрируют и очищают, как описано в примере 1.

Удельная активность очищенного лекарственного препарата ботулинического токсина типа F составляет от 1× 10⁷ до 3× 10⁷ LD₅₀/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют раствор 0,9% натрия хлористого, содержащего раствор альбумина в конечной концентрации 0,5 мг/мл, к которому добавляют расчетное количество единиц токсина до конечной концентрации 100 ед.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Пример 5

Штамм типа типа G №89 Clostridium botulinum культивируют на среде, а токсин концентрируют и очищают, как описано в примере 1.

Удельная активность очищенного лекарственного препарата ботулинического токсина типа G составляет от 1× 10⁷ до 3× 10⁷ LD₅₀/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют раствор 0,9% натрия хлористого, содержащего раствор альбумина в конечной концентрации 0,5 мг/мл, к которому добавляют расчетное количество единиц токсина до конечной концентрации 100 ед.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Пример 6

Штамм типа А №98 Clostridium botulinum культивируют на среде, а токсин концентрируют и очищают, как описано в примере 1.

Удельная активность очищенного лекарственного препарата ботулинического токсина типа А составляет от 3× 10⁷ до 8× 10⁷ LD₅₀ /мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют раствор 0,9% натрия хлористого, содержащего раствор альбумина в конечной концентрации 0,5 мг/мл, к которому добавляют расчетное количество единиц токсина до конечной концентрации 100 ед.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Пример 7

Каждый очищенный токсин помещают в шприц и стерилизуют через фильтр с размером пор 0,22 мк в стерильную стеклянную пробирку в ламинарном боксе. В стерильном препарате токсина определяют содержание белка, активность в ДЛМ на мышах, активность в LD₅₀/Mr и удельную активность.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" или 0,05М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,5, и "Раствор альбумина 10% внутривенно". С этой целью в стерильных условиях к буферу добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 0,5 мг/мл. К 1200 мл буферного раствора добавляют 6 мл раствора альбумина, а затем к полученному раствору добавляют 60000 ед. очищенного токсина типа В и 60000 ед. очищенного токсина типа Е или добавляют 60000 ед. очищенного токсина типа А и 60000 ед. очищенного токсина типа Е, или добавляют 60000 ед. очищенного токсина типа С и 60000 ед. очищенного токсина типа F, или добавляют 60000 ед. очищенного токсина типа F и 60000 ед. очищенного токсина типа G.

Полученные растворы препаратов двух типов токсинов, например токсинов типа В и Е, смешивают: к 1200 мл раствора токсина типа В с активностью 100 ЕД/мл добавляют 1200 мл раствора токсина типа Е с активностью 100 ЕД/мл. В результате получают 2400 мл лекарственного препарата с активностью 100 ЕД/мл, содержащий ботулинический токсин типа В и типа Е с активностью 50 ЕД/мл.

Конечный лекарственный препарат разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл, операции проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе.

После разлива флаконы закрывают стерильными пробками и закупоривают фольгой.

Полученный лекарственный препарат сохраняет свою активность в течение не менее 2-х лет при хранении при 4-8° С..

Предлагаемый препарат для лечения мышечных дистоний из токсина культуры Clostridium botulinum и способ его получения позволяют повысить качество препарата и уменьшить риск возникновения непереносимости при его приеме у пациентов.