способ получения капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарной активностью

Формула изобретения

Способ получения капсульного антигена возбудителя мелиондоза, обладающего антифагоцитарной активностью, включающий выращивание культуры В. pseudomallei на агаризованной питательной среде, приготовление водно-солевого экстракта из инактивированной 48-часовой агаровой культуры и выделение гликопротеина его гель-фильтрацией на колонке со смесью носителей TSK-65F(66%) и TSK-75F(33%), элюцией 0.3 М NaCl в 0.05 М фосфатном буфере, содержащем 0.02% азида натрия, ионообменной хроматографии на DEAE-сефадексе А-50 в Cl-форме, уравновешенном 0.05 М трис-НСl буфером, рН 7.7 с концентрацией NaCl 0.2 М, последующей ионообменной хроматографией на DEAE-сефадексе А-50 в ОН-форме с элюцией 0.02 М NaOH в дистиллированной воде с получением гликопротеина с молекулярной массой 200 кДа, состоящей из 90% углеводов, 10% белка, 2.17% азота, 46.4% углерода и 8.09% водорода.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается капсульного антигена возбудителя мелиоидоза гликопротеиновой природы с молекулярной массой 200 kDa, продуцируемого только вирулентными инкапсулированными штаммами этого микроорганизма, и обладающего высокой антифагоцитарной активностью, что может использоваться при дифференциации типичных вирулентных (инкапсулированных) и атипичных авирулентных (бескапсульных) штаммов возбудителя мелиоидоза, разработке специфических средств идентификации B.pseudomallei и изучении иммунного ответа макроорганизма при мелиоидозе.

Известны поверхностные антигенные комплексы возбудителя мелиоидоза, связанные с вирулентностью, иммунологической активностью и внутривидовой дифференциацией штаммов возбудителя мелиоидоза.

Так, описан способ получения мелиоидозного аллергена, представляющий собой комплекс из поверхностных антигенов 2, 3, 6, d, g, j (Замарин А.Е., Пивень Н.Н. Способ получения мелиоидозного аллергена //Авторское свидетельство №1621229. - 1990). Химический состав данных антигенов не изучен. Аллерген характеризуется высокой иммунологической активностью при выявлении реакции гиперчувствительности замедленного типа макрорганизма. Однако иммуносупрессивным действием данный антигенный комплекс не обладает, не является протективным антигеном и маркером для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза по уровню вирулентности.

Известен способ выделения поверхностного антигена 6 (Аг6) Burkholderia pseudomallei, синтез которого резко снижается при пассировании культур на чувствительных к мелиоидозу животных, Аг6 рассматривается как эпидемиологический маркер, по наличию или отсутствию которого можно дифференцировать штаммы азиатского и австралийского сероваров (Храпова Н.П. и др. Способ выделения антигена 6 возбудителя мелиоидоза //Патент на изобретение №2004250. - 1994). Однако механизм участия Аг6 в проявлении патогенных свойств возбудителя мелиоидоза не установлен и, следовательно, невозможна дифференцировка штаммов по их вирулентности, Аг6 не обладает иммуносупрессивной активностью, а его химический состав не известен.

Наиболее близкого аналога нами не установлено. В связи с этим необходима эффективная технология получения капсульного антигена, обладающего антифагоцитарной функцией с установлением его природы и основных физико-химических свойств. Необходимость получения данного биополимера продиктована возможностью дифференциации типичных вирулентных штаммов Burkholderia pseudomallei, относящегося ко II группе патогенности микроорганизмов, от авирулентных, а также изучения патогенетических аспектов развития мелиоидозной инфекции. Кроме того, он может быть апробирован при моделировании специфического вакцинального процесса как в качестве иммуносупрессора, так и в качестве модифицированного иммуномодулятора.

Целью изобретения является выделение и характеристика капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарным действием и присущего типичным вирулентным культурам Burkholderia pseudomallei.

Цель достигается тем, что из микробных клеток вирулентного штамма возбудителя мелиоидоза путем водно-солевой экстракции и последующей гель- и ионообменной хроматографии приготавливают препарат капсульного гликопротеина, обладающего антифагоцитарным действием со следующими физико-химическими характеристиками:

Углеводы - 90%

Белок - 10%

Азот - 2.17%

Углерод - 46.40%

Водород - 8.09%.

Молекулярная масса (м.м.) - 200 kDa

Пример 1. Получение и характеристика капсульного антигена. Вирулентный штамм В.pseudomallei 111 культивируют в течение 48 ч при 37°С на поверхности питательного агара рН 7.2. Выросшие микробные клетки суспендируют в 0.15 М растворе NaCl и инактивируют охлажденным (-30°С) ацетоном с последующим полным высушиванием клеток. Из сухих клеток готовят водно-солевой экстракт, после чего его подвергают гель-хроматографии на колонке со смесью носителей TSK-65F(66%) и TSK-75F(33%) и элюцией раствором, включающим в себя 0.3 М NaCl, 0.05 М фосфатного буфера, 0.02% азида натрия. Содержимое первого пика концентрируют на фильтре РМ-10. Полученный материал фракционируют ионообменной хроматографией на колонке с DEAE-Sephadex А-50 в Cl-форме, уравновешенной 0.05 М Трис-НСl буфера рН 7.7, применяя для десорбции ступенчатый градиент NaCl в исходной буферной системе - 0.1-0.2 - 0.3-1.0 М. Элюент второго пика (0.2 М) концентрируют и хроматографируют при помощи DEAE-Sephadex А-50 в OН-форме с элюцией линейным градиентом NaOH от 0.0 до 0.05 М в дистиллированной воде. Искомый биополимер элюируется при 0.02 М концентрации NaOH отдельным пиком и представляет собой гликопротеин с соотношением углеводов и белка 9:1 и молекулярной массой 200 kDa. Гликопротеин активен в иммунологических реакциях, в ДСН-ПААГ электрофорезе и иммуноблотинге представлен одной полосой в верхней части геля.

Пример 2. Сравнительное изучение вирулентности инкапсулированных клеток (200 kDa+) и бескапсульных клеток (200 kDa-) В. pseudomallei.

С этой целью используют односуточные культуры типичного вирулентного штамма В.pseudomallei 111 и его бескапсулъного варианта 111-12-2, полученного методом селекции и находящегося в коллекции культур патогенных микроорганизмов Волгоградского НИПЧИ; регистрационный №3. Культуры выращивают на питательном агаре рН 7.2, после чего в физиологическом растворе эмульгируют агаровую культуру и суспензию клеток вводят белым мышам в дозах 1×10¹, 1×10³, 1×10 ⁵, 1×10⁷ м.к. внутрибрюшинно. Заражают по 10 животных на дозу и наблюдают их в течение месяца, после чего производят учет павших и выживших. При этом устанавливают, что LD₅₀ для инкапсулированных штаммов составляет 1×10² м.к., тогда как для бескапсульных вариантов даже в дозе 1×10⁷ м.к. гибель животных не наблюдается.

Пример 3. Выявление капсульного антигена на клетке возбудителя мелиоидоза.

Локализацию капсульного антигена устанавливают при помощи электронно-иммуноцитохимического метода. С этой целью клетки отмывают ФБР рН 7.2 и фиксируют 2.5% глютаровым альдегидом на 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2, после чего добавляют поликлональные иммуноглобулины (Иг) к антигену 200 kDa (Aг 200 kDa), в концентрации 2.5 мг/мл, маркированные пероксидазой. После инкубации при 37°С в течение 1 ч клетки отмывают. В качестве субстрата используют 3,3 диаминобензидин ("Serva"). Препараты дополнительно фиксируют раствором 1% четырехокиси осьмия и заключают в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы окрашивают последовательно уранилацетатом, цитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе.

На ультратонких срезах бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза выявляется четкое диффузное капсулоподобное образование на клетках, обусловленное специфическим пероксидазным маркером. В срезах неинкапсулированных авирулентных клеток капсульный Аг 200 kDa не обнаруживается (фиг.1).

Пример 4. Антифагоцитарная активность капсульного антигена.

Функциональную активность фагоцитов изучают при помощи хемилюминесцентного метода. С этой целью в полиэтиленовые пробирки в трех повторностях вносят по 350 мкл раствора люминола в ФБР рН 7.2 в концентрации 10^-4 -10^-5 М, 50 мкл бактериальной взвеси с концентрацией 2×10⁹ мк/мл и 90 мкл 2.5-5×10⁶ фагоцитов/мл. Изучению подвергают инкапсулированный вирулентный штамм B.pseudomallei 111 и его бескапсульный вариант B.pseudomallei 111-12-2. Параллельно исследуют фагоцитабельность с добавлением к клеткам последнего Aг 200 kDa до концентрации 10 мкг/мл. Пробирки инкубируют при 37°С. Измерение хемилюминесценции проводят на люминометре LKB 1250 ("LКВ", Швеция) в затемненном помещении каждые 10 мин. Результаты хемилюминесценции показывают (фиг.2), что уровень фагоцитабельности клеток авирулентного штамма находится на высоком уровне в сравнении с инкапсулированными клетками. Вместе с тем, добавление в реакционную смесь Аг 200 kDa (10 мкг) резко снижает фагоцитабельность клеток безкапсульного варианта, приводя ее к уровню фагоцитабельности вирулентного штамма, что свидетельствует о выраженном иммуносупрессивном действии капсульного антигена возбудителя мелиоидоза.

Пример 5. Дифференциация инкапсулированных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) вариантов B.pseudomallei.

Производят посев исследуемых микроорганизмов в пробирки со скошенным питательным агаром рН 7.2, культивируют при 37°С в течение 24 ч, после чего производят смыв биомассы 1.0 мл физиологического раствора и полученные суспензии клеток переносят в термостойкие пробирки. Последние подвергают тепловой обработке на водяной бане при 100°С в течение 15 мин с целью инактивации микроорганизмов (капсульный антиген является термостабильным). Предварительно в чашке Петри формируют 3 мм слой 1% агара или агарозы на физиологическом растворе, пробивают лунки диаметром 2.5 мм с расстоянием между лунками 3 мм. В периферические лунки вносят до краев прогретые суспензии исследуемых штаммов возбудителя мелиоидоза, а в центральную лунку - поликлональные Иг к Аг 200 kDa или Иг к цельным клеткам. Результаты оценивают через 24 ч по формированию или отсутствию зон преципитата. В случае использования Иг к Аг 200 kDa формирование преципитата означает наличие капсульного антигена в исследуемой суспензии; в случае применения Иг к цельным клеткам обнаружение преципитата у лунки с антигеном также указывает на присутствие Аг 200 kDa, т.е. клетки относятся к инкапсулированному варианту возбудителя мелиоидоза. Отсутствие специфического преципитата свидетельствует о том, что исследуемый штамм является бескапсульным.

Таким образом, полученный капсульный антиген представляет собой очищенный гликопротеин с соотношением углевод/белок 9:1 и молекулярной массой 200 кDа, входящий в капсулу и ассоциированный с вирулентностью за счет антифагоцитарной активности и пригодный для дифференциации инкапсулированных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) вариантов возбудителя мелиоидоза, изучения патогенеза мелиоидоза и разработки идентификационных средств для оценки состояния иммунной системы макроорганизма при мелиоидозе.