способ изготовления вакцины против миксоматоза кроликов

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины против миксоматоза кроликов, включающий выращивание вакцинного штамма "В-82" вируса миксомы в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, определение его инфекционной активности, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, отличающийся тем, что вакцинный штамм "В-82" вируса миксомы выращивают в перевиваемой культуре клеток RK-13 при 33°С в течение 48-72 ч в бессывороточной среде с рН 7.2-74, определяют инфекционную активность в той же клеточной системе и смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления живой культуральной вакцины против миксоматоза кроликов, и может быть использовано на предприятиях биологической промышленности.

Для профилактики миксоматоза кроликов в России и за рубежом широкое распространение получили живые вакцины из аттенуированных штаммов вируса миксомы. Для их изготовления вируссодержащий материал получают на первичных или перевиваемых культурах клеток.

За рубежом для профилактики миксоматоза кроликов используют вакцинные препараты, изготовленные на основе применения адаптированных к росту в первичных и перевиваемых культурах клеток вакцинных штаммов вируса миксомы (Knezevic N. Adaptacija i imnozavanje virusa miksomatoze na kulturi thiva // Vet. geasnik. - 1986. - №40 - s. 801-807; Cupera Z., Krupka V., Giran E. Aplikace vacciny proti Myxomatose zive MXT prupichen us niho boltce specialni drojjehlon // Vet. Med. - 1982. - №27. - s.617-625).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сухой культуральной вакцины, содержащей аттенуированный штамм “В-82” вируса миксомы кроликов, выращенный в первичной культуре клеток почки крольчонка (ПК) и фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) (В.В.Гуненков с соавт., патент RU №1169221 от 10.10.95).

Основной недостаток ближайшего аналога состоит в том, что использование первично-трипсинизированных культур для производства вакцин требует высоких материальных затрат, а технологический процесс является трудоемким, поскольку предполагает использование в качестве исходного сырья ткани куриных эмбрионов или крольчат. Первичные культуры клеток, в том числе ПК и ФЭК, не стандартизированы по своим свойствам и зависят от индивидуальных особенностей используемых животных и эмбрионов.

Вторым недостатком известного способа является необходимость использования для определения инфекционной активности посевного и вируссодержащего для изготовления вакцины материала кроликов или первичной культуры клеток ПК.

Целью данного изобретения является стандартизация способа изготовления вакцины против миксоматоза кроликов на основе штамма “В-82”, выращенного на перевиваемой линии клеток; удешевление, упрощение технологического процесса.

Поставленная цель достигается способом изготовления вакцины против миксоматоза кроликов, включающим выращивание вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, определение его инфекционной активности, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, при этом вируссодержащий материал вакцинного штамма “В-82” вируса миксомы получают в перевиваемой культуре клеток RK-13 при 33°С в течение 48-72 часов в бессывороточной среде с рН 7.2-7.4, определяют его инфекционную активность в той же клеточной системе и смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15.

Сущностью изобретения и его отличительным признаком является адаптация и культивирование аттенуированного штамма “В-82” вируса миксомы в перевиваемой линии клеток почки кролика (RK-13), а не в первично-трипсинизированных культурах клеток.

Другим отличительным признаком изобретения является определение инфекционной активности вируса титрованием в перевиваемой культуре клеток RK-13, а не на кроликах или первичных культурах клеток. В результате исключено использование кроликов, на которых ранее определяли инфекционную активность, а также повышается достоверность результатов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Клетки RK-13 культивируют в матрацах емкостью 1.5 дм³ в 0.15 дм³ поддерживающей среды (0.1%-ный гидролизат лактальбумина на солевом растворе Хенкса с содержанием пенициллина - 100 ЕД/см³, стрептомицина - 100 мкг/см³) с 5%-ной фетальной сыворотки при 33°С в течение 36-48 часов.

Затем в асептических условиях из матрасов удаляют культуральную жидкость и в монослой RK-13 вносят 3-6 см³ посевного материала. В качестве посевного материала используют матриксный штамм “В-82” с активностью не ниже 6.5 lg ИД₅₀/см³, полученный 2-3-кратным пассированием тканевого вируса штамма “В-82” в монослое культуры клеток ПК или ФЭК.

Адсорбцию вируса проводят при температуре 33°С в течение 1.5 часов, после чего добавляют 0.15 дм ³ поддерживающей среды с рН 7.2 и инкубируют зараженную культуру при температуре 33°С в течение 48-72 часов до полного развития цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащий материал сливают и замораживают при минус 40-70°С.

По завершении процесса проводят контроль производственной партии вируссодержащего материала на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и инфекционную активность вируса на кроликах или в культуре клеток RK-13. Инфекционная активность вируса составляла 6.5±0.5 Ig ИД₅₀/см³ при внутрикожном титровании на кроликах и 7.0=1=0.5 lg ТЦД₅₀/см³ при титровании в культуре клеток RK-13.

Вируссодержащий материал после оттаивания отделяют от клеточного субстрата методом сепарирования при 3000xg при 4-8°С. Полученную производственную партию вируссодержащего материала вакцинного вируса миксомы с активностью 7.0=1=0.5 lg ТЦЦ₅₀/см³ смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15 соответственно, после чего фасуют в ампулы и лиофилизируют.

Лиофилизацию осуществляют при температуре от минус 50°С до 0°С в течение 24-32 часов, затем от 0°С до 21°С в течение 8 ч при вакууме 85 микрон и досушивают в течение 4 часов.

Готовый вакцинный препарат оценивают на безвредность, реактогенность и иммуногенность.

При определении безвредности полученные образцы вакцины вводят по 1000 ТЦД₅₀/см³ кроликам в объеме по 3.0 см³ внутримышечно и внутрикожно в 8 точек по 0.25 см³. Срок наблюдения - 28 суток. На 3-и сутки наблюдений на местах внутрикожного введения вакцины появились локальные поражения кожи - миксомы диаметром 1-1.5 см и меньше, которые постепенно регрессировали на 14-е сутки. На месте внутримышечного введения миксомы отсутствуют. Данный опыт показывает, что вакцина является безвредной для кроликов.

Реактогенность вакцинных препаратов оценивают на пяти кроликах по клиническим признакам (угнетение, снижение аппетита, ринит, конъюнктивит, местная реакция - образование узелков на ушах, веках), появляющимся после внутримышечного или внутрикожного введения кроликам прививной дозы вируса 1000 ТЦД₅₀/см³. Вакцина не обладает выраженными реактогенными свойствами: после внутримышечного введения она не вызывает общего генерализованного заболевания и местной реакции, а после внутрикожного введения вызывает образование обычных локальных миксом.

Контроль иммуногенности вакцины проводят, вакцинируя кроликов полученными образцами в дозе 1000 ТЦД₅₀/см ³ на голову с последующим, на 9 сутки после прививки, контрольным заражением вирулентным вирусом миксоматоза штамма “МР” в дозе 1000 ИД₅₀ на голову или титрованием вакцинного штамма “В-82”, выращенного на ФЭК, имеющего инфекционную активность на кроликах не ниже 5.1 lg ИД₅₀/см³. Результаты контроля иммуногенности показали, что все иммунизированные кролики выжили, в то время как контрольные - пали на 10-14 сутки, а при определении на иммунизированных кроликах инфекционной активности штамма “В-82” снижение его активности превышало 3.0 lg ИД ₅₀/см³.

Пример 2.

Для получения производственной серии вакцины клетки RK-13 культивируют в матрацах емкостью 1.5 дм³ в 0.15 дм³ поддерживающей среды (0.1%-ный гидролизат лактальбумина на солевом растворе Эрла, гентамицин - 20 ЕД/см³) с 5% сыворотки крови КРС при 33°С в течение 36-48 часов.

Затем в асептических условиях из матрасов удаляют культуральную жидкость и в монослой RK-13 вносят 3-6 см³ посевного материала. В качестве посевного материала используют штамм “В-82” с активностью не ниже 7.0±0.5 lg ТЦД₅₀/см³, полученный в результате 1-10-кратного пассирования вируса штамма “В-82” в монослое культуры клеток RK-13.

Адсорбцию вируса проводят при температуре 33°С в течение 3.0 часов. Затем добавляют 0.15 дм³ поддерживающей среды с рН 7.4 и инкубируют зараженную культуру при температуре 33°С в течение 48-72 часов до полного развития цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащий материал сливают и замораживают при минус 40-70°С.

Вируссодержащий материал после оттаивания отделяют от клеточного субстрата методом сепарирования при 3000xg при 4-8°С. Полученную производственную партию вируссодержащего материала вируса миксомы с активностью 7.0±0.5 lg ТЦД₅₀/см³ смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15 соответственно, после чего фасуют в ампулы и лиофилизируют.

Лиофилизацию осуществляют при температуре от минус 50°С до 0°С в течение 24-32 часов, затем от 0°С до 21°С в течение 8 ч при вакууме 85 микрон и досушивают в течение 4 часов.

Оценка безвредности, реактогенности и иммуногенности проводится аналогично примеру 1.

Изготовленная по предложенному способу вакцина против миксоматоза кроликов сохраняет свои иммунобиологические свойства при температуре 4-8°С не менее 12 месяцев, не зависит от наличия или отсутствия вакуума в ампулах и позволяет обеспечить защиту животных после однократной прививки. Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.