способ определения активности системы нейтрофилов при язвенной болезни

Формула изобретения

Способ определения активности системы нейтрофилов при язвенной болезни путем гистохимического исследования периферической крови, отличающийся тем, что измеряют интенсивность анизотропии в поляризованном свете микроскопа ядер нейтрофильных гранулоцитов, окрашенных при рН 5,0 толуидиновым синим, и по уровню процента площади анизотропии ядра клетки определяют активность системы нейтрофилов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической практике при определении резервных возможностей организма за счет оценки активности системы нейтрофилов в условиях язвенной болезни.

Система крови является одним из важнейших интегрирующих факторов организма. Любые структурные или функциональные сдвиги в любой из его систем находят то или иное отражение на параметрах элементов системы крови. Сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты, являющиеся важнейшим фактором, обеспечивающим защитную функцию крови на одном из первых “рубежей” обороны организма, чутко реагируют не только на внедрение тех или иных “повреждающих” факторов внутренней или внешней среды, но и на общее функциональное состояние организма в целом. Определение их функционального статуса давно является важнейшей задачей клинической лабораторной практики.

Таким образом, разработка новых эффективных способов определения биологической активности сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов является весьма актуальным.

Известен способ определения резервных возможностей организма путем определения клинических, биохимических, электрофизиологических показателей в сочетании с подсчетом лейкоцитарной формулы (Гаркави Л.Х., Е.Б. Квакина, Т.С. Кузьменко. Реакция активации, как путь к здоровью, через процесс самоорганизации. М.: Иммедис, 1980).

Недостатками данного способа является его многостадийность и связанный с ней “каскад” ошибок, нарастающий по мере увеличения числа исследуемых показателей, потребность в сравнительно дорогостоящем оборудовании, затрата значительного времени на подсчет лейкоцитарной формулы из расчета 400 клеток на один мазок периферической крови, неоднозначность получаемых результатов ввиду множества “возмущающих” факторов.

За прототип принят способ, предусматривающий оценку чувствительности нейтрофилов при сочетанной гастродуоденальной патологии (патент РФ № 2191387, 2002 г.). Способ предусматривает: 1. Приготовление мазков венозной крови. 2. Цитохимическое выявление грубодисперсных выявлений в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов, а также чувствительность этих клеток к желудочным и другим антигенам. 3. Количественный подсчет установленных цитохимических показателей. 4. Прогнозирование течения патологического процесса на основании сравнения результатов, полученных для нейтрофильных гранулоцитов венозной крови в норме и при патологии в детском возрасте.

Недостатком способа является определенная узость областей применения в клинической практике, ограниченная рамками возраста, необходимость использования иммунологических дорогостоящих исследований периферической крови, что создает определенные сложности трактовки полученных результатов.

Задачей изобретения является максимально упростить и объективизировать способ определения активности системы нейтрофильных гранулоцитов при язвенной болезни в любом возрасте, сделав ее доступной для любой клинической лаборатории, сохранив при этом полную репрезентативность получаемых результатов.

Сущность изобретения заключается в том, что измеряют интенсивность анизотропии окрашенных толуидиновым синим (рН-5,0) ядер клеток системы нейтрофильных гранулоцитов и при анизотропии, охватывающей 76-100% площади ядра, определяют слабую биологическую активность нейтрофильного гранулоцита, свидетельствующую о пониженных резервных возможностях организма, при анизотропии, охватывающей 51-75% площади ядра - умеренную биологическую активность нейтрофильных гранулоцитов и соответственно средние резервные возможности организма, при анизотропии в 25-50% площади ядра определяют высокую биологическую активность клеток системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно высокий уровень резервных возможностей организма, при полном отсутствии анизотропии ядер нейтрофильных гранулоцитов или анизотропии не более 24% площади ядра определяют очень высокую биологическую активность клеток системы нейтрофильных гранулоцитов, свидетельствующую об очень высоких резервных возможностях организма.

Способ осуществляют следующим образом. Мазки клеток периферической крови подсушивают на воздухе, фиксируют смесью этанол/ацетон в соотношении 1:1, подвергают гидролизу в 5 N HCL при 20°С и обработке салянокислым гидроксиламином, приготовленным по Р.Лилли (Патологическая техника и практическая гистохимия, - М., 1969) при температуре 37°С в течение 3 часов. Обработанные таким образом мазки окрашивают 0,05% раствором толуидинового синего при рН-5,0, приготовленного на 0,001 М цитратом буфере. Время окраски составляло 20 минут. Окрашенные препараты коротко отмывают нитратным буфером, высушивают на воздухе и исследуют под поляризационным микроскопом "МП-8" при “скрещенном” анализаторе и поляризаторе. Полученные поляризационные картины фотографируют в строго стандартизированных условиях на пленку типа РФ-3 и ФН-100, на полученных фотографиях измеряют площадь, занятую анизтропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, используя для этого морфометрический метод равноудаленных точек (Ташке К. "Введение в количественную цито-гистологическую морфологию" Из-во Академии социалистической республики Румыния. - 1976, с.207) или методом компьютерного анализа изображений. Учету подвергают как зоны микрофотографии, имеющие признаки анизотропии, так и зоны, которые этим эффектом не обладают. Для массовых исследований в клинических условиях используют нашу модификацию хорошо известного полуколичественного метода Астальди и Верга (Astaldi G., Verga L. The glycogen content of the cells of lymphatic leukaemia //Acta Haemat., 1957. - Vol.17. – P.911-928), адаптированного для изучения ядер. Все ядра разделены по степени анизотропии на 4 группы, каждой из которых присвоена определенная величина анизотропии от 0 - полное ее отсутствие до 3 - анизотропно все ядро. В дальнейшем расчет анизотропии проводят по известной формуле:

где СЦК - средний цитохимический коэффициент или величина анизотропии

a, b, c, d - количество клеток с разной величиной анизотропии

0, 1, 2, 3 - условная степень анизотропии соответствующая площади, занимаемой анизотропным материалом.

При этом (см. чертеж):

0 - анизотропный материал занимает от 0 до 24%

площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

1 - анизотропный материал занимает от 25 до 50%

площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

2 - анизотропный материал занимает от 51 до 75%

площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

3 - анизотропный материал занимает от 76 до 100%

площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

Величины СЦК могут приобретать значения от 0 (полное отсутствие анизотропии) до 3 (максимальная анизотропия). Величина биологической активности сегментоядерных, нейтрофильных гранулоцитов (БАСНГ) обратно пропорциональна величине анизотропии, БАСНГ отражает показатель активности нейтрофилов (ПАН), отсюда -

ПАН=3-СЦК.

При ПАН от 3 до 2,25 (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 0-24%) определяют очень высокую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно очень высокие резервные возможности организма.

При ПАН от 2,24 до 1,5 (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 25-50%) определяют высокую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно высокие резервные возможности организма.

При ПАН 1,4 от 0,75 (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 51-75%) определяют умеренную биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно умеренные резервные возможности организма.

При ПАН от 0,74 до 0 (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 76-100%) определяют низкую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно низкие резервные возможности организма.

Способ определения резервных возможностей организма опробован в клинических условиях на 56 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, но может быть использован и при других патологиях, а также применен к другим видам цитологического материала.

Примеры.

1. У больного язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки К. из подушечки четвертого пальца левой руки, по общепринятой методике, была получена капля периферической крови, из которой на обезжиренном предметном стекле был приготовлен мазок крови. Данный мазок крови был подсушен на воздухе при комнатной температуре, а затем подвергнут фиксации смесью этанол/ацетон в соотношении 1:1. Время фиксации составило 15 минут. После фиксации мазок крови был подвергнут обработке 5N HCl при 20°С для гидролиза ядерной ДНК нейтрофильных гранулоцитов. Время гидролиза составило 40 минут. После обработки соляной кислотой мазок крови больного К. был обработан солянокислым гидроксиламином, приготовленным по Р.Лилли (1969) для блокады открывшихся после обработки соляной кислотой альдегидных групп ДНК ядер нейтрофильных гранулоцитов. Продолжительность данной обработки составила 3 часа при 37°С. Обработанный таким образом мазок крови больного К. был окрашен 0,05% раствором толуидинового синего при рН-5,0. После окраски мазок подвергли короткой промывке, а затем высушили. Приготовленный таким образом мазок крови больного К. исследовали под поляризационным микроскопом МП-8 при "скрещенном" анализаторе и поляризаторе. Во время исследования проводили полуколичественное измерение площади, занимаемой анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов. Было измерено 100 клеток. Средняя площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила 14,7%, что соответствует СЦК=0,44 и уровню ПАН=2,56. Это свидетельствует о высоком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и высоких резервных возможностях организма в целом. Послеоперационный период протекал гладко, гнойно-септических осложнений не наблюдалось.

2. У больного язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки В. средняя площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила в среднем 34,7%, что соответствует уровню ПАН 1,92 усл.ед. Это свидетельствует о достаточно высоком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и значительных резервных возможностях организма в целом. Послеоперационный период протекал спокойно, гнойно-септических заболеваний не наблюдалось.

3. У больного язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки М. площадь, занимаемая анизотропным материалом, составила в среднем 62,7%, что соответствует уровню ПАН 1,12 усл.ед. Это свидетельствует об умеренном уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и пониженных резервных возможностях организма в целом. Послеоперационный период протекал удовлетворительно, гнойно-септических заболеваний не наблюдалось, однако срок реабилитации был значительно (на 29%) больше, чем в примере 1 и 2.

4. У больного язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки Ж. площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила в среднем 85%, что соответствует уровню ПАН 0,45 усл.ед.. Это свидетельствует о низком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и пониженных резервных возможностях организма в целом. Послеоперационный период протекал в условиях развившегося перитонита средней тяжести, реабилитация носила затяжной характер.

Применение данного способа позволит значительно упростить процесс определения резервных возможностей организма в целом и установления биологической активности сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов в частности, даст возможность прогнозировать характер и сроки течения заболевания у больных разных категорий, а также проводить превентивные мероприятия, направленные на предотвращение возможных осложнений основного заболевания.