способ определения ацетилхолина

Формула изобретения

Способ определения ацетилхолина, включающий инкубирование анализируемой пробы, центрифугирование, отбор супернатанта, приготовление щелочного гидроксиламинового реагента добавлением к раствору гидроксиламин хлорида в равном объеме 3,5 N раствора NaOH, смешивание полученного щелочного гидроксиламинового реагента с анализируемой пробой, добавление раствора соляной кислоты, окрашивание раствором хлорида железа с последующим измерением оптической плотности, отличающийся тем, что при приготовлении щелочного гидроксиламинового реагента перед добавлением 3,5 N раствора NaOH раствор гидроксиламин хлорида смешивают с 10-14%-ным раствором Nа₂СО ₃, инкубирование анализируемой пробы проводят после смешивания ее с полученным щелочным гидроксиламиновым реагентом в течение 90-120 мин при температуре 33-37°С, при этом щелочной гидроксиламиновый реагент смешивают с анализируемой пробой в соотношении 2:1, перед центрифугированием добавляют раствор соляной кислоты и в отобранный супернатант приливают 0,74 М раствор хлорида железа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к методам химического анализа биологических материалов и может быть применено при определении содержания ацетилхолина в биологических пробах.

Известен способ определения ацетилхолинэстеразы эритроцитов, принятый за аналог, заключающийся в том, что в цельную кровь добавляют кислую цитрат-декстрозу (1).

Известен способ определенна ацетилхолина, принятый за прототип, включающий разведение раствора гидроксиламии хлорида и добавление 3,5 N раствора NaOH, смешивание с анализируемой пробой и инкубирование, смешивание с соляной кислотой и окрашивание раствором хлорида железа с последующим измерением оптической плотности (2).

Однако способ-прототип имеет ограниченную точность определения ацетилхолина.

Целью изобретения является повышение точности определения содержания ацетилхолина в биологических пробах

Технический результат достигается тем, что при приготовлении щелочного гидроксиламинового реагента дополнительно используют 10-14% раствор Nа₂СО₃, а инкубирование осуществляют при температуре 33-37°С в течение 90-120 мин с последующим центрифугированием закисленного раствора.

Способ осуществляется следующим образом.

В раствор гидроксиламина хлорида (14%) добавляют 10-14% раствор Na₂CО₃ и смешивают в равных объемах с 3,5N раствором NaOH. Получают щелочной гидроксиламиновый реагент. Смешивают с анализируемой гомогенизированной пробой в соотношении 2:1. Инкубируют в термостате при температуре 33-37°С в течение 90-120 мин. Смешивают с соляной кислотой и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 8-12 мин. Отбирают супернатант и в равном количестве добавляют 0,74 М раствор хлорида железа. Оптическую плотность измеряют спектрофотометрически при длине волны 450-480 мкм. Параллельно проводят определение стандартных растворов ацетилхолина для построения калибровочной кривой.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Берут навеску слизистой оболочки тела желудка крысы, весом 50,0 мг, гомогенизируют в 1,0 мл дистиллированной воды, центрифугируют 15 минут при 5000 об/мин. Супернатант отбирают в объеме 0,5 мл 14% раствор гидроксиламин хлорида, дополнительно вводят 10% раствор Nа₂СО₃ и смешивают в равных объемах с 3,5N раствором NaOH, получая щелочной гидроксиламиновый реагент. Смешивают реагент с анализируемой пробой в соотношении 0,5 мл пробы и 1,0 мл щелочного гидроксиламинового реагента. Инкубируют в термостате при температуре 35°С в течение 120 мин. Смешивают с соляной кислотой 1,0 мл и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают 0,5 мл супернатанта и добавляют 0,5 мл 0,74 М раствор хлорида железа. Оптическую плотность пробы измеряют спектрофотометрически при длине волны 480 мкм. Каждое определение проводят с определением стандартных растворов ацетилхолина 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мг/мл для построения калибровочной кривой для расчета содержания ацетилхолина в определяемой пробе.

Пример 2. Берут 1,0 мл желудочного сока человека. К 14%-ному раствору гидроксиламин хлорида добавляют 14% раствор Na₂ CO₃ и смешивают в равных объемах с 3,5N раствором NaОН. Смешивают с анализируемой пробой и соотношении 1,0 мл пробы и 2,0 мл щелочного гидроксиламинового реагента. Инкубируют в термостате при температуре 33°С в течение 90 мин. Смешивают с 1,0 мл соляной кислоты и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 8 мин. Отбирают 5 мл супернатанта и добавляют 0,5 мл 0,74 М раствора хлорида железа. Оптическую плотность измеряют спектрофотометрически при длине волны 450 мкм. Строят калибровочную кривую растворов ацетилхолина (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мг/мл) для расчета содержания ацетилхолина в определяемой пробе.

Пример 3. Берут 0,5 мл сыворотки крови человека. В 14% раствор гидроксиламина хлорида добавляют 12% раствор Na₂CO₃ и смешивают в равных объемах с 3,5N раствором NaOH. Получают щелочной гидроксиламиновый реагент. Смешивают с анализируемой пробой в соотношении 0,5 мл пробы и 1,0 мл щелочного гидроксиламинового реагента. Инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 100 мин. Смешивают с соляной кислотой и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 12 мин. Отбирают 0,3 мл супернатанта и добавляют 0,3 мл 0,74 М раствор хлорида железа. Оптическую плотность измеряют спектрофотометрически при длине волны 470 мкм. Каждое определение проводилось с учетом калибровочной кривой стандартных растворов ацетилхолина (0,1; 02; 0,3; 0,4 мг/мл). Рассчитывают содержание ацетилхолина в определяемой пробе.

Воспроизводимость способа поясняется таблицей 1.

Таблица 1
Номер пробы	Номер измерения	Измерения	M±m
1	1	0,480	0,478±0,003
	2	0,473
	3	0,480
2	1	0,475	0,475±0,003
	2	0,480
	3	0,470
3	1	0,484	0,482±0.002
	2	0,480
	3	0,481
4	1	0,482	0,479±0,002
	2	0,476
	3	0,478
5	1	0,484	0,482±0,001
	2	0,480
	3	0,482

Как видно из таблицы 1, количественные показатели содержания ацетилхолина в 5 сравниваемых пробах достоверно не различаются, что доказывает высокую воспроизводимость способа.

Сравнение точности определения содержания ацетилхолина при применении заявляемого и известного способов приведено в таблице 2.

Таблица 2
Номер пробы	Предлагаемый способ	Известный способ
1	0,480	0,390
2	0,482	0,278
3	0,484	0,400
4	0,476	0,420
5	0,481	0,370
6	0,478	0,345
7	0,485	0,420
8	0,479	0,340
9	0,481	0,400
10	0,480	0,365
M±m	0,481±0,002	0,373±0,024

Из таблицы 2 следует, что точность определения ацетилхолина заявляемым способом по сравнению со способом-прототипом выше на 29%.

Источники информации

1. Винницкая К.Б., Кузнецов В.А. Лабораторное дело, 1985, №7, 396-400.

2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике, стр.472-474.