применение (r)-ибупрофенметансульфонамида и его солей для лечения и предотвращения реакций отторжения трансплантируемых органов

Формула изобретения

1. Применение (R)-ибупрофенметансульфонамида или его нетоксичной соли для приготовления лекарственных средств для предупреждения или лечения ишемического/реперфузионного повреждения трансплантированных органов.

2. Применение (R)-ибупрофенметансульфонамида или его нетоксичной соли для приготовления лекарственных средств для предотвращения или лечения функционального повреждения, являющегося результатом реакций отторжения трансплантированных органов.

3. Применение по п.1 или 2, в которых нетоксичной солью является соль L-лизина или DL-лизина.

4. Применение по п.3, в котором нетоксичной солью является соль L-лизина.

5. Применение по любому из пп.1-4, в котором указанные трансплантированные органы являются трансплантированными почками.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению (R)-ибупрофенметансульфонамида и его нетоксичных солей для приготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения и предотвращения функционального повреждения, являющегося следствием реакции отторжения трансплантируемых органов.

Предпосылки изобретения

Трансплантация органов, особенно типа почек, сделала существенный шаг вперед в последние несколько десятилетий с введением усовершенствованных режимов иммуносупрессии, консервации органов и до- и послеоперационного ухода. Тем не менее, существует широкое поле деятельности для улучшения, особенно в отношении улучшения отдаленных результатов. Начальные ишемические/реперфузионные повреждения, являющиеся вторичными по отношению к изъятию органа, его хранению и трансплантации, связаны с последующим ухудшением и неудачей трансплантации. При трансплантации почки отсутствие немедленной функции аллотрансплантата известно как отсроченная функция трансплантата (ОФТ), что в самом общем смысле можно определить как необходимость диализа в течение первой недели после трансплантации. Отсроченная функция трансплантата является наиболее частым осложнением при аллотрансплантации непосредственно в посттрансплантационный период, поражающим более 50% первичных трупных трансплантатов почек (Ojo А.О. et al. Delayed graft function: risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation 63, 7:968-974, 1997; Koning O.H.J. et al. Risk factors for delayed graft function in cadaveric kidney transplantation. Transplantation 63, 11:1620-1628, 1997). Хотя ОФТ аллотрансплантата могут иметь различную этиологию, собраны экспериментальные и клинические доказательства, подтверждающие, что постишемическое реперфузионное повреждение аллотрансплантата может являться важным ключевым событием, ответственным за проявление ОФТ. Существует общее мнение, что сочетание ОФТ и раннего отторжения служит сильным индикатором низкой выживаемости трансплантата, и что проявление ОФТ ведет к увеличенному риску острого отторжения (Carmellini M. et al. Delayed graft function adversely affects one-year graft survival of cadaveric renal transplants. Transplant Proc 28, 1:359-360, 1996). В настоящее время общепризнано, что в патогенез ишемических/реперфузионных повреждений вовлечены цитокины и, в частности, поверхностные адгезионные молекулы, экспрессия которых инициирует прикрепление воспалительных клеток. Данные на экспериментальных животных с острой почечной ишемией показали, что сразу после повреждения повышается фактор межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и что последовательно происходит инфильтрация нейтрофилов, Т-клеток и макрофагов. Интерлейкин-8 (ИЛ-8), цитокин с сильным эффектом хемотаксиса полиморфно-ядерных клеток (ПМЯ) может генерироваться при стимуляции эндотелиальных клеток, которая следует за реперфузией, и может давать вклад в сложные процессы, в конечном счете, ведущие к отсроченной функции трансплантата, обусловленной ишемическим/реперфузионным повреждением. Недавно были обнаружены новые препараты, селективно ингибирующие биологическую активность ИЛ-8. Среди них R(-)-N-[2-(4-изобутилфенил)пропконил]метансульфонамид, далее упоминаемый как (R)-ибупрофенметансульфонамид, и его соль L-лизина (далее упоминаемая как DF 1681В), были описаны в публикации международной патентной заявки WO 00/24710 как селективные in vitro ингибиторы хемотаксиса нейтрофилов, обусловленного ИЛ-8 и, следовательно, чрезвычайно подходящие для лечения нейтрофилзависимых патологий.

В настоящее время показано, что DF 1681B ингибирует хемотаксис in vivo на модели мыши и ингибирует инфильтрацию ПМЯ на различных моделях ишемических/реперфузионных повреждений у мышей и крыс.

Тем не менее, согласно текущему положению дел в данной области техники, селективное ингибирование хемотаксиса, обусловленного ИЛ-8, не является достаточным условием для защиты трансплантированного органа от функционального повреждения. Фактически, в научной литературе описаны многочисленные факторы, вовлеченные в этиологию задержки функционального восстановления трансплантированной почки, среди которых фактор ИЛ-8 не является однозначно одним из наиболее важных: например, сообщается (Kutukculer N. et al. Transplantation, 1995, 59(3), 333-40), что ИЛ-8 совместно с ИЛ-3 и растворимым CD-23, не являются диагностически значимыми при отторжении органа, в любом случае, высокий уровень этих маркеров также присутствует у больных, которым была произведена пересадка, и у которых полностью отсутствовал феномен отторжения. Более того, дополнительно к ИЛ-3, ИЛ-8 и CD-23, в научной литературе описано множество других возможных провоспалительных молекул в качестве вероятных патогенных факторов задержки функционального восстановления трансплантируемого органа, таких как, например, ИЛ-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-17, MIP-1 бета, МСР-1 и другие. Из литературных данных следует, что для ингибирования реперфузионного повреждения при трансплантации органов, особенно, таких как почки, необходим неспецифический ингибитор воспалительного ответа или, по меньшей мере, мобилизации, лейкоцитов.

Описание изобретения

В настоящее время неожиданно было установлено, что, вопреки любым ожиданиям, исходя из ранее обсуждавшегося уровня данной области техники, (R)-ибупрофенметансульфонамид и его соль лизина (L-лизина, или DL-лизина) эффективны при защите от функционального повреждения при трансплантации органа, особенно, такого как почки. Более того, было показано, что те же препараты активны для предотвращения ишемического/реперфузионного повреждения.

Такая активность была продемонстрирована на экспериментальной модели трансплантации почки у крыс, которая более детально обсуждается ниже, и в которой DF1681B продемонстрировал активность в сохранении почечной функции непосредственно после ишемического/реперфузионного повреждения, которое следовало за сингенной трансплантацией почки, также предотвращая инфильтрацию лейкоцитов в трансплантате, происходящую после постишемической реперфузии.

Были использованы взрослые самцы крыс Lewis (RT11) (Charles River, Caico Italia S.p.A, Italy). Всем животным был обеспечен свободный доступ к пище и воде. Изучение было проведено на модели трансплантации сингенной почки с применением этих крыс в качестве доноров и реципиентов трансплантатов. Животные доноры были анестезированы лептофеном. Левая почка была подготовлена путем отделения мочеточника от связок. Почечная артерия была отделена от почетной вены путем рассечения. Почка донора и мочеточник были удалены "en bloc" и промыты Belzer (UW), содержащим 1000 ед/мл гепарина. Затем почка была помещена в ледяной раствор Belzer (UW) на 4-6 часов (холодовая ишемия) до трансплантации. Реципиенты были подготовлены путем удаления левой почки. Терапия животных с помощью DF 1681В описана ниже. Трансплантаты почек перед трансплантацией были промыты солевым раствором. Был наложен анастомоз конец в конец, как между почечными артериями, так и между венами реципиента и донора. Зажимы на сосудах были сняты через 30 минут (тепловая ишемия). Мочеточники донора и реципиента были соединены конец в конец. Затем правая нативная почка была удалена. Животные были помещены в индивидуальные метаболические камеры для измерения дневного выхода мочи в качестве показателя восстановления почечной функции. Функция почки оценивалась по истечении 16 и 24 часов путем измерения концентрации креатинина плазмы. Животные были умерщвлены через 24 часа после трансплантации. Трансплантат почки был удален, разделен на тонкие срезы и помещен в раствор Dubosq-Brazil для стандартного гистологического анализа методом световой микроскопии. Кроме того, оставшиеся фрагменты почки были заморожены в жидком азоте и использованы для иммуногистохимического анализа инфильтрата воспалительных клеток (полиморфно-ядерных клеток, МНС II положительных клеток). Были рассмотрены следующие экспериментальные группы:

Группа 1 (n=3) крысы-реципиенты трансплантата почки, подвергнутого 4-часовой холодовой ишемии, и получившие в качестве терапии DF 1681В ингибитор ИЛ-8.

Группа 2 (n=3) крысы-реципиенты трансплантата почки, подвергнутого 4-часовой холодовой ишемии, и получившие в качестве терапии носитель.

Группа 3 (n=3) крысы-реципиенты трансплантата почки, подвергнутого 6-часовой холодовой ишемии, и получившие в качестве терапии DF 1681В ингибитор ИЛ-8.

Группа 4 (n=3) крысы-реципиенты трансплантата почки, подвергнутого 6-часовой холодовой ишемии, и получившие в качестве терапии носитель.

Реципиенты были подготовлены за день до эксперимента (15 мг/кг подкожно). Животные получили внутривенную инъекцию DF 1681В (15 мг/кг) непосредственно перед реперфузией трансплантированной почки. Дополнительное применение препарата (15 мг/кг подкожно) было произведено через 2 часа после трансплантации. Контрольной группе животных был введен носитель в те же самые моменты времени, используя те же самые способы применения, как и для животных, получивших в качестве терапии DF 1681В.

Кроме того, DF 1681B продемонстрировал активность в сохранении функции почки сразу после ишемического/реперфузионного повреждения, следующего за аллотрансплантацией почки.

Были рассмотрены следующие экспериментальные группы:

Группа 1 (n=9) крысы Brown Norway, реципиенты трансплантата почки крыс Lewis, подвергнутого 6-часовой холодовой ишемии, получившие в качестве терапии носитель.

Группа 2 (n=5) крысы Brown Norway, реципиенты трансплантата почки крыс Lewis, подвергнутого 6-часовой холодовой ишемии, получившие в качестве терапии DF 1681В ингибитор ИЛ-8.

Реципиенты были подготовлены за день до эксперимента (20 мг/кг подкожно). Животные получили внутривенную инъекцию DF 1681В (20 мг/кг) непосредственно перед реперфузией трансплантируемой почки. Дополнительное применение препаратов (20 мг/кг подкожно) было произведено через 2 часа после трансплантации. Контрольной группе животных был введен носитель в те же самые моменты времени, используя те же самые способы применения, как и для животных, получивших в качестве терапии DF 1681В.

Данные были проанализированы с применением непараметрического теста Краскэла-Уоллиса (Kruskal-Wallis) для множественных сравнений или теста Tukey-Cicchetti.

Результаты

На чертеже и в таблице 1 показана концентрация креатинина плазмы у крыс Lewis через 16 и 24 часа после получения сингенного трансплантата почки, подвергнутого 4- и 6-часовой холодовой ишемии. У животных, получивших почку с 4-часовой ишемией, креатинин плазмы увеличился после операции, достигнув значений, которые через 16 и 24 часа были значительно выше, чем значения, наблюдаемые в контрольной группе животных, получивших сингенный трансплантат почки, не подвергнутый ишемии. Терапия с помощью DF 1681В предохраняла животных от повреждения функции почки, значения креатинина плазмы через 24 часа вполне сравнимы с теми же значениями у животных, получивших сингенный трансплантат почки, не подвергнутый ишемии (таблица 2). Как и ожидалось, 6-часовая ишемия вызвала более тяжелое повреждение функции почки, что подтверждается значительно более высоким уровнем креатинина плазмы, чем у животных, получивших сингенный трансплантат почки после 4-часовой ишемии (чертеж и таблица 1). DF 1681B значительно снизил концентрацию креатинина плазмы до уровней, которые, однако, были все еще значительно выше, чем измеренные у животных, получивших сингенный трансплантат почки, не подвергнутый ишемии.

Более подробная иммуногистологическая оценка инфильтрации лейкоцитов в трансплантированной почке, произведенная через 24 часа после трансплантации, суммирована в таблице 2. В почках, подвергшихся 4-часовой холодовой ишемии, было обнаружено большое количество гранулоцитов в интерстициуме, и, в меньшей степени, в интра- и перигломерулярных областях. Препарат уменьшает инфильтрацию PMN и ослабляет изменения канальцев, вызываемые ишемией/реперфузией. Применение ингибитора ИЛ-8 заметно, но не значительно, уменьшило количество гранулоцитов в интрагломерулярных областях. После 6-часовой ишемии клеточные инфильтраты увеличились в сравнении со значениями после 4-часовой ишемии не везде. В то же время, количество интерстициальных воспалительных клеток было значительно уменьшено (р<0,01) при помощи DF 1681B. Что касается нейтрофилов, количество МНС II было ниже в почках, трансплантированных после 4- и 6-часовой ишемии. Клетки обнаружены в основном в интерстициуме (таблица 3), и ингибитор ИЛ-8 не влиял на их количество.

Гистологические оценки гломерулярных, интерстициальных и тубулярных повреждений, наблюдаемых в срезах почек, трансплантированных после 4- и 6-часовой холодовой ишемии и исследованных через 24 часа после трансплантации, представлены в таблице 4. При помощи метода световой микроскопии трансплантированные почки были характеризованы по дегенеративным изменениям тубулярных эпителиальных клеток, преимущественно в проксимальных канальцах, проявляющимся в виде набухания клеток, вакуолизации и некроза (таблица 4). DF 1681В ослаблял, но не нормализовал изменения канальцев после 4-часовой ишемии. Кроме того, во всех почках были найдены тубулярные цилиндры. Очаговые ишемические изменения в клубочках были зарегистрированы только в почках, подвергнутых 6-часовой ишемии, и они были предотвращены при применении DF 1681B.

Таким образом, DF 1681B способен обеспечить предотвращение нарушения почечной функции, вторичного по отношению к холодовой ишемии. Соединение снижает количество клеточных инфильтратов и ослабляет изменения канальцев, вызванные ишемией. Данные были подтверждены на других животных. 6-часовая ишемия вызывает резкое ухудшение почечной функции.

Воздействие DF 1681B на концентрацию креатинина сыворотки у крыс Brown Norway через 16 и 24 часа после получения аллогенного трансплантата почки от крыс Lewis представлено в таблице 5. Значительное предотвращение увеличения уровня креатинина сыворотки наблюдалось равным образом у всех крыс, получивших терапию 20 мг/кг.

Данные, представленные выше, ясно показывают что (R)-ибупрофенметансульфонамид или его соль лизина (L-лизина, или DL-лизина) могут быть успешно использованы в медицинской практике.

Для этой цели (R)-ибупрофенметансульфонамид или его соль лизина могут быть соответствующим образом включены в фармацевтические препараты, которые могут применяться оральным, парентеральным, ректальным или локальным способом, до или после операции по трансплантации. Примеры приемлемых лекарственных форм включают капсулы, таблетки, суппозитории, сиропы, капли, суспензии, эмульсии, стерильные растворы для инъекций, флаконы, содержащие стерильные лиофилизированные порошки для инъекций, лекарственные формы с регулируемым высвобождением препарата, трансдермальные лекарственные формы, мази и тому подобное. Методики и носители, применяемые для приготовления таких лекарственных форм совершенно стандартны, как, например, описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co.,New York, USA, XVII Ed.

Фармацевтические составы предпочтительно применять в формах, содержащих на единицу дозирования от 1 до 500 мг, более предпочтительно от 10 до 100 мг (R)-ибупрофенметансульфонамида или эквивалентное количество его соли лизина. Могут быть также рассмотрены более высокие дозы в зависимости от обстоятельств. Применение может быть однократным или разделенным на большее количество приемов, распределенных в течение подходящего периода времени, обычно от нескольких дней до операции до нескольких недель после. (R)-ибупрофенметансульфонамид или его подходящая соль, такая как соль лизина, могут, если необходимо, быть применена в комбинации с другими лекарствами обладающими дополнительным, или, в любом случае, полезным действием, например, противовоспалительными средствами, иммуносупрессантами, анальгетиками, антитромботическими средствами.

Пример 1

Получение (R)-ибупрофенметансульфонамида.

Суспензию R (-)-2-(4-изобутилфенил)пропионовой кислоты (R-ибупрофен, 4 г, 0,019 моль) в тионилхлориде (7,4 мл) кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 4 часов, затем оставляют остывать при комнатной температуре.

Избыток тионилхлорида выпаривали в вакууме.

Следовые количества тионилхлорида удаляют, промывая осадок дважды несколькими каплями сухого диоксана и выпаривая растворитель в вакууме. 4,66 г (0,019 моль) R(-)-2-(4-изобутилфенил)пропионилхлорида получают в виде желтой маслянистой жидкости, которую растворяют в нескольких мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ).

Отдельно, метансульфонамид (2,3 г, 0,0243 моль) добавляют к суспензии трет-бутоксида калия (2,73 г, 0,0244 моль) в безводном ТГФ (28 мл) и смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого добавляют при перемешивании раствор R(-)-2-(4-кзобутилфенил)пропионилхлорида (4,66 г, 0,019 моль), получение которого описано выше, содержимое реакционной смеси перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.

Выделенные неорганические соли отфильтровывают, растворитель выпаривают в вакууме и маслянистый остаток разделяют между CH ₂Cl₂ (30 мл) и насыщенным раствором первичного кислого фосфата натрия. Органическую фазу промывают водой (2×10 мл) и водные фазы экстрагируют CH₂Cl₂ (2×10 мл). Объединенные органические экстракты высушивают над Na ₂SO₄, и растворитель выпаривают, затем в раствор маслянистого остатка в безводном МеОН (10 мл) добавляют две микрокапли концентрированной серной кислоты, для этерификации в метиловый эфир следовых количеств непрореагировавшей R(-)-2-(4-изобутилфенил)пропионовой кислоты. Смесь выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, растворитель осторожно выпаривают в вакууме, остаток разделяют между водой (10 мл) и метиленхлоридом (25 мл). Водные фазы удаляют, и органическую фазу экстрагируют насыщенным раствором NaHCO ₃ (2×20 мл). Основные фазы объединяют, подкисляют конц. HCl и экстрагируют CH₂Cl₂ (3×15 мл). После обычного промывания до нейтральности объединенные органические экстракты высушивают над Na₂SO₄ , и растворитель выпаривают в вакууме с получением 1,86 г (0,0066 моль) R (-)-N-[2-(4-изобутилфенил)пропионил]метансульфонамида: точка плавления 103-105°С (разл.); [] _D=-68 (с=1; CH₃OH); ¹H-ЯМР (ДМСО-d ₆) 7,3 (д, 2Н, J=8 Гц); 7,09 (д, 2Н, J=7 Гц); 3,42 (кв, 1H, J=8 Гц); 2,8 (с, 3Н); 2,45 (д, 2Н, J=7 Гц); 1,55 (м, 1H); 1,3 (д, 3Н, J=8 Гц), 0,95 (д, 6Н, J=7 Гц).

Пример 2

Приготовление (R)-ибупрофенметансульфонамида соли L(+)-лизина (DF 1681В).

Раствор L(+)-лизина (129 мг; 0,88 ммоль) в воде (1/3 мл) добавляют к раствору R(-)-N-[2-(4-изобутилфенил)пропионил]метансульфонамида (250 мг; 0,88 ммоль) в 1 мл метанола. Растворитель выпаривают, и остаток обрабатывают этиловым эфиром (5 мл) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Выделенный кристаллический продукт, высоко гигроскопичный, быстро отфильтровывают в атмосфере азота, промывают на фильтре безводным этиловым эфиром и высушивают в вакууме при 50°С в течение 2 часов с получением 360 мг R(-)-N-[2-(4-изобутилфенил)пропионил]метансульфонамидной соли L(+)-лизина в виде бледно-желтого порошка. [] _D=-17,3° (с=1,15; СН₃ОН); ¹ H-ЯМР (D₂O) 7.30 (дд, 4Н, J=8 Гц); 3,77 (т, 1Н, J=7 Гц); 3,65 (кв, 1Н, J=7 Гц); 3,05 (м, 5Н); 2,52 (д, 2Н, J=7 Гц); 1,92 (м, 2Н); 1,75 (м, 2Н); 1,50 (м, 3Н); 1,40 (д, 3Н, J=7 Гц); 0,90 (6Н, д, J=7 Гц).