аналоги l-рибо-знк

Формула изобретения

1. Олигомер, включающий, по меньшей мере, один нуклеозидный аналог L-рибо-ЗНК общей формулы Ia

где Х представляет собой -О-;

В представляет собой нуклеотидное основание;

Р обозначает положение радикала в межнуклеозидной связи с последующим мономером или 5'-концевую гидрокси группу;

Р* обозначает межнуклеозидную связь с предшествующим мономером или 3'-концевую гидрокси группу;

R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3 -, -(СН₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3 - или -(CH₂)_0-1-NR-(CH₂ )_1-3-, где R обозначает водород, алкил или ацил;

R^1*, R², R^3*, R⁵ , R^5* обозначают водород;

или его основная или кислая аддитивная соль.

2. Олигомер по п.1, включающий 1-10000 L-рибо-ЗНК общей формулы Ia и 0-10000 нуклеозидов, выбираемых из природных нуклеозидов и нуклеозидных аналогов, при условии, что сумма числа нуклеозидов и числа L-рибо-ЗНК составляет, по меньшей мере, 2 в таком интервале, как 2-10000.

3. Олигомер по п.2, отличающийся тем, что олигонуклеотид включает, по меньшей мере, 7 последовательных мономеров L-рибо-ЗНК.

4. Олигомер по п.2, отличающийся тем, что все нуклеозидные мономеры в олигомере представляют собой L-рибо-ЗНК.

5. Олигомер по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что бирадикал выбирают из -O-CH ₂-, -S-CH₂- и -NR-СН₂-.

6. Олигомер по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что любая межнуклеозидная связь представляет собой -O-Р(O₂)-O- или -O-P(O,S)-O-.

7. Олигомер по любому из пп.1-6, имеющий следующую формулу III:

где q обозначает 1-50;

каждый из n(0),..., n(q) обозначает независимо 0-10000;

каждый из m(1),..., m(q) обозначает независимо 1-10000;

при условии, что сумма n(0),..., n(q) и m(1),..., m(q) составляет 2-10000;

G обозначает 5'-концевую гидрокси группу;

каждый Nu независимо обозначает нуклеозид, выбираемый из природных нуклеозидов и нуклеозидных аналогов;

каждый L-рибо-ЗНК независимо обозначает нуклеозидный аналог;

каждый L независимо обозначает межнуклеозидную связь между двумя группами, выбираемыми из Nu и L-рибо-ЗНК, или L вместе с G* обозначает 3'-концевую гидрокси группу; и каждый L-рибо-3HK-L независимо обозначает нуклеозидный аналог общей формулы Ia.

8. Нуклеозидный аналог L-рибо-ЗНК общей формулы II

где X представляет собой -О-;

В представляет собой нуклеотидное основание, функциональные группы которого необязательно защищены;

Q и Q* независимо выбирают из гидрокси, Prot-O- и Act-O-;

R^3* представляет собой группу, которая представляет собой гидроксил, Prot-O- или Act-O-;

где "Prot" обозначает защитную группу для -ОН, "Act" обозначает активирующую группу для -ОН;

R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал -(СН₂)_0-1-O-(СН ₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1 -S-(CH₂)_1-3- или -(CH₂) _0-1-NR-(CH₂)_1-3-, где R обозначает водород, алкил или ацил;

R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5* обозначают водород,

или его основная или кислая аддитивная соль.

9. Нуклеозидный аналог по п.8, отличающийся тем, что бирадикал выбирают из -O-СН₂-, -S-CH₂- и -NR-CH₂ -.

10. L-рибо-ЗНК по п.8 или п.9 для получения L-рибо-ЗНК-модифицированного олигомера по любому из пп.1-7.

11. L-рибо-ЗНК по п.10, отличающийся тем, что включение L-рибо-ЗНК модулирует способность олигомера действовать в качестве субстрата для активных ферментов, специфичных для нуклеиновых кислот.

12. L-рибо-ЗНК-модифицированный олигомер по любому из пп.1-7 в качестве антисмыслового, антигенного или активирующего ген средства.

13. L-рибо-ЗНК-модифицированный олигомер по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный олигомер мобилизует РНКазуН.

14. -L-рибо-ЗНК-модифицированный олигомер по любому из пп.1-7 для специфического взаимодействия с РНК, выбираемой из тРНК, рРНК, мяРНК и мцРНК.

15. L-рибо-ЗНК-модифицированный олигомер по любому из пп.1-7 для гибридизации некодирующих белок клеточных РНК, выбираемых из тРНК, рРНК, мяРНК и мцРНК, in vivo или in vitro.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области аналогов бициклических нуклеозидов в L-рибо-конфигурации и к синтезу таких нуклеозидных аналогов, которые используют при получении синтетических олигонуклеотидов, способных к образованию специфических дуплексов нуклеотидных оснований с комплементарными одноцепочечными и двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. Изобретение также относится к области аналогов бициклических нуклеозидов в L-рибо-конфигурации, которые могут использоваться в качестве лекарственных средств и которые могут быть включены в состав олигонуклеотидов.

Предпосылки создания изобретения

Синтетические олигонуклеотиды представляют собой соединения, широко используемые в различных областях, таких как молекулярная биология, а также диагностика и лечение с применением препаратов на основе ДНК.

Общее описание

Для использования в широком перечне различных приложений, указанных выше, олигонуклеотиды должны удовлетворять множеству различных требований. Так, например, для использования в качестве лекарственных средств олигонуклеотид должен быть в состоянии проникать через клеточную мембрану, характеризоваться хорошей устойчивостью к вне- и внутриклеточным нуклеазам и предпочтительно обладать способностью мобилизовать эндогенные ферменты, такие как PHKseH. В диагностике на основе ДНК и в молекулярной биологии важны также другие свойства, такие как, например, способность олигонуклеотидов действовать в качестве эффективных субстратов для широкого перечня различных ферментов, оказывающих воздействие на природные нуклеиновые кислоты, таких как полимеразы, киназы, лигазы и фосфатазы. Однако фундаментальным свойством олигонуклеотидов, которое лежит в основе всех вариантов их использования, является их способность распознавать и гибридизоваться на специфичном участке последовательности с комплементарными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами с помощью либо водородных связей Уотсона-Крика (А-Т и G-C), либо других вариантов водородных связей, таких как описаны в модели Хугстина (Hoogsteen). Для характеристики способности данного олигонуклеотида к гибридизации обычно используют два важных параметра: аффинность и специфичность. Аффинность представляет собой меру силы связывания олигонуклеотида с комплементарной целевой последовательностью (выражаемую в виде термостабильности (Т_m) дуплекса). Каждая нуклеотидная пара в дуплексе вносит свой вклад в термостабильность и, таким образом, аффинность возрастает с увеличением размеров (числа нуклеотидных оснований) олигонуклеотида. Специфичность является мерой способности олигонуклеотида различать полную комплементарность и ошибочную целевую последовательность. Иными словами, специфичность является мерой потери аффинности, связанной с наличием ошибочных пар нуклеотидных оснований в молекуле-мишени.

При постоянстве размеров олигонуклеотида специфичность возрастает с увеличением числа ошибочных спариваний между олигонуклеотидом и его целевыми последовательностями (т.е. процент ошибок повышается). И наоборот, специфичность снижается, когда размер олигонуклеотида увеличивается при постоянном числе ошибок (т.е. процент ошибочных спариваний снижается). Говоря иными словами, повышение аффинности олигонуклеотида происходит за счет потери специфичности и наоборот.

Ввиду недостатков, свойственных естественным олигонуклеотидам, очень желательно разработать новые подходы для повышения специфичности и аффинности лекарственных средств на основе ДНК, методов диагностики и в целом методов молекулярной биологии, использующих ДНК.

Конформационно-ограниченные нуклеозиды

Известно, что олигонуклеотиды подвергаются конформационным переходам в ходе гибридизации с целевой последовательностью из относительно случайно свернутой структуры одноцепочечного состояния в упорядоченную структуру дуплекса.

Так, в последние годы в поиске аналогов олигонуклеотидов с улучшенными гибридизационными свойствами в сравнении с немодифицированными (2'-дезокси)олигонуклеотидами применялся метод конформационного ограничения. К их числу относятся, например, бицикло[3.3.0]нуклеозиды с дополнительным С-3',С-5'-этано-мостиком (М. Tarköy, M. Bolli, В. Schweizer and С. Leumann, Helv. Chem. Acta, 1993, 76, 481; Tarköy and С. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1432; M. Egli, P. Lubini, M. Dobler and C. Leumann, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 5855; M. Tarköy, M. Bolli and C. Leumann, Helv. Chem. Acta, 1994, 77, 716; M. Bolli and C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1995, 34, 694; M. Bolli, P. Lubini and C. Leumann, Helv. Chem. Acta, 1995, 78, 2077; J.C. Litten, C. Epple and C. Leumann, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 1231; J.C. Litten and C. Leumann, Helv. Chem. Acta, 1996, 79, 1129; M. Bolli, J.C. Litten, R. Schultz and C. Leumann, Chem. Biol., 1996. 3, 197; M. Bolli, H.U. Trafelet and C. Leumann, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 4660), бикарбоцикло [3.1.0]нуклеозиды с дополнительным С-1',С-6' или С-6',С-4'-метано-мостиком (К.-Н. Altmann, R. Kesselring, E. Francotte and G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 2331; K.-H. Altmann, R. Imwinkelried, R. Kesselring and G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 7625; V.E. Marquez, M.A. Siddiqui, A. Ezzitouni, P. Russ, J. Wang, R.W. Wagner and M.D. Matteucci, J. Med. Chem., 1996, 39, 3739; A. Ezzitouni and V.E. Marquez, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997. 1073), бицикло[3.3.0]- и [4.3.0]нуклеозиды, содержащие дополнительное С-2',С-3'-диоксалановое кольцо, синтезированные в виде димера с немодифицированным нуклеозидом, в котором дополнительное кольцо представляет собой часть межнуклеозидной связи, замещающей естественную фосфодиэфирную связь (R.J. Jones, S. Swaminathan, J.F. Millagan, S. Wadwani, B.S. Froehler and M. Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 9816; J. Wang and M.D. Matteucci, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7, 229), димеры, содержащие бицикло[3.1.0]нуклеозид с С-2',С-3'-метано-мостиком как составную часть межнуклеозидных связей амидного и сульфонамидного типа (C.G.Yannopoulus, W.Q.Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y.S. Sanghvi and G. Just, Synlett., 1997, 378), аналог нуклеозида, производного от бицикло[3.3.0]глюкозы, включенный в середину тримера через формацетальные межнуклеозидные связи (C.G. Yannopoulus, W.Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y.S. Sanghvi and G. Just, Synlett., 1997, 378) и бициклические[4.3.0]- и [3.3.0]нуклеозиды с дополнительным С-2',С-3'-связанным шести- и пятичленным кольцом (Р. Nielsen, Н.М. Pfundheller, J. Wengel, Chem. Commun., 1997, 826; Р. Nielsen, H.M. Pfundheller, J. Wengel, XII International Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications; La Jolla, California, September 15-19, 1996; Poster PPI 43), которые были синтезированы и включены в состав олигодезоксинуклеотидов. К сожалению, олигонуклеотиды, включающие указанные аналоги, в большинстве случаев образуют менее стабильные дуплексы с комплементарными нуклеиновыми кислотами в сравнении с немодифицированными олигонуклеотидами. В том случае, когда отмечается умеренное повышение стабильности дуплекса, такое повышение связано только с ДНК или РНК мишенью, или имеет отношение к полностью, а не частично модифицированным олигонуклеотидам, или наоборот.

Оценка большинства из указанных аналогов осложнена также недостаточностью данных по аналогам с Г, А и Ц нуклеотидными основаниями, а также данных по специфичности и способу гибридизации. Во многих случаях синтез указанных мономерных аналогов представляет собой очень сложный процесс, причем в ряде случаев синтез полностью модифицированных олигонуклеотидов несовместим с широко используемыми стандартными методами фосфорамидитной химии.

В последнее время появились сообщения об олигомерах, включающих замкнутые нуклеиновые кислоты (ЗНК, Locked Nucleic Acids, LNA) (Nielsen, P., Pfundheller, H.M., Olsen, C.E. and Wengel, J., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 3423; Nielsen, P., Pfundheller, H.M., Wengel, J., Chem. Commun., 1997, 9, 825; Christensen, N.K., Petersen M., Nielsen, P., Jacobsen, J.P. and Wengel, J., J. Am. Chem. Soc., 1998, 220, 5458; Koshkin, A.A. and Wengel, J., J. Orq. Chem., 1998, 63, 2778; Obika, S., Morio, K.-I., Hari, Y. and Imanishi, Т., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 515). Оказалось, что включение ЗНК мономеров, содержащих 2'-O,4'-С-метиленовый мостик, в олигонуклеотидную последовательность ведет к беспрецедентному улучшению гибридизационных свойств такого модифицированного олигонуклеотида (Singh, S.K., Nielsen, P., Koshkin, A.A., Olsen, C.E. and Wengel, J., Chem. Commun., 1998, 455; Koshkin, А.К., Singh, S.K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, S.E. and Wengel, J., Tetrahedron, 1998, 54, 3607; Koshkin, A.A., Rajwanshi, V.K. and Wengel, J., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 4381; Singh, Sanjay К. and Wengel, J., Chem. Commun., 1998, 1247; Kumar, R., Singh, S. K., Koshkin, A.A., Rajwanshi, V.K., Meldgaard, M., and Wengel, J., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219; Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 1997, 38, 8735; Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5401; Singh, S.K., Kumar, R. and Wengel, J., J. Org. Chem., 1998, 63, 6078; Koshkin, А.А., Nielsen, P., Meldgaard, M., Rajwanshi, V.K., Singh, S.K. and Wengel, J., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 13252; Singh, S.K., Kumar, R. and Wengei, J., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035). Олигонуклеотиды, включающие указанные ЗНК мономеры и соответствующий 2'-тио-ЗНК аналог, образуют дуплексы с комплементарными ДНК и РНК со значениями термической стабильности, которые ранее не наблюдались для би- и трициклических нуклеозидов в модифицированных олигонуклеотидах (Т _пл/модификация = от +3 до +11°С), а также демонстрируют улучшенную селективность.

В ряде работ Сеела с соавт. (Seela et al.) изучали ксило-ДНК (фиг.1, основание = аденин-9-ил, цитозин-1-ил, гуанин-9-ил или тимин-1-ил), включающую один или более 2'-дезокси--D-ксилофуранозильных нуклеотидных мономеров (Rosemeyer, Н.; Seela, F. Helv. Chem. Acta, 1991, 74, 748; Rosemeyer, H.; Krecmerova, M.; Seela, F. Helv. Chem. Acta, 1991, 74, 2054; Seela, F.; Wörner, Rosemeyer, H. Helv. Chem. Acta, 1994, 77, 883; Seela, F.; Heckel, M.; Rosemeyer, H. Helv. Chem. Acta, 1996, 79, 1451; Rosemeyer, H.; Seela, F. Nucleosides Nucleotides, 1995, 14, 1041; Schoeppe, A., Hinz, H.-J., Rosemeyer, H., Seela, F. Eur. J. Biochem. 1996, 239, 33). В сравнении с соответствующими природными 2'-дезокси--D-рибофуранозильными олигонуклеотидами, ксило-ДНК в основном характеризуется зеркальной вторичной структурой, энтропически благоприятствующей образованию дуплекса, повышению стабильности в отношении экзонуклеаз и, в случае олигонуклеотидов, включающих небольшое число 2'-дезокси--D-ксилофуранозильных мономеров, снижению термической аффинности в отношении комплементарной ДНК (Rosemeyer, H.; Seela, F. Helv. Chem. Acta, 1991, 74, 748; Rosemeyer, H.; Krecmerova, M.; Seela, F. Helv. Chem. Acta, 1991, 74, 2054; Seela, F.; Wörner, Rosemeyer, H. Helv. Chem. Acta, 1994, 77, 883; Seela, F.; Heckel, M.; Rosemeyer, H. Helv. Chem. Acta, 1996, 79, 1451).

Краткое описание сущности изобретения

В свете вышесказанного и на основании известных свойств ЗНК мономеров с 2'-О,4'-С-метиленовым мостиком, было принято решение синтезировать олигонуклеотиды, включающие один или более 2'-О,4'-С-метилен--L-рибофуранозильных нуклеотидных мономера(ов). Компьютерное моделирование на мономерах -L-рибо-ЗНК указывало на конформацию фуранозного кольца S-типа. В этой связи целью настоящей работы является синтез 2'-O,4'-С-метилен--L-рибофуранозильного нуклеотидного мономера и изучение термической стабильности олигонуклеотидов, включающих указанный мономер. Результаты показывают, что модифицированный L-рибо-ЗНК может использоваться для высокоаффинного распознавания комплементарных нуклеиновых кислот. Если принимать во внимание инвертную стереохимию молекулы на С-3'-конце и С-4'-конце, этот факт является весьма удивительным.

Таким образом, авторы настоящего изобретения предложили новые аналоги ЗНК нуклеозидов (L-рибо-ЗНК) и олигонуклеотиды, в которые включены аналоги L-рибо-ЗНК нуклеозидов. Были синтезированы новые аналоги L-рибо-ЗНК нуклеозидов, включающие тимин в качестве нуклеинового основания, однако они могут быть легко синтезированы также с четырьмя другими нуклеотидными основаниями с образованием полного набора нуклеозидных аналогов для включения в олигонуклеотиды.

Настоящее изобретение относится к олигомерам, включающим по меньшей мере один нуклеозидный аналог (называемый далее "L-рибо-ЗНК") общей формулы I

где Х выбирают из -О-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R ⁶R^6*)-;

В выбирают из водорода, гидрокси, необязательно замещенного C_1-4-алкокси, необязательно замещенного C_1-4-алкила, необязательно замещенного C_1-4-ацилокси, нуклеотидных оснований, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов;

Р обозначает положение радикала в межнуклеозидной связи относительно последующего мономера или 5'-концевую группу, причем такая межнуклеозидная связь или 5'-концевая группа необязательно включает заместитель R⁵ или равноприемлемый заместитель R⁵*;

Р* обозначает межнуклеозидную связь с предшествующим мономером или 3'-концевую группу;

R²* и R⁴ * обозначают бирадикалы, состоящие из 1-4 групп/атомов, выбираемые из -С(R^aR^b)-, -С(R^a)=C(R ^a)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a) ₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z, где Z выбирают из -О-, -S- и -N(R^a)-, и R³ и R¹³, каждый, независимо, выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-12-алкила, необязательно замещенного С_2-12-алкенила, необязательно замещенного C_2-12-алкинила, гидрокси, C_1-12-алкокси, С_2-12-алкенилокси, карбокси, C_1-12-алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С _1-6-алкил) амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6 -алкил)аминокарбонила, амино-С_1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди(C_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкиламинокарбонила, C_1-6-алкилкарбонил-амино, карбамидо, C_1-6 -алканоилокси, сульфоно, C_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6-алкилтио, галогена, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя R^a и R^b вместе могут обозначать необязательно замещенный метиленолефин (=СН ₂);

каждый из присутствующих заместителей R¹ *, R², R³*, R⁵, R ⁵*, R⁶ и R⁶* независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-12-алкила, необязательно замещенного С_2-12-алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, гидрокси, C_1-12 -алкокси, С_2-12-алкенилокси, карбокси, C_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12 -алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)аминокарбонила, амино-С_1-6 -алкиламинокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С _1-6-алкиламинокарбонила, C_1-6-алкилкарбонил-амино, карбамидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, C_1-6 -алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6 -алкилтио, галогена, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя вместе могут обозначать оксо, тиоксо, имино или необязательно замещенный метилен, или вместе они могут образовывать спиро-бирадикал, состоящий из алкиленовой цепи, включающей 1-5 атомов углерода, которая необязательно содержит внутри и/или на конце один/одну или более гетероатомов/групп, выбранных из -О-, -S- или -(NR^N)-, где R^N выбирают из водорода и C_1-4-алкила и где два соседних (негеминальных) заместителя могут обозначать дополнительную связь, приводящую к образованию двойной связи; и R^N*, в случае его наличия, выбирают из водорода и С_1-4-алкила;

и к их основным солям и кислым аддитивным солям.

Настоящее изобретение также относится к нуклеозидным аналогам (L-рибо-ЗНК) общей формулы II

где заместитель В выбирают из нуклеотидных оснований, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов;

Х выбирают из -О-, -S-, -N(R^N*)- и -C(R ⁶R^6*)-;

каждый из Q и Q^* независимо выбирают из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Prot-O-, Act-O-, меркапто, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-алкилтио, амино, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, моно- или ди (С_1-6-алкил)амино, необязательно замещенного С _1-6-алкокси, необязательно замещенного С_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила, необязательно замещенного C_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинила, необязательно замещенного С_2-6 -алкинилокси, монофосфата, дифосфата, трифосфата, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, гидроксиметила, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, аминометила, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R ^H) -CH₂-, карбоксиметила, сульфонометила, где Prot обозначает защитную группу для -ОН, -SH и -NH(R^H )-, соответственно, Act обозначает активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(R^H), соответственно, и R^H выбирают из водорода и C_1-6-алкила; и R²* и R ⁴* вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -О-, -(CR*R*) _r+s+l-, -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s -, - (CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*) _r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O- (CR*R*)_r+s -O-, -S- (CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N-(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N (R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s -N(R*)-, -N (R*) - (CR*R)_r+s-S- и -S-(CR*R*)_r+s -N(R*)-;

где каждый R* выбирают независимо из водорода, галогена, азидо, циано, нитро, гидрокси, меркапто, амино, моно- или ди (C_1-6-алкил) амино, необязательно замещенного C_1-6-алкокси, необязательно замещенного C_1-6 -алкила, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, и/или два соседних (негеминальных) R* могут вместе обозначать двойную связь и каждый r и s обозначает 0-3, при условии, что сумма r+s равна 1-4;

каждый из присутствующих заместителей R¹*, R², R³*, R⁵, R⁵*, R⁶ и R⁶* независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-12-алкила, необязательно замещенного C_2-12-алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, гидрокси, C_1-12 -алкокси, C_2-12-алкенилокси, карбокси, C_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(C_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)аминокарбонила, амино-С_1-6 -алкиламинокарбонила, моно- и ди(C_1-6-алкил)амино-С _1-6-алкиламинокарбонила, C_1-6-алкилкарбонил-амино, карбамидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, C_1-6 -алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6 -алкилтио, галогена, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя вместе могут обозначать оксо, тиоксо, имино или необязательно замещенный метилен, или вместе они могут образовывать спиро-бирадикал, состоящий из алкиленовой цепи, включающей 1-5 атомов углерода, которая необязательно содержит внутри и/или на конце один/одну или более гетероатомов/групп, выбираемых из -О-, -S- и -(NR^H)-, где R^H выбирают из водорода и C_1-4-алкила и где два соседних (негеминальных) заместителя могут обозначать дополнительную связь, приводящую к образованию двойной связи;

и R^H *, если он имеется и не включен в бирадикал, выбирают из водорода и C_1-4-алкила;

и к их основным солям и кислым аддитивным солям;

при условии, что любая химическая группа (включающая любое нуклеотидное основание), которая является реакционноспособной в условиях, преобладающих при синтезе олигонуклеотидов, представляет собой необязательно защищенную функциональную группу.

Настоящее изобретение также относится к использованию нуклеозидных аналогов (L-рибо-ЗНК) для получения олигомеров и к использованию олигомеров, а также нуклеозидных аналогов (L-рибо-ЗНК) в диагностике, молекулярно-биологических исследованиях и в терапии.

Подробное описание изобретения

В контексте настоящего описания термин «L-рибо-ЗНК» (закрытые нуклеозидные аналоги в L-рибо-конфигурации) относится к бициклическим нуклеозидным аналогам в L-рибо-конфигурации, которые либо включены в олигомер согласно настоящему изобретению (основная формула I), либо представляют собой отдельный химический вид (общая формула II). Термин «мономерный L-рибо-ЗНК» конкретно относится к последнему случаю.

Олигомеры и нуклеозидные аналоги

Как указывалось выше, настоящее изобретение относится, в числе других объектов, к новым олигомерам (олигонуклеотидам), включающим один или более бициклических нуклеозидных аналогов в L-рибо-конфигурации (далее в описании называемых «L-рибо-ЗНК»).

Каждый из возможных L-рибо-ЗНК, включенных в олигомер (олигонуклеотид), имеет общую формулу I:

где Х выбирают из -О- (L-рибофуранозный мотив), -S-, -М(R ^N*)-, -C(R⁶R^6*)-, где R ⁶, R^6* и R^N* определены ниже. Таким образом, L-рибо-ЗНК, включенные в олигомер, содержат 5-членное кольцо в качестве обязательной части бициклической структуры.

Среди возможных 5-членных колец очень интересной является ситуация, когда Х обозначает -О-, -S- и -N(R^N*), а ситуация, когда Х обозначает -О-, представляется особенно интересной.

Заместитель В может обозначать группу, которая, в том случае когда олигомер образует комплекс с ДНК или РНК, способна взаимодействовать (например, с помощью водородных связей, или ковалентных связей, или посредством электронного взаимодействия) с ДНК или РНК, в особенности с нуклеотидными основаниями ДНК или РНК. Альтернативно, заместитель В может обозначать группу, которая действует как метка или репортер, или заместитель В может обозначать группу (например, водород), которая, как ожидается, будет в незначительной мере взаимодействовать с ДНК или РНК, или взаимодействие вообще не будет иметь места. Так, заместитель В предпочтительно выбирают из водорода, гидрокси, необязательно замещенного С_1-4-алкокси, необязательно замещенного C_1-4-алкила, необязательно замещенного C_1-4 -ацилокси, нуклеотидных оснований, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов.

В контексте настоящего описания термин «нуклеотидное основание» охватывает как природные нуклеотидные основания, так и неприродные нуклеотидные основания. Каждому специалисту со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что различные нуклеотидные основания, которые ранее рассматривались как неприродные, впоследствии были найдены в природе. Таким образом, термин «нуклеотидные основания» включает не только известные пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но также аналоги гетероциклических соединений и их таутомеры. Репрезентативные примеры нуклеотидных оснований включают аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N⁶-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N⁴,N⁴-этаноцитозин, N ⁶,N⁶-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(С³-С⁶)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и «неприродные» нуклеотидные основания, описанные в патенте США No. 5432272 (Benner et al.). Термин «нуклеотидное основание» охватывает все приведенные примеры, а также их аналоги и таутомеры. Особенно интересными нуклеотидными основаниями являются аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые рассматриваются как природные нуклеотидные основания в контексте их терапевтического и диагностического использования у людей.

В контексте настоящего описания термин «интеркалятор ДНК» означает группу, которая может интеркалироваться в спираль, дуплекс или триплекс ДНК или РНК. Примеры функциональных частей интеркаляторов ДНК включают акридины, антрацены, хиноны, такие как антрахинон, индол, хинолин, изохинолин, дигидрохиноны, антрациклины, тетрациклины, метиленовый синий, антрациклинон, псоралены, кумарины, этидий-галогениды, динемицин, комплексы металлов, такие как 1,10-фенантролин-медь, трис(4,7-дифенил-1,10-фенантролин)рутений-кобальт-энедиины, такие как калхеамицин, порфирины, дистамицин, нетропцин, виологен, дауномицин. Особенно интересными примерами являются акридины, хиноны, такие как антрахинон, метиленовый синий, псоралены, кумарины и этидий-галогениды.

В контексте настоящего описания термин «фотохимически активные группы» охватывает соединения, способные подвергаться химическим реакциям при облучении светом. Наглядными примерами функциональных групп таких соединений являются хиноны, особенно 6-метил-1,4-нафтохинон, антрахинон, нафтохинон и 1,4-диметил-антрахинон, диазирины, ароматические азиды, бензофеноны, псоралены, диазосоединения и диазириносоединения.

В контексте настоящего описания термин «термохимически реактивная группа» означает функциональную группу, которая при термохимической индукции способна образовывать ковалентную связь с другими группами. Наглядными примерами функциональных частей термохимически активных групп являются карбоновые кислоты, сложные эфиры карбоновых кислот, такие как активированные сложные эфиры, галоидангидриды карбоновых кислот, такие как фторангидриды, хлорангидриды, бромангидриды и иодангидриды, а также азиды карбоновых кислот, гидразиды карбоновых кислот, сульфоновые кислоты, сложные эфиры сульфоновых кислот, галоидангидриды сульфоновых кислот, семикарбазиды, тиосемикарбазиды, альдегиды, кетоны, первичные спирты, вторичные спирты, третичные спирты, фенолы, алкилгалогениды, тиолы, дисульфиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, гидразины, эпоксиды, малеимиды и производные бороновой кислоты.

В контексте настоящего описания термин «хелатирующая группа» означает молекулу, которая включает более одного сайта связывания и зачастую соединяется с другой молекулой, другим атомом или другим ионом посредством более чем одного связывающего сайта в одно и то же время. Примеры функциональных частей хелатирующих групп включают иминодиуксусную кислоту, нитрилотриуксусную кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), аминофосфоновую кислоту и др.

В контексте настоящего описания термин «репортерная группа» означает группу, которая обнаруживается либо сама по себе, либо как часть обнаруживаемой серии. Примеры функциональных частей репортерных групп включают биотин, дигоксигенин, флуоресцентные группы (группы, способные абсорбировать электромагнитное излучение, например, свет или рентгеновские лучи с определенной длиной волны, с последующей повторной эмиссией поглощенной энергии в виде излучения с большей длиной волны; наглядные примеры включают дансил (5-диметиламино)-1-нафталинсульфонил), DOXYL (N-оксил-4,4-диметилоксазолидин), PROXYL (N-оксил-2,2,5,5-тетраметилпирролидин), TEMPO (N-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидин), динитрофенил, акридины, кумарины, Сy3 и Сy5 (торговые марки Biological Detection Systems, Inc.), эритрозин, кумаровую кислоту, умбеллиферон, техасский красный (Texas Red), родамин, тетраметил-родамин, рокс (Rox), 7-нитробензо-2-окса-1-диазол (НБД), пирен, флуоресцеин, европий, рутений, самарий и другие редкоземельные металлы), радиоизотопные метки, хемилюминесцентные метки (метки, обнаруживаемые за счет эмиссии света во время химической реакции), спиновые метки (свободные радикалы (например, замещенные органические нитроксиды) или другие парамагнитные зонды (например, Cu²⁺, Mg²⁺ ), которые при связывании с биологической молекулой делают ее обнаруживаемой при использовании спектроскопии электронного парамагнитного резонанса), ферменты (такие как пероксидазы, щелочные фосфатазы, -галактозидазы и глюкозооксидазы), антигены, антитела, гаптены (группы, способные соединяться с антителом, но которые сами по себе не вызывают иммунного ответа, такие как пептиды и стероидные гормоны), системы носителей для проникновения через клеточную мембрану, такие как остатки жирных кислот, стероидные группы (холестерин), витамин А, витамин D, витамин Е, фолиевая кислота, пептиды для специфических рецепторов, группы, опосредующие эндоцитоз, эпидермальный фактор роста (EGF), брадикинин и фактор роста тромбоцитов (PDGF). Особенно интересные примеры включают биотин, флуоресцеин, техасский красный, родамин, динитрофенил, дигоксигенин, рутений, европий, Сy5 и Сy3.

В контексте настоящего описания термин «лиганд» означает группу, которая может связываться с чем-либо. Лиганды могут включать функциональные группы, такие как ароматические группы (такие как бензол, пиридин, нафталин, антрацен и фенантрен), гетероароматические группы (такие как тиофен, фуран, тетрагидрофуран, пиридин, диоксан и пиримидин), карбоновые кислоты, сложные эфиры карбоновых кислот, галогениды карбоновых кислот, азиды карбоновых кислот, гидразиды карбоновых кислот, сульфоновые кислоты, сложные эфиры сульфоновых кислот, галогениды сульфоновых кислот, семикарбазиды, тиосемикарбазиды, альдегиды, кетоны, первичные спирты, вторичные спирты, третичные спирты, фенолы, алкилгалогениды, тиолы, дисульфиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, гидразины, эпоксиды, малеинимиды, C₁-C₂₀-алкильные группы, необязательно включающие внутри группы или на ее конце один или более гетероатомов, таких как атомы кислорода, атомы азота и/или атомы серы, необязательно включающие ароматические или моно/полиненасыщенные углеводороды, полиоксиэтилен, такой как полиэтиленгликоль, олиго/полиамиды, такие как поли--аланин, полиглицин, полилизин, пептиды, олиго/полисахариды, олиго/полифосфаты, токсины, антибиотики, клеточные яды и стероиды, а также «аффинные лиганды», т.е. функциональные группы или биомолекулы, которые обладают специфической аффинностью в отношении сайтов на определенных белках, антителах, поли- и олигосахаридах и других биомолекулах.

Для любого специалиста в данной области очевидно, что указанные выше конкретные примеры интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов соответствуют «активной/функциональной» части рассматриваемых групп. Для специалистов в данной области также ясно, что интеркаляторы ДНК, фотохимически активные группы, термохимически активные группы, хелатирующие группы, репортерные группы и лиганды в типичном случае находятся в М-К-форме, где М обозначает «активную/функциональную» часть рассматриваемой группы, а К обозначает спейсер, через который указанная «активная/ функциональная» часть присоединяется к 5-членному кольцу. Таким образом, следует понимать, что группа В в том случае, когда В выбирают из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, имеет форму М-К-, где М обозначает «активную/функциональную» часть интеркалятора ДНК, фотохимически активной группы, термохимически активной группы, хелатирующей группы, репортерной группы и лиганда, соответственно, и где К обозначает необязательный спейсер, включающий 1-50 атомов, предпочтительно 1-30 атомов, в частности 1-15 атомов, между 5-членным кольцом и «активной/функциональной» частью молекулы.

В контексте настоящего описания термин «спейсер» означает фотохимически и термохимически неактивную группу, которая выполняет функцию пространственного дистанцирования при соединении двух или более различных групп указанного выше типа. Спейсеры выбирают с учетом множества характеристик, включая гидрофобность, гидрофильность, гибкость их молекул и длину (см., в частности, Hermanson et al., «Immobilized Affinity Ligand Techniques», Academic Press, San Diego, California (1992), p.137-ff). В основном длина спейсера составляет менее чем примерно 400 , в случае некоторых применений предпочтительно, чтобы длина была меньше 100 . Таким образом, спейсер включает цепь углеродных атомов, необязательно содержащую внутри или на конце один или более гетероатомов, таких как атомы кислорода, атомы азота и/или атомы серы. Таким образом, спейсер К может включать одну или более амидных, сложноэфирных, амино, эфирных и/или тиоэфирных функциональных групп и необязательно ароматические или моно/полиненасыщенные углеводороды, полиоксиэтилен, такой как полиэтиленгликоль, олиго/полиамиды, такие как поли-р-аланин, полиглицин, полилизин, и пептиды в целом, олигосахариды, олиго/полифосфаты. Кроме того, спейсер может состоять из объединенных единиц. Длина спейсера может варьировать, в зависимости от его желательного или необходимого положения и пространственной ориентации «активной/функциональной» части рассматриваемой группы относительно 5-членного кольца. В особенно интересных вариантах реализации настоящего изобретения спейсер включает химически расщепляемую группу. Примеры таких химически расщепляемых групп включают дисульфидные группы, расщепляемые в восстановительных условиях, пептидные фрагменты, расщепляемые пептидазами, и др.

В одном варианте реализации настоящего изобретения К обозначает одинарную связь, так что «активная/функциональная» часть рассматриваемой группы присоединяется непосредственно к 5-членному кольцу.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения заместитель В в основных формулах I и II предпочтительно выбирают из нуклеотидных оснований, в частности из аденина, гуанина, тимина, цитозина и урацила.

В олигомерах согласно настоящему изобретению (формула I) Р обозначает положение радикала в межнуклеозидной связи с последующим мономером или 5'-концевую группу. Первый вариант имеет место в том случае, когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК не является 5'-концевым «мономером», тогда как последний вариант применим в том случае, когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК представляет собой 5'-концевой «мономер». Следует понимать (что также очевидно из приведенного ниже определения межнуклеозидной связи и 5'-концевой группы), что такая межнуклеозидная связь или 5'-концевая группа могут включать заместитель R⁵ (или равноприемлемый заместитель R^5*), образуя таким образом двойную связь с группой Р. (5'-конец относится к положению, соответствующему 5'-атому углерода в рибозной группе нуклеозида).

С другой стороны Р^* обозначает положение радикала в межнуклеозидной связи с предшествующим мономером или 3'-концевую группу. Аналогично, первый вариант относится к тому случаю, когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК не является 3'-концевым «мономером», тогда как последний вариант имеет место в том случае, когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК представляет собой 3'-концевой «мономер» (3'-конец относится к положению, соответствующему 3'-атому углерода в рибозной группе в нуклеозиде).

В контексте настоящего описания термин «мономер» относится к природным нуклеозидам, неприродным нуклеозидам, ПНК, ЗНК, а также к L-рибо-ЗНК. Таким образом, термин «последующий мономер» относится к соседнему мономеру в направлении 5'-конца, и термин «предшествующий мономер» относится к соседнему мономеру в направлении 3'-конца. Такие последующий и предшествующий мономеры с точки зрения положения L-рибо-ЗНК мономера могут быть представлены природными нуклеозидами или неприродными нуклеозидами или даже L-рибо-ЗНК мономерами.

Следовательно, в контексте настоящего описания (как можно видеть из приведенных выше определений) термин «олигомер» означает олигонуклеотид, модифицированный за счет включения одного или более L-рибо-ЗНК.

Важнейшей частью настоящего изобретения является L-рибо-конфигурация комбинированного 5-членного кольца, при условии, что R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, образующий слитое кольцо на 5-членном кольце.

В группах, составляющих бирадикал(ы), Z выбирают из -О-, -S- и -N(R^a)-, и R^a и R^b, каждый, независимо, выбирают из водорода, необязательно замещенного C _1-12-алкила, необязательно замещенного С_2-12 -алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, гидрокси, C_1-12-алкокси, С_2-12-алкенилокси, карбокси, C_1-12-алкоксикарбонила, C_1-12 -алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)аминокарбонила, амино-С_1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди (C _1-6-алкил) амино-С_1-6-алкиламинокарбонила, C _1-6-алкилкарбонил-амино, карбамидо, C_1-6 -алканоилокси, сульфоно, C_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6-алкилтио, галогена, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов (причем последние группы могут включать спейсер, определенный для заместителя В), где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены. Кроме того, два геминальных заместителя R^a и R^b вместе могут обозначать необязательно замещенный метиленолефин (=СН₂, необязательно замещенный в одном или двух положениях заместителями, определенными для случая необязательных заместителей арила).

В контексте настоящего изобретения, то есть в контексте описания и формулы изобретения, ориентация бирадикалов такова, что левая сторона отображает заместитель с наименьшим числом, и правая сторона отображает заместитель с наибольшим числом, так что, когда R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал «-О-СН₂-», следует понимать, что атом кислорода соответствует R^2* и метиленовая группа соответствует R^4*.

С точки зрения возможностей, предоставляемых структурой бирадикала(ов) в L-рибо-ЗНК, включаемых в олигомеры согласно настоящему изобретению, считается, что бирадикалы, составленные парой(ами) негеминальных заместителей, предпочтительно выбирают из - (CR^*R^*)_r-Y-(CR ^*R^*)_s-, -(CR^*R ^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s -Y-, -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-, -Y-(CR ^*R^*)_r-Y-(CR^*R ^*)_s-, -(CR^*R^*)_r+s -, -Y-, -Y-Y-, где каждый Y независимо выбирают из -О-, -S-, -Si(R^*)₂-, -N(R^*)-, >С=O, -C(=O)-N(R^*)- и -N(R^*)-С(=O)-, где каждый R^* независимо выбирают из водорода, галогена, азидо, циано, нитро, гидрокси, меркапто, амино, моно- или ди(С_1-6 -алкил)амино, необязательно замещенного C_1-6 -алкокси, необязательно замещенного C_1-6-алкила, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, и/или два соседних (негеминальных) R^* могут вместе обозначать двойную связь и каждый r и s обозначает 0-4, при условии, что сумма r+s равна 1-4. Особенно интересными являются ситуации, в которых каждый бирадикал независимо выбирают из -Y-, -(CR^* R^*)_r+s-, -(CR^*R^*) _r-Y-(CR^*R^*)_s- и -Y-(CR ^*R^*)_r+s-Y-, где каждый r и s обозначает 0-3, при условии, что сумма r+s составляет 1-4.

Особенно интересными олигомерами являются те, которые удовлетворяют следующим критериям, применяемым к L-рибо-ЗНК в олигомерах: R ^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -О-, -S-, -N(R^*)-, -(CR^*R^* )_r+s+l-, -(CR^*R^*)_r -O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^* R^*)_r-S- (CR^*R^*) _s-, -(CR^*R^*)_r-N(R ^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR ^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R ^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*) _r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*) _r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s -N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s -S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s -N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^* )_r+s-S- и -S-(CR^*R^*)_r+s -N(R^*) -, где каждый r и s обозначает 0-3, при условии, что сумма r+s составляет 1-4, и где R^* выбирают из водорода, гидрокси, необязательно замещенного C_1-6 -алкокси, необязательно замещенного С_1-6-алкила, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, и остальные заместители R^* представляют собой водород.

В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения одну группу R^* в бирадикале по меньшей мере одного ЗНК выбирают из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов (при этом последние группы могут включать спейсер, определенный для заместителя В).

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения одну группу R^* в бирадикале по меньшей мере одного ЗНК выбирают из водорода, гидрокси, необязательно замещенного C_1-6-алкокси, необязательно замещенного C_1-6-алкила, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, и любые оставшиеся заместители R^* представляют собой водород.

Имеющиеся заместители R ^1*, R², R^3*, R⁵, R ^5*, R⁶ и R^6* выбирают независимо из водорода, необязательно замещенного C_1-12-алкила, необязательно замещенного С_2-12-алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, гидрокси, C_1-12 -алкокси, С_2-12-алкенилокси, карбокси, C_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди (C_1-6-алкил) аминокарбонила, амино-С_1-6 -алкиламинокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил) амино-С _1-6-алкиламинокарбонила, C_1-6-алкилкарбониламино, карбамидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, C_1-6 -алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, C_1-6 -алкилтио, галогена, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов (причем последние группы могут включать спейсер, определенный для заместителя В), где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя вместе могут обозначать оксо, тиоксо, имино или необязательно замещенный метилен, или вместе они могут образовывать спиро-бирадикал, состоящий из алкиленовой цепи, состоящей из 1-5 атомов углерода, которая может необязательно содержать внутри и/или на конце один/одну или более гетероатомов/групп, выбранных из -О-, -S- и -(NR ^N)-, где R^N выбирают из водорода и C_1-4 -алкила и где два соседних (негеминальных) заместителя могут обозначать дополнительную связь, приводящую к образованию двойной связи; и R^N*, если присутствует, выбирают из водорода и C_1-4-алкила.

Предпочтительно каждый из заместителей R^1*, R², R^3* , R⁵, R^5*, R⁶ и R^6* в L-рибо-ЗНК, в случае их наличия, независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила, гидрокси, C_1-6 -алкокси, С_2-6-алкенилокси, карбокси, C_1-6 -алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(C _1-6-алкил)аминокарбонила, C_1-6-алкилкарбониламино, карбамидо, азидо, C_1-6-алканоилокси, сульфоно, сульфанила, C_1-6-алкилтио, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, а также галогена, причем два геминальных заместителя вместе могут образовывать оксо, и R^N*, в случае его наличия, выбирают из водорода и C_1-4-алкила.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения Х выбирают из -О-, -S- и -NR^N*-, в частности -О-, и каждый из заместителей R^1*, R², R ^3*, R⁵, R^5*, R⁶ и R ^6* в L-рибо-ЗНК, в случае их наличия, обозначает водород.

В еще более предпочтительном варианте реализации изобретения Х обозначает О, заместители R^1*, R², R ³, R⁵ и R^5* обозначают водород, и R^2* и R^4* в L-рибо-ЗНК, включенном в олигомер, вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -О-, -(СН₂ )_0-1-О-(CH₂)_1-3-, -(СН₂ )_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH ₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂) _1-3- и -(СН₂)_2-4-, в частности из -O-СН₂-, -S-CH₂- и -NR^H-CH ₂-. В основном, в соответствии с полученными результатами, предпочтительно, чтобы бирадикал, содержащий R^2* и R^4*, образовывал двухатомный мостик, т.е. чтобы радикал образовывал пятичленное кольцо с фуранозным кольцом (Х=O).

В одном предпочтительном варианте реализации изобретения бирадикал представляет собой -(СН₂)_2-4.

В случае указанных вариантов реализации изобретения предпочтительно, чтобы L-рибо-ЗНК имел/имели следующую общую структуру Ia:

В качестве отдельного аспекта настоящего изобретения рассматривается также вариант формулы Ia, в которой В находится в «-конфигурации».

Олигомеры согласно настоящему изобретению в типичном случае включают 1-10000 L-рибо-ЗНК общей формулы I (или более детализированной общей формулы Ia) и 0-10000 нуклеозидов, выбранных из природных нуклеозидов и нуклеозидных аналогов. Суммарное число нуклеозидов и L-рибо-ЗНК (n) составляет по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, в частности по меньшей мере 5, особенно по меньшей мере 7, и находится, например, в таком диапазоне, как 2-15000, предпочтительно в диапазоне 2-100, таком как 3-100, в частности в диапазоне 2-50, таком как 3-50 или 5-50 или 7-50.

Было обнаружено, что частично L-рибо-ЗНК модифицированные олигомеры обладают способностью к сильной гибридизации (с повышенной аффинностью) с ДНК и РНК. В настоящее время считается, что полностью модифицированные L-рибо-ЗНК олигомеры и олигомеры, состоящие из L-рибо-ЗНК мономеров вместе с другими нуклеотидными аналогами в L-рибо-конфигурации, приводят к повышению гибридизационных свойств до сравнимых величин.

В контексте настоящего описания термин «нуклеозид» обозначает гликозид гетероциклического основания. Термин «нуклеозид» используется в широком смысле и включает неприродные нуклеозиды, природные нуклеозиды, а также другие нуклеозидные аналоги.

Наглядные примеры нуклеозидов включают рибонуклеозиды, содержащие рибозную группу, а также дезоксирибонуклеозиды, содержащие дезоксирибозную группу. Относительно оснований таких нуклеозидов следует также отметить, что они могут представлять собой любое природное основание, например аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил, а также любые их модифицированные варианты или любые возможные неприродные основания.

Что касается известных нуклеозидов (природных и неприродных) и нуклеозидных аналогов (включая известные би- и трициклические аналоги), то из данных определений очевидно, что олигомер может включать один или более L-рибо-ЗНК (которые могут быть одинаковыми или отличаться с точки зрения выбора заместителя и с точки зрения выбора бирадикала) и один или более нуклеозидов и/или нуклеозидных аналогов. В контексте настоящего описания термин «олигонуклеотид» обозначает последовательную цепь нуклеозидов, соединенных с помощью межнуклеозидных связей, однако следует понимать, что нуклеотидное основание в одной или большем числе нуклеотидных единиц (мономеров) в олигомере (ологонуклеотиде) может быть модифицировано с помощью заместителя В, как определено выше.

Олигомеры могут быть линейными, разветвленными или циклическими. В случае разветвленного олигомера точки разветвления могут быть расположены в нуклеозиде, в межнуклеозидной связи или, в случае наиболее интересного варианта реализации изобретения, в L-рибо-ЗНК. Можно полагать, что в последнем варианте заместители R² и R³* могут обозначать группу Р*, показывающую межнуклеозидную связь с предшествующим мономером, в частности R² обозначает последующий Р*.

Как указывалось выше, L-рибо-ЗНК олигомера связаны с другими мономерами через межнуклеозидную связь. В контексте настоящего описания термин «межнуклеозидная связь» означает связь, состоящую из 2-4, предпочтительно 3, групп/атомов, выбираемых из -СН₂-, -О-, -S-, -NR ^H-, >C=O, >C=NR^H, >C=S, -Si(R'') ₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -РО(ВН₃)-, -P(O,S)-, -Р(S)₂-, -PO(R'')-, -РО(ОСН₃)- и -PO(NHR^H)-, где R^H выбирают из водорода и C_1-4-алкила, и R'' выбирают из C_1-6-алкила и фенила. Наглядными примерами таких межнуклеозидных связей являются -СН₂-СН ₂-СН₂-, -СН₂-СО-СН₂-, -СН₂-СНОН-СН₂-, -О-СН₂-О-, -O-СН ₂-СН₂-, -O-СН₂-СН= (включая R⁵, в случае использования в качестве связи с последующим мономером), -СН₂-СН₂-O-, -NR^H -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂ -NR^H-, -CH₂-NR^H-CH₂ -, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -NR ^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, -NR^H -CS-NR^H-, -NR^H-C-(=NR^H)-NR ^H-, -NR^H-CO-CH₂-NR^H-, -O-CO-O-, -O-CO-СН₂-O-, -O-СН₂-СО-O-, -CH ₂-CO-NR^H-, -O-CO-NR^H-, -NR ^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H -, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CH=N-O-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-O-N= (включая R⁵, в случае использования в качестве связи с последующим мономером), -CH₂-O-NR^H-, -CO-NR^H -CH₂-, -CH₂-NR^H-O-, -CH ₂-NR^H-CO-, -O-NR^H-CH₂-, -O-NR^H-, -O-CH₂-S-, -S-CH₂-O-, -CH₂-CH₂-S-, -O-CH₂-CH₂ -S-, -S-CH₂-CH= (включая R⁵, в случае использования в качестве связи с последующим мономером), -S-СН ₂-СН₂-, -S-CH₂-CH₂ -O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-S-CH ₂-, -CH₂-SO-CH₂-, -CH₂ -SO₂-CH₂-, -O-SO-O-, -O-S(O)₂ -O-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂ -NR^H-, -NR^H-S(O)₂-СН₂ -, -O-S(O)₂-СН₂-, -O-Р(O)₂-O-, -O-Р(O, S)-О-, -O-Р(S)₂-O-, -S-Р(O)₂-O-, -S-Р(O, S)-O-, -S-Р(S)₂-O-, O-Р(О)₂-S-, -O-Р(O, S)-S-, -O-Р(S)₂-S-, -S-Р(O)₂-S-, -S-P(O, S)-S, -S-Р(S)₂-S-, -O-PO(R^'' )-O-, -O-РО(ОСН₃)-O-, -O-РО(ОСН₂СН ₃)-О-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-РО(ВН ₃)-O, -O-PO(NHR^N)-O-, -O-Р(О)₂ -NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O, NR^H)-O-, -СН₂-Р(O)₂-O-, -O-Р(О) ₂-СН₂- и O-Si(R'')₂-O-; среди которых особенно предпочтительны -CH₂-CO-NR ^H-, -CH₂-NR^H-O-, -S-CH₂ -O-, -O-Р(О)₂-O-, -O-Р(О, S)-О-, -O-Р(S)₂ -O-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O, NR^H )-O-, -O-РО(R^'')-О-, -O-РО(СН₃)-О- и -O-РО (NHR^N) -О-, где R^H выбирают из водорода и C_1-4-алкила и R^H выбирают из C_1-6-алкила и фенила. Другие наглядные примеры даны в работе Mesmaeker et al., Current Opinion in Structural Biology 1995, 5, 343-355. Левая сторона межнуклеозидной связи соединяется с 5-членным кольцом в качестве заместителя Р*, тогда как правая сторона связи соединяется с 5'-положением предшествующего мономера.

Из вышеуказанного также ясно, что группа Р может также обозначать 5'-концевую группу, в том случае когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК представляет собой 5'-концевой мономер. Примеры таких 5'-концевых групп включают водород, гидрокси, необязательно замещенный С_1-6-алкил, необязательно замещенный C _1-6-алкокси, необязательно замещенный C_1-6-алкилкарбонилокси, необязательно замещенный арилокси, монофосфат, дифосфат, трифосфат и -W-A', где W выбирают из -О-, -S- и -N(R^H)-, где R^H выбирают из водорода и С_1-6-алкила, и где А' выбирают из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов (при этом последние группы могут включать спейсер, определенный для заместителя В).

В контексте настоящего описания и формулы изобретения термины «монофосфат», «дифосфат» и «трифосфат» означают группы формул -O-Р(O)₂-O ^-, -O-Р(O)₂-O-Р(O)₂-O^- и -O-Р(O)₂-O-Р(O)₂-O-Р(O)₂-O ^-, соответственно.

В особенно интересном варианте реализации изобретения группа Р обозначает 5'-концевые группы, выбираемые из монофосфата, дифосфата и трифосфата. Вариант трифосфата особенно интересен в качестве субстрата, такого как ферменты, в особенности действующие на нуклеиновые кислоты.

Аналогично, группа Р^* может обозначать 3'-концевую группу в том случае, когда рассматриваемый L-рибо-ЗНК представляет собой 3'-концевой мономер. Примеры таких 3'-концевых групп включают водород, гидрокси, необязательно замещенный C_1-6 -алкокси, необязательно замещенный C_1-6-алкилкарбонилокси, необязательно замещенный арилокси и -W-A', где W выбирают из -О-, -S- и -N(R^H)-, где R^H выбирают из водорода и C_1-6-алкила, и где А' выбирают из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов (при этом последние группы могут включать спейсер, определенный для заместителя В).

В предпочтительном варианте реализации изобретения олигомер имеет следующую формулу III:

где

q обозначает 1-50;

каждый из n(0),..., n(q) обозначает независимо 0-10000;

каждый из m(1),..., m(q) обозначает независимо 1-10000;

при условии, что сумма n(0),..., n (q) и m(1),..., m(q) составляет 2-15000;

G обозначает 5'-концевую группу;

каждый Nu независимо обозначает нуклеозид, выбираемый из природных нуклеозидов и нуклеозидных аналогов;

каждый L-рибо-ЗНК независимо обозначает нуклеозидный аналог;

каждый L независимо обозначает межнуклеозидную связь между двумя группами, выбираемыми из Nu и L-рибо-ЗНК, или L вместе с G* обозначает 3'-концевую группу; и каждый (L-рибо-ЗНК)-L независимо обозначает нуклеозидный аналог общей формулы I, определенной выше, или предпочтительно общей формулы Ia, определенной выше.

Указанный вариант, а также в целом настоящее изобретение представляет возможность включения L-рибо-ЗНК с различными нуклеотидными основаниями, в частности с нуклеотидными основаниями, выбираемыми из тимина, цитозина и урацила, а также с нуклеотидными основаниями, выбираемыми из аденина и гуанина. Олигомер может включать, в одном варианте, по меньшей мере один L-рибо-ЗНК, в котором В (в формуле I или Ia) выбирают из группы, включающей аденин и гуанин, и по меньшей мере один L-рибо-ЗНК, в котором В выбирают из группы, включающей тимин, цитозин и урацил.

Настоящее изобретение охватывает, кроме определенных выше олигомеров, также мономерные L-рибо-ЗНК, используемые, например, при получении олигомеров с целью дальнейшего использования их в качестве субстратов, например, полимераз нуклеиновых кислот, полинуклеотидкиназ, терминальных трансфераз, а также в качестве лекарственных средств (подробнее см. ниже). Мономерные L-рибо-ЗНК (особенно в том, что касается возможных бирадикалов) соответствуют в основном структуре L-рибо-ЗНК, определенным в качестве составных частей олигомеров. Однако в том, что касается групп Р и Р^*, мономерные L-рибо-ЗНК несколько отличаются от случая вхождения в виде составных частей олигомеров, что будет объяснено позже. Кроме того, мономерные L-рибо-ЗНК могут включать защитные функциональные группы, особенно в тех случаях, когда мономерные L-рибо-ЗНК включают в олигомеры путем химического синтеза.

Изобретение также относится к мономерным L-рибо-ЗНК нуклеозидам общей формулы II:

где заместитель В выбирают из нуклеотидных оснований, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов; Х выбирают из -О-, -S-, -N(R^N*)- и -C(R⁶ R^6*)-, предпочтительно из -О-, -S-, -N(R^N* )-;

каждый из Q и Q^* независимо выбирают из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Prot-O-, Act-O-, меркапто, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-алкилтио, амино, Prot-N(R ^H)-, Act-N(R^H)-, моно- или ди (С_1-6 -алкил) амино, необязательно замещенного C_1-6 -алкокси, необязательно замещенного С_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила, необязательно замещенного С_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С _2-6-алкинила, необязательно замещенного С_2-6 -алкинилокси, монофосфата, дифосфата, трифосфата, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, гидроксиметила, Prot-O-CH₂-, Act-O-СН₂-, аминометила, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R ^H)-CH₂-, карбоксиметила, сульфонометила, где Prot обозначает защитную группу для -ОН, -SH и -NH(R^H ), соответственно. Act обозначает активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(R^H), соответственно, и R^H выбирают из водорода и С_1-6-алкила;

R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -О-, -S-, -N(R^*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR ^*R^*)_r-O-(CR^*R^* )_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR ^*R^*)_s-, -(CR^*R ^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^* )_s-, -О-(CR^*R^*)_r+s -O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR ^*R^*)_r+s-S-, -N(R^* )-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR ^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR ^*R^*)_r+s-S-, -N(R^* )-(CR^*R^*)_r+s-N(R^* )-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s -S- и -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R ^*)-, где R^* определен выше для олигомеров; и каждый заместитель из числа R^1*, R², R ^3*, R⁵ и R^5*, которые не включаются в Q или Q^*, также определен выше для олигомеров.

Мономерные L-рибо-ЗНК также включают свои основные соли и кислые аддитивные соли.

Кроме того, следует понимать, что любая химическая группа (включая любое нуклеотидное основание), которая является реакционноспособной в условиях, преобладающих в ходе химического синтеза олигонуклеотидов, представляет собой необязательно функциональную группу, защищенную с помощью известных в технике способов. Указанное положение означает, что группы, такие как гидрокси, амино, карбокси, сульфоно и меркапто группы, а также нуклеотидные основания в мономерном L-рибо-ЗНК представляют собой необязательно защищенные функциональные группы. Защиту (и удаление защитных групп) осуществляют с помощью методов, известных специалистам в данной области (см., например, Greene, Т.W. and Wuts, P.G.M., «Protective Groups in Organic Synthesis», 2 ^nd ed., John Wiley, N.Y. (1991) and M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, 1984).

Наглядными примерами защитных групп для гидроксигрупп являются необязательно замещенный тритил (Тр), такой как 4,4'-диметокситритил (ДМТ), 4-монометокситритил (ММТ) и тритил, необязательно замещенный 9-(9-фенил)ксантенил (пиксил), необязательно замещенный этоксикарбонилокси, п-фенилазофенилоксикарбонилокси, тетрагидропиранил (тгп), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), метокситетрагидропиранил (мтгп), силилокси, такой как триметилсилил (ТМС), триизопропилсилил (ТИПС), трет-бутилдиметилсилил (ТБДМС), триэтилсилил (ТЭС) и фенилдиметилсилил, а также эфиры бензилоксикарбонила или замещенного бензилоксикарбонила, такой как 2-бромбензилоксикарбонил, трет-бутиловые эфиры, алкиловые эфиры, такие как метиловый эфир, ацетали (включающие две гидроксигруппы), ацилокси, такие как ацетил- или галоген-замещенные ацетилы, например, хлорацетил или фторацетил, изобутирил, пивалоил, бензоил и замещенный бензоил, метоксиметил (MOM), бензиловые эфиры или замещенные бензиловые эфиры, такие как 2,6-дихлорбензил (2,6-Cl₂Bzl). Альтернативно, гидроксигруппа может быть защищена путем связывания с твердой подложкой, необязательно через линкер.

Наглядные примеры защитных групп для аминогрупп включают Fmoc (флуоренилметоксикарбонил), БОК (трет-бутилоксикарбонил), трифторацетил,аллилоксикарбонил (аллок, АОК), бензилоксикарбонил (Z, Cbz), замещенные бензилоксикарбонилы, такие как 2-хлорбензилоксикарбонил (2-CIZ), монометокситритил (ММТ), диметокситритил (ДМТ), фталоил и 9-(9-фенил)ксантенил (пиксил).

Наглядные примеры защитных групп для карбокси включают сложные аллиловые эфиры, сложные метиловые эфиры, сложные этиловые эфиры, сложные эфиры 2-цианоэтила, сложные эфиры триметилсилилэтила, сложные бензиловые эфиры (Obzl), сложные эфиры 2-адамантила (O-2-Ada), сложные циклогексиловые эфиры (ОсНех), 1,3-оксазолины, оксазолер, 1,3-оксазолидины, амиды или гидразиды.

Наглядными примерами защитных групп для меркаптогрупп являются тритил (Тр), ацетамидометил (ацм), триметилацетамидометил (Тацм), 2,4,6-триметоксибензил (Tmob), трет-бутилсульфенил (StBu), 9-флуоренилметил (Fm), 3-нитро-2-пиридинсульфенил (Npys) и 4-метилбензил (Меб).

Кроме того, может возникнуть необходимость или желательность во введении защитной группы для любого нуклеотидного основания, включаемого в мономерный L-рибо-ЗНК, особенно в том случае, когда мономерный L-рибо-ЗНК включается в олигомер согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего описания термин "защищенное нуклеотидное основание" означает, что рассматриваемое нуклеотидное основание несет защитную группу, выбираемую среди групп, известных специалистам в данной области (см., например, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", vol.20, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ; S.L. Beaucage and R.P.Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S.L. Beaucage and R.P.Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223; and E. Uhlmann and A. Peyman, Chem. Rev., 90, 543.). Наглядные примеры включают бензоил, изобутирил, трет-бутил, трет-бутилоксикарбонил, 4-хлор-бензилоксикарбонил, 9-флуоренилметил, 9-флуоренилметил-оксикарбонил, 4-метоксибензоил, 4-метокситрифенилметил, необязательно замещенный триазоло, п-толуолсульфонил, необязательно замещенный сульфонил, изопропил, необязательно замещенные амидины, необязательно замещенный тритил, феноксиацетил, необязательно замещенный ацил, пиксил, тетрагидропиранил, необязательно замещенные силиловые эфиры и 4-метоксибензилоксикарбонил. В литературе раскрыты другие соответствующие примеры (Chapter 1 in "Protocols for oligonucleotide conjugates", Methods in Molecular Biology, vol.26, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ. and S.L. Beaucage and R.P.Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223).

В предпочтительном варианте реализации изобретения группу В для мономерного L-рибо-ЗНК предпочтительно выбирают из нуклеотидных оснований и защищенных нуклеотидных оснований.

В одном варианте реализации настоящего изобретения в мономерном L-рибо-ЗНК согласно настоящему изобретению один из Q и Q*, предпочтительно Q*, обозначает группу, выбираемую из Act-O-, Act-S-, Act-N(R ^H)-, Act-O-CH₂-, Act-S-CH₂-, Act-N(R ^H)-CH₂-, а другой из Q и Q^*, предпочтительно Q, обозначает группу, выбираемую из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Prot-O-, меркапто, Prot-S-, C_1-6-алкилтио, амино, Prot-N(R^H)-, моно- или ди (С_1-6-алкил)амино, необязательно замещенного С_1-6-алкокси, необязательно замещенного C_1-6 алкила, необязательно замещенного С_1-6-алкенила, необязательно замещенного С_1-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинила, необязательно замещенного С_2-6 -алкинилокси, монофосфата, дифосфата, трифосфата, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, гидроксиметила, Prot-O-CH₂-, аминометила, Prot-N(R ^H)-CH₂-, карбоксиметила, сульфонометила, и R^H выбирают из водорода и С_1-6-алкила.

В описанном выше варианте группа Prot обозначает защитную группу для -ОН, -SH и -N(R^H), соответственно. Такие защитные группы выбирают из тех же групп, что были указаны выше относительно защитных групп для гидрокси, защитных групп для меркапто и защитных групп для амино, соответственно, принимая, однако во внимание необходимость стабильной и обратимой защитной группы. Однако, предпочтительно, чтобы любая защитная группа для -ОН была выбрана из необязательно замещенного тритила, такого как диметокситритил (ДМТ), монометокситритил (ММТ) и тритил, а также 9-(9-фенил)ксантенила (пиксила), необязательно замещенного, тетрагидропиранила (тгп) (другие приемлемые защитные группы для гидрокси при фосфорамидитном синтезе олигонуклеотидов описаны в литературе: Agrawal, ed. "Protocols for Oligonucleotide Conjugates"; Methods in Molecular Biology, vol.26, Humana Press, Totowa, NJ (1994) and Protocols for Oligonucleotides and Analogs, vol.20, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ), или чтобы они были защищены в виде ацеталя; а также чтобы любая защитная группа для -SH была выбрана из тритила, такого как диметокситритил (ДМТ), монометокситритил (ММТ), и тритил, а также 9-(9-фенил)ксантенила (пиксила), необязательно замещенного, тетрагидропиранила (тгп) (другие приемлемые защитные группы для меркапто при фосфорамидитном синтезе олигонуклеотидов также описаны в литературе (Agrawal, см. выше)); и чтобы любая защитная группа для -NH(R^H) выбиралась из тритила, такого как диметокситритил (ДМТ), монометокситритил (ММТ) и тритил, а также 9-(9-фенил)ксантенила (пиксила), необязательно замещенного, тетрагидропиранила (тгп) (другие приемлемые защитные группы для аминогруппы при фосфорамидитном синтезе олигонуклеотидов описаны также в работе Агравала (Agrawal, см. выше)).

В указанном выше варианте реализации изобретения, а также в случае любого мономерного L-рибо-ЗНК, определенного в настоящем описании, Act обозначает активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(R^H), соответственно. Такие активирующие группы выбираются, например, из необязательно замещенного O-фосфорамидита, необязательно замещенного O-фосфортриэфира, необязательно замещенного O-фосфордиэфира, необязательно замещенного Н-фосфоната и необязательно замещенного O-фосфоната.

В контексте настоящего описания термин "фосфорамидит" означает группу формулы -Р(OR ^x) -N(R^У)₂, где R^x обозначает необязательно замещенную алкильную группу, например метил, 2-цианоэтил или бензил, и каждый R^y обозначает необязательно замещенные алкильные группы, например, этил или изопропил, или группа -N(R^y)₂, образует морфолиногруппу (-N(CH₂CH₂)₂ О). R^х предпочтительно обозначает 2-цианоэтил и два R^У предпочтительно идентичны и обозначают изопропил. Таким образом, особенно подходящим фосфорамидитом является N,N-диизопропил-O-(2-цианоэтил)фосфорамидит.

Следует понимать, что используемые в настоящем изобретении защитные группы для одного мономерного L-рибо-ЗНК или нескольких мономерных L-рибо-ЗНК могут выбираться таким образом, что когда указанный/указанные L-рибо-ЗНК включаются в олигомер согласно настоящему изобретению, можно проводить либо одновременное удаление защитных групп, либо последовательное удаление защитных групп от функциональных групп. Последняя ситуация открывает возможность региоселективного введения одной или нескольких "активных/функциональных" групп, таких как интеркаляторы ДНК, фотохимически активные группы, термохимически активные группы, хелатирующие группы, репортерные группы и лиганды, причем такие группы могут быть присоединены через спейсер, определенный выше.

В предпочтительном варианте реализации изобретения Q выбирают из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Prot-O-, меркапто, Prot-S-, С_1-6 -алкилтио, амино, Prot-N(R^H)-, моно- или ди (C_1-6-алкил) амино, необязательно замещенного C _1-6-алкокси, необязательно замещенного C_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила, необязательно замещенного C_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинила, необязательно замещенного C_2-6 -алкинилокси, монофосфата, дифосфата, трифосфата, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, гидроксиметила, Prot-O-CH₂-, аминометила, Prot-N(R ^H)-СН₂-, карбоксиметила, сульфонометила, где Prot обозначает защитную группу для -ОН, -SH и -NH(R ^H), соответственно, и R^H выбирают из водорода и С_1-6-алкила; и Q^* выбирают из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Act-O-, меркапто, Act-S-, C_1-6-алкилтио, амино, Act-N(R^H)-, моно- или ди(С_1-6-алкил)амино, необязательно замещенного С_1-6-алкокси, необязательно замещенного C_1-6 -алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила, необязательно замещенного С_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинила, необязательно замещенного С_2-6-алкинилокси, интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, где Act обозначает активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(R^H), соответственно, и R^H выбирают из водорода и C_2-6-алкила.

Мономерные L-рибо-ЗНК общей формулы II могут, как и L-рибо-ЗНК, входящие в состав олигомеров, иметь различные стереоизомеры. Так, стереохимические варианты, описанные выше для L-рибо-ЗНК, включаемых в олигомеры, равноприемлемы для случая мономерных L-рибо-ЗНК (однако, следует отметить, что Р должен быть затем замещен на Q).

В предпочтительном варианте реализации изобретения мономерный ЗНК имеет общую формулу IIa:

где заместители определены выше.

Кроме того, в том, что касается определения заместителей, бирадикалов, R^* и др., они включают те же самые предпочтительные варианты, что были выше определены для олигомера согласно настоящему изобретению, они также применимы в случае мономерных L-рибо-ЗНК.

В особенно интересном варианте в мономерных L-рибо-ЗНК согласно настоящему изобретению В обозначает нуклеотидное основание, предпочтительно нуклеотидное основание, выбираемое из тимина, цитозина, урацила, аденина и гуанина (в особенности, из аденина и гуанина), Х обозначает -О-, R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -(СН₂)_0-1-O-(CH₂ )_1-3-, -(СН₂)_0-1-S-(СН₂ )_1-3- и -(CH₂)_0-1-N(R ^N)-(СН₂)_1-3-, в особенности -О-СН ₂-, -S-СН₂- и -R^N-СН₂ -, где R^N выбирают из водорода и C_1-4-алкила, Q обозначает Prot-O-, Q* обозначает Act-OH, a R^1*, R², R³*, R⁵ и R^5* , каждый, обозначает водород. В указанном варианте реализации изобретения R^N может быть также выбран из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов.

В еще более интересном варианте реализации в мономерных L-рибо-ЗНК согласно настоящему изобретению В обозначает нуклеотидное основание, предпочтительно нуклеотидное основание, выбираемое из тимина, цитозина, урацила, аденина и гуанина (в особенности, из аденина и гуанина), Х обозначает -О-, R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, выбираемый из -(СН₂) _0-1-O-(СН₂)_1-3-, -(CH₂ )_0-1-S-(CH₂)_1-3- и -(СН ₂)_0-1-N(R^N)-(СН₂) _1-3-, в особенности -O-СН₂-, -S-CH₂ - и -R^N-CH₂-, где R^N выбирают из водорода и С_1-4-алкила, Q выбирают из гидрокси, меркапто, C_1-6-алкилтио, амино, моно- или ди(C _1-6-алкил)амино, необязательно замещенного C_1-6 -алкокси, необязательно замещенного С_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинилокси, монофосфата, дифосфата и трифосфата, Q^* выбирают из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, меркапто, С_1-6-алкилтио, амино, моно- или ди(С_1-6-алкил)амино, необязательно замещенного C_1-6-алкокси, необязательно замещенного С_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6 -алкенила, необязательно замещенного С_2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С_2-6-алкинила и необязательно замещенного С_2-6-алкинилокси, R^3* выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-6-алкила, необязательно замещенного С_2-6-алкенила и необязательно замещенного С_2-6-алкинила, и R^1*, R ², R⁵ и R^5*, каждый, обозначает водород. В контексте настоящего описания R^N может быть также выбран из интеркаляторов ДНК, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов.

Один объект настоящего изобретения относится к различным производным L-рибо-ЗНК для включения в олигомер в твердой фазе и/или в фазе раствора. Наглядными примерами мономеров, пригодных для включения (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(цитозин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(урацил-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(гуанин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана и (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(аденин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана с использованием фосфорамидитного подхода, фосфортриэфирного подхода и Н-фосфонатного подхода являются, соответственно, (1R,3R,4S,7R)-7-(2-цианоэтокси(диизопропиламино)фосфинокси)-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан-7-O-(2-хлорфенилфосфат) и (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан-7-O-(Н-фосфонат) и их 3-(цитозин-1-ил), 3-(урацил-1-ил), 3-(аденин-1-ил) и 3-(гуанин-1-ил) аналоги, соответственно. Кроме того, аналоги, в которых метиленокси бирадикал мономеров замещен на метилентио, метиленамино или 1,2-этиленовый бирадикал, скорее всего, также будут представлять собой особенно интересные варианты реализации настоящего изобретения. Предполагается, что аналоги метилентио и метиленамино будут применимы в той же степени, что и аналог метиленокси, и в этой связи специфическими реагентами, нужными для включения указанных(1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(цитозин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана,(1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(урацил-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(гуанин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана и (1R,3R,4S,7R)-7-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(аденин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептана, также должны рассматриваться как особенно интересные реакционноспособные мономеры согласно настоящему изобретению. Относительно метиленаминовых аналогов следует отметить, что вторичный амин может нести заместитель, выбираемый из необязательно замещенного С_1-6-алкила, такого как метил и бензил, необязательно замещенного C_1-6 -алкилкарбонила, такого как трифторацетил, необязательно замещенного арилкарбонила и необязательно замещенного гетероарилкарбонила.

Также в качестве отдельного аспекта настоящего изобретения интересным представляется вариант формулы II или IIa, где В представляет собой «-конфигурацию».

Получение мономеров

В предпочтительном варианте реализации изобретения -L-рибо-ЗНК, содержащий 2'-О,4'-С-метиленовый мостик, синтезируют с использованием следующей процедуры: бензоилирование 4-С-гидроксиметил--D-ксилофуранозы 1 (T.F.Tam and B.Fraser-Ried, Can.J. Chem., 1979, 57, 2818) дает ди-O-бензоильное производное 2, которое затем превращают в 1,2-ди-О-ацетилированную фуранозу 3 при ацетолизе с использованием 80% уксусной кислоты с последующим ацетилированием. С помощью модифицированной методики Форбрюггена (H.Vorbrüggen, K.Krolikiewicz and B.Bennua, Chem. Ber., 1981, 114, 1234; H.Vorbrüggen and G.Höfle, Chem. Ber., 1981, 114, 1256) тиминовый нуклеозид в -конфигурации 4 получают в стереоселективном режиме при силилировании in situ тимина и связывании с участием триметилсилилтрифлата. Обработка соединения 4 метоксидом натрия приводит к дезацетилированию с образованием нуклеозидного триола 5. Защита с помощью 4,4'-диметокситритила с последующим тозилированием дают 5'-O-4,4'-диметокситритил-защищенное нуклеозидное производное 7. Закрытие кольца, индуцированное основанием, дает бициклическое нуклеозидное производное 6. Дебензилирование приводит к получению бициклического нуклеозидного аналога 9, который трансформируют в фосфорамидитное производное 10 для олигонуклеотидного синтеза. Методика связывания, применяемая в этом примере, представляет собой только один из нескольких возможных подходов, что очевидно для специалистов в данной области.

В качестве альтернативного пути синтеза может быть использована процедура, показанная на фиг.3 (примеры 12-14). В соответствии с ней проводят тримезилирование нуклеозида 5 с получением нуклеозида 11, который затем может быть циклизован с помощью NaOH/EtOH/H₂O. В условиях проводимого эксперимента наблюдается сопутствующее превращение остающейся мезилокси группы в гидроксильную группу с образованием нуклеозида 12. Стандартная ДМТ-защита, приведенная в примере 14, должна привести к образованию нуклеозида 8, подходящего промежуточного соединения для синтеза фосфорамидитного производного -L-рибо-ЗНК нуклеозида 10 (фиг.2).

Описанные ниже примеры даны для иллюстрации процедур и примеров настоящего изобретения. Структуры синтезированных соединений были подтверждены с использованием 1D ЯМР.

Методы, изображенные на схемах 1, 2 и 3, могут быть аналогично использованы для синтеза -L-рибо-ЗНК нуклеозидных производных других пиримидиновых оснований, отличных от тимина, например, урацила, цитозина, 5-замещенного урацила, 5-замещенного цитозина, а также иным образом замещенных пиримидинов. Альтернативно, производные урацила могут быть превращены в соответствующие производные цитозина и производные тимина могут быть превращены в соответствующие производные 5-метилцитозина с использованием известных методов (Koshkin, A.A., Singh, S.K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Oisen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607; Obika, S., Nanbu, D., Hari, Y., Andoh, J., Morio, K., Doi, Т., Imanishi, T. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 5401).

Для синтеза -L-рибо-ЗНК нуклеозидных производных пурина может быть применено множество подходящих приемов синтеза. Следует отметить, что термин «-сторона» в применяемом ниже контексте относится к -стороне природных нуклеозидных мономеров РНК, и термин «-сторона» в применяемом ниже контексте относится к -стороне природных нуклеозидных мономеров РНК, и термины «-пуриновый нуклеозид» и -пиримидиновый нуклеозид» означают, что указанные нуклеотидные основания расположены, как и в природных нуклеозидных мономерах РНК. В качестве примера возможных путей синтеза -L-рибо-ЗНК нуклеозидных производных пурина можно указать на процедуру, включающую циклизацию аналогов в арабино-конфигурации (2'-ОН группа расположена на -стороне фуранозного кольца). Указанные нуклеозиды могут быть получены из соответствующих исходных нуклеозидов в арабино-конфигурации через 5'-окисление, альдольную конденсацию и восстановление.

Для целей указанной выше желательной циклизации должны быть подготовлены условия для осуществления манипуляций, связанных с введением защитной группы и активацией 5'-ОН группы (расположенной на -стороне фуранозного кольца). Альтернативно, в образовании нуклеозида с обратной конфигурацией 2'-атома углерода должна внести свой вклад процедура 2'-окисления 2'-OH-группы в 4'-С-гидроксиметильных производных -пуриновых рибофуранозильных нуклеозидов (при расположении в них 2'-ОН и 3'-ОН групп на -стороне фуранозного кольца и с 3'-ОН, расположенной на -стороне фуранозного кольца (или альтернативно, на -стороне фуранозного кольца) и при сопутствующей инверсии при С3') с последующим селективным восстановлением (с использованием, например, NaBH₄). Затем для проведения указанной выше желательной циклизации должны быть подготовлены условия для осуществления манипуляций, связанных с введением защитной группы и активацией 5'-ОН группы (расположенной на -стороне фуранозного кольца). Могут быть полезны и другие процедуры для проведения инверсии конфигурации 2'-атома углерода в 4'-С-гидроксиметильных производных -пуриновых рибофуранозильных нуклеозидов (при расположении в них 2'-ОН и 3'-ОН групп на -стороне фуранозного кольца и с 3'-ОН группой, расположенной на -стороне фуранозного кольца, или альтернативно, на -стороне, при осуществлении сопутствующей инверсии при С3' фуранозного кольца), например реакция Мицунобу или реакции нуклеофильного замещения 2'-O-активированных производных (например, 2'-O-мезильных, 2'-O-тозильных или 2'-O-трифторметансульфонильных производных) на O-нуклеофилы типа ацетата, бензоата, алкоксида или др. Последующее удаление защитной группы с получением 5'-гидрокси-4'-С-гидроксиметильного производного, активация с целью подготовки к циклизации (например, путем моно- или димезилирования, моно- или дитозилирования или моно- или дитрифторметансульфонирования), циклизация (после удаления, в случае необходимости, защитной группы от 2'-ОН группы) и удаление защитных групп приводят к получению желательных -L-рибо нуклеозидов. Следует отметить, что защиту пуриновых нуклеозидов следует проводить предпочтительно в целевых мономерах и что указанная процедура может быть осуществлена в ходе выбранного пути синтеза или, в виде финальной стадии процесса, посредством триметилсилилирования для защиты аминогруппы пуриновых оснований и десилилирования. Исходные 4'-С-гидроксиметильные производные -пуриновых нуклеозидов могут быть получены, в рамках одного варианта реализации изобретения, при связывании фуранозного производного 3 (фиг.1) с защищенными соответствующим образом производными аденина или гуанина в соответствии с известными методиками связывания по Форбрюггену (Vorbrüggen type) (см., например, синтез нуклеозида 4, фиг.1) (Koshkin, A.A., Singh, S.K., Nielsen, Р., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607).

Можно полагать, что инверсия указанной выше конфигурации может быть проведена на основе природных -пуриновых рибофуранозильных нуклеозидов (при расположении в них 2'-ОН группы на -стороне фуранозного кольца и 3'-ОН группы на -стороне фуранозного кольца, или, альтернативно, на -стороне, при осуществлении сопутствующей инверсии при С3' фуранозного кольца) при введении дополнительной 4'-С-гидроксиметильной группы с проведением далее известных процедур, в частности, указанных выше. Можно ожидать, что либо реакции энзиматического или химического трансгликозилирования, проводимые на основе соответствующих производных защищенных пиримидиновых нуклеозидов, либо -пиримидиновые фуранозильные нуклеозиды в арабино-конфигурации, либо 4'-С-гидроксиметил--пиримидиновые фуранозильные нуклеозиды в арабино-конфигурации, либо уже циклизованные -L-рибо-ЗНК пиримидиновые нуклеозиды относятся к возможным путям синтеза -L-рибо-ЗНК производных пуриновых нуклеозидов. Альтернативно, начиная от фуранозы или гексозы, проводят 4-С-гидроксиметилирование, инверсию конфигурации при 2-атоме углерода и циклизацию, или одну из этих процедур, или две из этих процедур (что именно нужно, зависит от исходного материала). Затем, перед циклизацией или после нее, для получения нуклеозидных производных, применяемых в синтезе -L-рибо-ЗНК пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов, после необходимых манипуляций по защите и/или активации ОН-группы, проводят связывание с различными основаниями (пуринами или пиримидинами, при необходимости, защищенными). В качестве еще одной процедуры, которая может применяться для синтеза -L-рибо-ЗНК пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов, можно указать на возможность непосредственного образования желательных нуклеотидных оснований, осуществляемого в две или более химических стадий) из соответствующего фуранозильного производного, например фуранозиламина.

В предпочтительном варианте реализации изобретения для получения мономеров пуриновых -L-3HK, например производных аденина и гуанина, могут применяться процедуры, описанные в примерах 15, 16 и 17 (фиг.4). Так, сахар 3 может быть соединен с N-6-бензоиладенином с образованием нуклеозида 13, который подвергают селективному деацетилированию и затем превращают в 2'-O-трифторметансульфонильное производное. Сопутствующая реакция с ацетатом калия дает 2'-O-ацетильное производное 14 с инверсией при С2'. После полного деацилирования, последующего удаления защитной группы от адениновой группы, селективного мезилирования двух первичных гидроксильных групп и обработки гидроксидом натрия в смеси вода:диоксан получают -L-SHK производное аденинового нуклеозида 15. ДМТ-защита нуклеозида 15 с проведением далее дебензилирования и 3'-O-фосфитилирования (Koshkin, A.A., Singh, S.K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607) представляет собой один из возможных путей получения фосфорамидитного производного 16. Дебензилирование 15 с последующей селективной ДМТ-защитой первичной гидроксильной группы и 3'-O-фосфитилирование указывают на другой вариант образования фосфорамидитного производного 16.

Все методы и процедуры, описанные выше применительно к синтезу -L-рибо-ЗНК пуриновых нуклеозидов, также приемлемы в качестве альтернативных методов синтеза -L-рибо-ЗНК пиримидиновых нуклеозидов.

Методы, описанные выше применительно к синтезу -L-рибо-ЗНК пиримидиновых и пуриновых нуклеозидов, ведут совершенно естественно к методам, применяемым для синтеза 2'-амино- и 2'-тиопроизводных -L-рибо-ЗНК нуклеозидов. В качестве примера можно указать на процедуру циклизации через воздействие 2'-амино- или 2'-тиогруппы, расположенной на -стороне фуранозного кольца, на соответствующим образом активированную 5'-ОН группу, которая должна проводиться для образования 2'-амино- и 2'-тиопроизводных -L-рибо-ЗНК пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов. Альтернативно, циклизация через воздействие 5'-амино- или 5'-тиогруппы, расположенной на Р-стороне фуранозного кольца, на соответствующим образом активированную 2'-ОН группу, расположенную на -стороне фуранозного кольца, также ведет к образованию 2'-амино- и 2'-тиопроизводных -L-рибо-ЗНК пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов. В качестве еще одного приемлемого метода можно указать на участие в образовании 2'-амино- и 2'-тиопроизводных -L-ЗНК нуклеозидов процесса циклизации соответствующим образом активированных, защищенных и пространственно ориентированных производных, например, 2'-О,5'-O-димезильных, 2'-О,5'-O-дитозильных или 2'-О,5'-O-дифторметансульфонильных нуклеозидов с использованием амино- или тиосодержащих нуклеофилов (например, бензиламина и тиоацетата калия, соответственно). Аналогично, воздействие 5'-ОН-группы, расположенной на -стороне фуранозного кольца, на соответствующим образом активированную 2'-ОН-группу, расположенную на -стороне фуранозного кольца, должно приводить к образованию родительских -L-рибо-ЗНК пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов.

Ожидается, что любой метод, используемый для олигомеризации -L-рибо-ЗНК пиримидиновых нуклеозидов, будет также успешным и в случае -L-рибо-ЗНК пуриновых нуклеозидов.

Альтернативно, любой известный метод из числа применяемых для автоматизированного синтеза или синтеза в фазе раствора олигонуклеотидов и аналогов, например фосфортриэфирный метод, Н-фосфонатный метод или любой вариант фосфорамидитного метода, используемый для олигомеризации -L-рибо-ЗНК пиримидиновых нуклеозидов, будет также приемлем.

Получение олигомеров

Линейные, разветвленные (M.GrotIi and B.S.Sproat, J.Cheni. Soc., Chem. Commun., 1995, 495; R.H.E Hudson and M.J.Damha, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2119; M.Von Büren, G.V.Petersen, K. Rasmussen, G. Brandenburg, J.Wengel and F. Kirpekar, Tetrahedron, 1995, 51, 8491) и кольцевые (G. Prakash and E.T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3523) олиго- и полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием методов полимеризации нуклеиновых кислот, известных специалистам в области органической химии. Могут также использоваться методы фосфорамидитной химии (S.L.Beaucage and R.P.Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S.L. Beaucage and R.P.Iyer. Tetrahedron, 1992, 48, 2223), а также, например, методы Н-фосфонатной химии, фосфортриэфирной химии или методы энзиматического синтеза. Стандартные условия связывания в рамках фосфорамидитного подхода были несколько изменены за счет использования гидрохлорида пиридина вместо 1H-тетразола, поскольку это более эффективный реагент для активации нуклеозидных фосфорамидитов в ходе олигонуклеотидного синтеза, что позволяет пролонгировать период связывания от 10 до 30 минут.

После синтеза желательной последовательности, удаления защитных групп и отделения от твердой подложки (отделение от твердой подложки и удаление защитных групп проводят с использованием концентрированного аммиака в метаноле при комнатной температуре в течение 12 часов) и последующей очистки с обращением фаз с помощью коммерчески доступных разовых картриджей (которая включают детритилирование) получают готовый олигомерный продукт. Альтернативно, очистка L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов может быть осуществлена с использованием разовой системы ВЭЖХ с обращением фазы и/или путем осаждения из этанола или бутанола. Капиллярный гель-электрофорез используют для подтверждения чистоты и состава синтезированных олигонуклеотидных аналогов, однако для подтверждения чистоты и состава могут быть также использованы процедуры ВЭЖХ с обращением фазы и MALDI-MS.

В основном, настоящее изобретение относится к использованию L-рибо-ЗНК, определенных в настоящем описании, для целей получения L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов. Следует понимать, что L-рибо-ЗНК модифицированные нуклеотиды могут включать нормальные нуклеозиды (например, природные нуклеозиды, такие как рибонуклеозиды и/или дезоксирибонуклеозиды), а также модифицированные нуклеозиды, отличающиеся от определенных нуклеозидов общей формулы II.

Кроме того, материал твердой подложки, который содержит иммобилизованные на нем необязательно защищенное нуклеотидное основание и необязательно 5'-ОН защищенный ЗНК, особенно интересен в качестве материала, пригодного для синтеза ЗНК модифицированных олигонуклеотидов, в тех вариантах, когда ЗНК мономер включается на 3'-конце. В этом случае материал твердой подложки представляет собой предпочтительно CPG, например, легко (коммерчески) доступный CPG материал, на котором 3'-функциональное, необязательно запущенное нуклеотидное основание и необязательно 5'-ОН защищенный ЗНК соединяют в условиях, указанных поставщиком для данного материала. Так, например, может использоваться подложка BioGenex Universial CPG Support (BioGenex, США). 5'-ОН защитной группой может быть, например, группа ДМТ. 3'-функциональная группа должна выбираться с учетом условий, применимых для рассматриваемого CPG материала.

Применения

Настоящее изобретение раскрывает удивительное открытие, в соответствии с которым производные L-рибо-ЗНК, в случае их включения в частично модифицированные олигонуклеотиды, снижают аффинность указанных модифицированных олигонуклеотидов для комплементарной ДНК и РНК в сравнении с немодифицированными олигонуклеотидами. Однако при включении в полностью L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды наблюдается резкое повышение гибридизационных свойств к комплементарным одноцепочечным ДНК и одноцепочечным РНК. -L-рибо-ЗНК - особый вариант L-рибо-ЗНК - кроме описанных свойств, обладает способностью различать при гибридизации РНК- и ДНК-мишени. В зависимости от варианта применения, использование полностью модифицированных L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов предоставляет перспективную возможность либо существенно повысить аффинность стандартного олигонуклеотида без отрицательного воздействия на специфичность (постоянный размер олигонуклеотида), либо существенно повысить специфичность без отрицательного воздействия на аффинность (снижение размера олигонуклеотида) или провести специфичную гибридизацию с РНК-мишенью.

Также считается, что L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды, кроме значительно усиленных гибридизационных способностей, демонстрируют множество полезных физико-химических свойств, присущих нормальным ДНК и РНК олигонуклеотидам. Этот перспективный перечень включает превосходную растворимость, реакцию ЗНК модифицированных олигонуклеотидов на соли, такие как хлорид натрия и хлорид тетраметиламмония, которая имитирует реакцию немодифицированных олигонуклеотидов, способность ЗНК модифицированных олигонуклеотидов действовать в качестве праймеров для множества полимераз, способность ЗНК модифицированных олигонуклеотидов действовать в качестве праймеров в целевой реакции амплификации с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, способность ЗНК модифицированных олигонуклеотидов действовать в качестве субстрата для полинуклеотидкиназы Т4, способность биотинилированных ЗНК к специфичному по последовательности захвату ПЦР ампликонов на твердой поверхности, покрытой стрептавидином, способность иммобилизованных ЗНК модифицированных олигонуклеотидов к специфичному по последовательности захвату ампликонов и очень важная способность ЗНК модифицированных олигонуклеотидов к специфичному по последовательности доступу к двухцепочечной ДНК при инвазии цепи. В этой связи любому специалисту в данной области очевидно, что указанные новые нуклеозидные аналоги представляют собой чрезвычайно полезный инструмент для улучшения в целом технологии применения олигонуклеотидов в аспекте терапии, диагностики и молекулярно-биологических исследований.

Объектом настоящего изобретения является получение мономерных L-рибо-ЗНК согласно настоящему изобретению, которые могут включаться в олигонуклеотиды с использованием процедур и оборудования, известных специалистам в области олигонуклеотидного синтеза.

Другим объектом настоящего изобретения является получение полностью или частично L-рибо-ЗНК-модифицированных нуклеотидов (олигомеров), способных гибридизоваться специфичным по последовательности способом с комплементарными олигонуклеотидами с образованием либо дуплексов, либо триплексов, обладающих существенно более высокой аффинностью, чем соответствующие комплексы, образуемые немодифицированными олигонуклеотидами.

Другим объектом настоящего изобретения является использование полностью модифицированных L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов для достижения повышенной специфичности олигонуклеотидов без отрицательного воздействия на их аффинность.

Другим объектом настоящего изобретения является получение полностью или частично модифицированных олигонуклеотидов, включающих L-рибо-ЗНК, нормальные нуклеозиды и другие нуклеозидные аналоги.

Еще одним объектом настоящего изобретения является использование высокой аффинности L-рибо-ЗНК для создания полностью модифицированных олигонуклеотидов, обладающих чрезвычайно высокой аффинностью, которые способны связываться со своими целевыми последовательностями в молекуле дцДНК путем "замещения цепи".

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение других классов L-рибо-ЗНК, которые при включении в олигонуклеотиды отличаются по аффинности от своих комплементарных нуклеозидов. Указанная цель может быть достигнута, например, при замещении нормальных нуклеотидных оснований Г, А, Т, Ц и У производными, имеющими, например, измененную картину водородных связей.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов, которые характеризуются большей устойчивостью к нуклеазам, чем их немодифицированные партнеры.

Другим объектом настоящего изобретения является получение L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов, которые при гибридизации могут различать ДНК- и РНК-мишени. Было обнаружено при измерении Т_пл, что Т_пл, -L-рибо-ЗНК в отношении комплементарных РНК олигонуклеотидов повышается на 5,7°С в связи с модификацией, в сравнении с величиной, равной всего 2,7°С на модификацию, в отношении комплементарной ДНК (как показано в примере 11, таблица 3). -L-рибо-ЗНК олигонуклеотиды будут, таким образом, иметь повышенную аффинность к РНК в сравнении с ДНК, что создает условия, а которых -L-рибс-ЗНК будет специфически гибридизоваться с данной РНК, но не с ДНК, имеющей ту же последовательность оснований. Указанная способность различать РНК и ДНК может использоваться во множестве ситуаций, описанных ниже.

Другим объектом настоящего изобретения является получение L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов, которые могут мобилизовать PHKseH.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является получение L-рибо-ЗНК, которые могут функционировать в качестве субстратов для ДНК- и РНК-полимераз, тем самым позволяя аналогам либо включаться в растущую цепь нуклеиновой кислоты, либо действовать в качестве терминаторов цепи.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение L-рибо-ЗНК, которые могут функционировать в качестве лекарственных средств. Известно много примеров нуклеозидных аналогов, используемых в терапевтических целях, и аналогичные производные нуклеозидных аналогов, раскрытых в настоящем описании, могут быть синтезированы с использованием процедур, известных в литературе (E.De Clercq, J. Med. Chem. 1995, 38, 2491; P.Herdewijn and E. De Clercq: Classical Antiviral Agents and Design of New Antiviral Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P.Krogsgaard-Larsen, T.Liljefors and U.Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p.425; I.K.Larsen: Anticancer Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P.Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors and U.Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p.460).

Было показано, что двухцепочечная РНК обладает противовирусной активностью и опухолеподавляющей активностью (Sharp et al., Eur. J. Biochem. 230(1): 97-103, 1995, Lengyel-P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(13): 5893-5, 1993, and Laurent-Crawford et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 8(2): 285-90, 1992). Вполне вероятно, что двухцепочечные ЗНК могут имитировать эффект терапевтически активных двухцепочечных РНК и, в соответствии с этим, такие двухцепочечные ЗНК имеют потенциал лекарственного применения.

В контексте настоящего описания термин "природная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновым кислотам в самом широком смысле, например к нуклеиновым кислотам, присутствующим в интактных клетках любого происхождения или вирусах, или к нуклеиновым кислотам, высвобождаемым из таких источников посредством химических или физических методов, или к нуклеиновым кислотам, получаемым из таких первичных источников путем амплификации. Природная нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной, двухцепочечной или частично двухцепочечной и может представлять собой относительно чистый тип или смесь различных нуклеиновых кислот. Она также может представлять собой компонент неочищенного биологического образца, включающего другие нуклеиновые кислоты и другие клеточные компоненты. С другой стороны, термин "синтетические нуклеиновые кислоты" относится к любой нуклеиновой кислоте, получаемой путем химического синтеза.

Настоящее изобретение также относится к использованию L-рибо-ЗНК модифицированных нуклеотидов в методах терапии, диагностики и молекулярной биологии, основанных на нуклеиновых кислотах. L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды могут использоваться для обнаружения, идентификации, захвата, характеристики, количественного определения и фрагментирования природных или синтетических нуклеиновых кислот и в качестве средств, блокирующих трансляцию и транскрипцию in vivo и in vitro. Во многих случаях может представлять интерес присоединение различных молекул к L-рибо-ЗНК модифицированным олигонуклеотидам. Указанные молекулы могут быть присоединены к любому концу олигонуклеотида, либо они могут быть присоединены в одной или большем числе внутренних позиций. Альтернативно, они могут быть присоединены к олигонуклеотиду через спейсеры, присоединяемые к 5'- или 3'-концу. Репрезентативные группы таких молекул включают интеркаляторы ДНК, фотохимически активные группы, термохимически активные группы, хелатирующие группы, репортерные группы и лиганды. В основном, все методы мечения немодифицированных олигонуклеотидов в составе ДНК и РНК с помощью указанных молекул могут также использоваться для мечения L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов. И аналогично, все методы, используемые для обнаружения меченых олигонуклеотидов, в целом применимы для соответствующим образом меченых L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов.

Таким образом, L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды могут использоваться для мечения клеток, так что указанные метки позволяют отличить или отделить такие клетки от немеченных клеток.

Лечение

Термин «замещение цепи» относится к способу, посредством которого олигонуклеотид связывается со своей комплементарной целевой последовательностью в двухцепочечной ДНК или РНК, так что происходит вытеснение другой цепи из указанной целевой цепи.

В одном аспекте настоящего изобретения L-рибо-ЗНК модифицированные нуклеотиды, способные осуществлять «замещение цепи», используются при разработке новых фармацевтических средств на основе «антигенного» подхода. В противоположность олигонуклеотидам, способным образовывать тройные спирали, такие олигонуклеотиды, используемые для «замещения цепи», позволяют делать достижимой в качестве мишени любую последовательность в дцДНК при любых физиологических значениях ионной силы и рН.

Способность олигонуклеотидов к «замещению цепи» может также привести к успеху в рамках подхода, основанного на использовании антисмысловой последовательности, в тех случаях, когда целевая последовательность РНК недоступна из-за наличия внутримолекулярных водородных связей. Такие внутримолекулярные структуры могут встречаться в мРНК и могут вызывать серьезные проблемы при попытке «выключить» трансляцию мРНК в рамках антисмыслового подхода.

Другие классы клеточных РНК, такие, например, как тРНК, рРНК, мяРНК и мцРНК, включают внутримолекулярные структуры, которые важны для их функционирования. Указанные классы высокоструктурированных РНК не кодируют белки, но скорее (в виде РНК/белковых частиц) участвуют в широком спектре различных клеточных функций, таких как сплайсинг мРНК, полиаденилирование, трансляция, редактирование, поддержание целостности концевых участков хромосомы и т.д. В связи с высокой степенью структурированности, которая усложняет или даже препятствует эффективной гибридизации в случае нормальных олигонуклеотидов, указанные классы РНК не привлекали внимание в качестве возможных целей для антисмысловых последовательностей. Однако, в свете новых результатов, полученных с использованием описываемых -L-рибо-ЗНК, распозавание таких РНК с помощью -L-рибо-ЗНК стало возможным, как будет показано ниже.

Известно, что множество антибиотиков взаимодействуют с бактериальной рибосомой и, в этой связи, ингибируют трансляцию. Известно, что некоторые антибиотики (например, стрептомицин, тетрациклин, спектиномицин, эдеин, гигромицин и неомицины) связываются со специфическими участками бактериальной 163 рРНК (Moazed D. and Noller H.F., Nature, 1987, 327 (6121), 389). Аналогично, другие антибиотики (например, хлорамфеникол, эритромицин, карбомицин и вернамицин В) взаимодействуют со специфическими участками бактериальной 23S рРНК (Moazed D. and Noller H.F., Biochimie, 1987, 69 (8), 879). Аналогичная ситуация имеет место, скорее всего, и в высших организмах (Spangler E.A. and Elackburn E.H., J. Biol. Chem., 1985, 260 (10), 6334).

Кроме того, известно, что ПНК-ПНК (ПНК - пептидные нуклеиновые кислоты, PNA) представляют собой молекулы, специфически взаимодейспзующие с ДНК по правилу спаривания оснований Уотсона-Крика, что они делают с несколько повышенной термостабильнсстью (Т_пл) в отношении функциональных и доступных сайтов в рибосомальной РНК и могут инглбировать трансляцию в Escherichia coli (Good L. and Nielsen P.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95 (5), 2073), указывая на то, что высоксаффинные олигонуклеотиды, которые связываются с определенными сайтами рРНК, могут имитировать эффект антибиотиков, связывающихся с рРНК. Поскольку ЗНК связываются с рРНК с еще более высоким значением Т_пл, чем ПНК, вполне вероятно, что можно получить ЗНК, которые будут специфически связываться с бактериальной рРНК и ингибировать трансляцию в бактериях. В качестве развития такого подхода следует указать на возможность использовать малые, но важные различия в последовательностях рРНК, имеющиеся между высшими организмами, для конструирования ЗНК-олигонуклеотидов, ингибирующих трансляцию в одном из них, но не в другом. Одним из очевидных приложений такого подхода может быть разработка ЗНК, которые специфически ингибируют трансляцию в видах Plasmodium (малярийные паразиты), видах Schistosoma (вызывающих шистосомоз), различных филяриях (вызывающих слоновость и River Blindness), кривоголовках (вызывающих анемию) и в других патогенных паразитах.

Использование высокоаффинных мономеров L-рибо-ЗНК должно облегчить конструирование антисмысловых зондов с достаточной термостабильностью с целью эффективной гибридизации с такими целевыми РНК. В этой связи в предпочтительном варианте реализации изобретения L-рибо-ЗНК используют для придания достаточной аффинности олигонуклеотиду, с тем чтобы способствовать гибридизации с указанными классами РНК посредством качественной и/или количественной модуляции функционирования частиц, в которых находятся указанные РНК.

L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды, предназначенные для использования в качестве лекарственных средств в рамках антисмыслового механизма действия, разрабатываются с двойной целью: достижения высокой аффинности и способности мобилизовать PHKseH. Указанные цели могут быть достигнуты, например, за счет наличия L-рибо-ЗНК сегментов, фланкирующих немодифицированный центральный сегмент ДНК. Кроме того, особая способность -L-рибо-ЗНК различать РНК и ДНК может использоваться в различных основных терапевтических применениях антисмыслового подхода в связи с предпочтительным характером активности -L-рибо-ЗНК в отношении РНК. При создании -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов, специфичных к той или иной РНК, удается избежать неспецифического связывания с фрагментами ДНК, нуклеотидная последовательность которых аналогична целевой РНК, что предотвращает стабильную ассоциацию -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов с хромосомной ДНК, которая могла бы изменить структуру ДНК и тем самым индуцировать мутации в рассматриваемом гене. Указанное изменение структуры ДНК и ассоциированные мутации могут вызвать нежелательные токсичные побочные эффекты.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к конструированию рибозимов с повышенной специфичностью. Рибозимы представляют собой олигодезоксирибонуклеотиды и их аналоги, которые объединяют РНК-азную активность со способностью к специфичному по последовательности взаимодействию с комплементарной целевой РНК. Они вызывают большой интерес как молекулы терапевтического действия, и вполне вероятно, что привлекательные свойства -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов могут использоваться для совершенствования рибозимов, действующих против специфических РНК.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к L-рибо-ЗНК олигонуклеотидам, специфически взаимодействующим с клеточными нуклеопротеинами, которые содержат РНК в качестве интегрированного и незаменимого компонента активного белка, двумя примерами их являются рибосомы и теломеразы. Способность -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов ингибировать теломеразу может использоваться в ряде важных применений.

Хромосомы высших эукариот (включая человека) являются линейными. Была определена первичная структура (последовательность ДНК) хромосомальных концов, и оказалось, что последовательности ДНК всех хромосомальных концов, в каждом конкретном организме, состоят из простой повторяющейся единицы с выступающим одноцепочечным концом. Конец хромосомы называется теломером. У людей теломеры содержат длинные нити двухцепочечных множественных повторов последовательности 5'-TTAGGG-3' (последовательность одной цепи в направлении от центромера в сторону конца хромосомы). Поскольку все ДНК-полимеразы требуют наличия матричной цепи и олигонуклеотидного праймера для инициации синтеза комплементарной цепи ДНК, ДНК-полимераза сама по себе не способна реплицировать дальние концы хромосомы. Это ведет к прогрессирующему укорачиванию хромосом при их репликации. При рассмотрении длины теломеров в нормальных соматических клетках можно видеть, что длина теломера действительно становится меньше с каждым циклом репликации до тех пор, пока размер теломера не достигнет 5-15 тпо в длину. Когда теломеры становятся такими короткими, клетки прекращают нормально делиться и постепенно входят в фазу старения. Единственным исключением из этого являются стволовые клетки. Стволовые клетки представляют собой специализированные клетки, способные продолжать деление в течение всей жизни организма. Интересно, что теломеры стволовых клеток остаются длинными (10-15 тпо). Они сохраняются такими благодаря активности особого фермента - теломеразы. Теломераза представляет собой уникальный фермент, который способен специфически удлинять выступающий одноцепочечный конец теломера, позволяя тем самым теломеру сохранять стабильную длину. Теломераза является рибонуклеопротеиновым ферментом, т.е. это белок, который содержит РНК и зависит от РНК в своей энзиматической активности. Структура теломеразы несколько напоминает обратную транскриптазу - вирусный белок, который также способен синтезировать ДНК с использованием РНК в качестве матрицы.

Энзиматическое действие теломеразы зависит от правильного положения свободного 3'-конца теломера на молекуле РНК для удлинения теломера. Молекулы, которые способны специфически взаимодействовать либо с самым дальним концом теломера, или, возможно, с РНК компонентом теломеразы, будут ингибировать фермент. -L-рибо-ЗНК может быть разработан таким образом, чтобы соответствовать таким критериям. Указанный подход может представлять интерес, например, в лечении рака, поскольку, за исключением стволовых клеток, в нормальных соматических клетках не обнаруживается теломеразная активность, что резко отличает их от раковых клеток, большая часть которых содержит легко обнаруживаемую теломеразную активность. Раковые клетки являются иммортализованными, т.е. они не стареют, но продолжают пролиферировать и образовывать опухолевую массу вплоть до гибели организма. Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют предположить, что теломеразная активность обязательна для иммортализации раковых клеток. Интересно, что теломеры раковых клеток существенно короче, чем теломеры стволовых клеток, и этот факт указывает на то, что раковые клетки должны достичь «барьера длины теломера» раньше, чем стволовые клетки, и можно полагать, что лекарственное средство, которое специфически ингибирует теломеразную активность, будет полезно как противораковое средство.

В свете вышесказанного, важным аспектом является использование исключительных свойств -L-рибо-ЗНК для конструирования коротких -L-рибо-ЗНК олигомеров, направленных против специфических частей РНК компонента теломеразы, с целью ингибирования теломеразной активности раковых клеток человека.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к использованию L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов, особенно -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов, в качестве аптамеров. Этот новый перспективный класс терапевтических олигонуклеотидов был выбран на основе исследований in vitro как специфически связывающийся с данной мишенью с высокой аффинностью, такой как, например, рецепторы лигандов. Характеристики этих молекул по связыванию отражают, по всей видимости, способность олигонуклеотидов образовывать трехмерные структуры, удерживаемые вместе за счет внутримолекулярного спаривания нуклеотидных оснований. Вполне вероятно, что аптамеры, содержащие -L-рибо-ЗНК олигонуклеотиды, могут проявлять выгодные характеристики, которые, в свою очередь, могут использоваться для терапевтических целей.

В некоторых случаях может быть выгодно осуществлять отрицательную регуляцию экспрессии гена, тогда как в других случаях может быть выгодно активировать ее. Как было показано Моллегаардом с соавт. ( Buchardt, О.; Egholm, М.; Nielsen, P.E. Ргос. Natl. Acad. Scl. U.S.A. 1994, 91, 3892), олигомеры, способные к «замещению цепи», могут функционировать как активаторы транскрипции РНК. В одном аспекте настоящего изобретения ЗНК, способные к «замещению цепи», используют для активации генов, интересных с точки зрения возможного лечения.

Нуклеозиды и нуклеозидные аналоги доказали свою эффективность в химиотерапии различных вирусных инфекций и рака. L-рибо-ЗНК нуклеозиды следует рассматривать как потенциально полезные в качестве таких лекарственных средств нуклеозидной природы.

Имеются сообщения о том, что в некоторых случаях двухцепочечная РНК (дц-РНК) обладает специфической фармацевтической активностью. Дуплексы, включающие полностью L-рибо-ЗНК модифицированный(ые) нуклеозид(ы), могут использоваться в качестве таких двухцепочечных лекарственных средств и, кроме того, вполне вероятно, что двухцепочечные -L-рибо-ЗНК олигонуклеотиды внесут важный вклад в диапазон функций биологически активных молекул типа двухцепочечных РНК.

Исходя из вышесказанного, терапевтический потенциал двухцепочечных ЗНК (дц-ЗНК) может включать лечение рака или вирусных инфекций, что будет рассмотрено ниже.

Имеются данные, в соответствии с которыми различные типы дц-НК, либо сами по себе, либо в синергичном сочетании с гамма-интерфероном, ингибируют рост нескольких типов раковых клеток (Borecky et al. Тех. Rep. Blol. Med., 1981, 41, 575; Sharp et al. Eur. J. Biochem., 1995, 230(1), 97). Дц-РНК ингибируют рост раковых клеток в культуре, а также в опухолях экспериментальных животных. По всей видимости, как минимум два фермента, активируемых двухцепочечной РНК, участвуют в опухолеподавляющей активности дц-РНК: активируемая двухцепочечной РНК протеинкиназа (ПКР) и рибонуклеаза L (Lengyel-P, Proc. Natl. Acad. Scl USA, 1993, 90(13), 5893). В то время как ПКР активируется непосредственно дц-РНК, РНК-аза L активируется дц-РНК через (2'-5')олигоаденилатсинтетазу, которая остается латентной до тех пор, пока не активируется под действием дц-РНК. Дц-РНК также индуцирует активность природного киллера клеток (ПК), и эта активность, по-видимому, также вносит вклад в противоопухолевое действие дц-РНК.

Несмотря на то, что природная дц-РНК в типичном случае ассоциирована с вирусной инфекцией, было показано, что дц-РНК обладает также противовирусной активностью. Дц-РНК проявляет свою противовирусную активность против вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (Haines et al. J. Cell. Biochem., 1991, 46(1), 9). Дц-РНК и также дц-ЗНК могут, в этой связи, быть возможными кандидатами для использования их в качестве лекарственных средств при лечении СПИДа.

Дц-РНК должна доказать свою эффективность на практике. Однако клетки млекопитающих содержат множество специфических нуклеаз дц-РНК и, возможно, из-за этого указанная активность дц-РНК быстро элиминируется в организме пациентов. ЗНК во многом сходна с РНК, и ей свойственна большая часть химических характеристик РНК (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607), и кроме того, ЗНК образует стабильные дуплексы, а структурные различия РНК от ЗНК слабо различимы. Таким образом, вероятно, что адекватные двухцепочечные ЗНК могут имитировать действие некоторые дц-РНК и, соответственно, активировать ПКР и/или (2'-5')олигоаденилатсинтетазу, и поскольку ЗНК сама обладает, как было доказано, экзонуклеолитической активностью (Singh et al., Chem. Commun., 1998,455), возможно, что молекулы дц-ЗНК могут демонстрировать улучшенную терапевтическую эффективность в сравнении с дц-РНК.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей фармацевтически активный L-рибо-ЗНК модифицированный олигонуклеотид или фармацевтически активный L-рибо-ЗНК мономер, определенный выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Такие композиции могут быть представлены формой, адаптированной для перорального, парентерального (внутривенного, внутрибрюшинного), внутримышечного, ректального, внутриназального, кожного, вагинального, буккального, глазного или внутрилегочного введения, предпочтительно в форме, адаптированной для перорального введения, и такие композиции могут быть приготовлены способом, хорошо известным специалистам в данной области техники, в частности, из числа описанных в литературе («Remington's Pharmaceutical Sciences», 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 и более поздние издания, и в монографиях серии «Drugs and the Pharmaceutical Sciences», Marcel Dekker).

Диагностика

Были разработаны несколько диагностических и молекулярно-биологических процедур, в которых используется набор различных олигонуклеотидов для одновременного анализа целевой нуклеиновой кислоты с целью оценки наличия возможных мутаций. В типичном случае наборы олигонуклеотидов иммобилизуют заранее установленным образом на твердом носителе, так что наличие конкретной мутации в целевой нуклеиновой кислоте может быть выявлено по положению на твердой подложке, на которой проходит гибридизация. Одно из важных условий успешного использования набора различных олигонуклеотидов при анализе нуклеиновых кислот заключается в том, что все они должны быть специфичными для конкретной целевой последовательности в конкретных условиях гибридизации. Поскольку аффинность и специфичность стандартных олигонуклеотидов к своим комплементарным целевым последовательностям зависит существенным образом от их последовательности и размеров, эти критерии трудно выполнить.

Кроме того, было разработано множество методик, с тем чтобы можно было охарактеризовать различные типы РНК, которые клетки могут содержать. Общим подходом для их характеристики является гибридизация нуклеиновых кислот, и примеры таких методов гибридизации включают гибридизацию in situ, гибридизацию методом дот-блоттинга, обратную гибридизацию методом дот-блоттинга, нозерн-гибридизацию и полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (отПЦР). Зачастую указанные методы осуществляют на образцах, содержащих и ДНК, и РНК, что нередко создает проблемы при определении, которых легко избежать, если иметь зонды, в которых было проведено адекватное разделение ДНК и РНК. В частности, эта проблема свойственна гибридизации in situ, проводимой с использованием различных тканевых образцов. В связи со свойственным -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидам выраженным гибридизационным предпочтением в отношении РНК могут быть сконструированы -L-рибо-ЗНК олигонуклеотиды, которые специфически гибридизуются с РНК в образце, тем самым устраняя возможность получения ошибочных результатов в случае гибридизации с нерелевантными ДНК, имеющими такую же нуклеотидную последовательность.

В предпочтительном варианте реализации изобретения L-рибо-ЗНК используют как средство повышения аффинности и/или специфичности зондов, а также как средство выравнивания аффинности различных олигонуклеотидов к своим комплементарным последовательностям. Как раскрывается в настоящем описании, такая модуляция аффинности может быть осуществлена, например, путем замещения выбранных нуклеотидов в олигонуклеотиде L-рибо-ЗНК, несущим сходное нуклеотидное основание. В особенности, это относится к -L-рибо-ЗНК лигонуклеотидам.

В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения высокая аффинность и специфичность L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов используется для захвата специфичных по последовательности природных или синтетических нуклеиновых кислот и их очистки. В одном аспекте природные и синтетические нуклеиновые кислоты контактируют с L-рибо-ЗНК модифицированным олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердом носителе. В этом случае гибридизация и захват происходят одновременно. При этом захваченная нуклеиновая кислота может быть, например, обнаружена, охарактеризована, количественно определена или амплифицирована непосредственно на поверхности с использованием множества известных в технике методов, или она может быть высвобождена с поверхности до проведения такой характеристики или амплификации, при помещении иммобилизованного модифицированного олигонуклеотида и захваченной нуклеиновой кислоты в условия, не способствующие гибридизации, такие как, например, нагревание или использование буферов низкой ионной силы.

Твердая подложка может быть выбрана из широкого перечня полимерных материалов, таких как, например, CPG (стекло с контролируемой пористостью), полипропилен, полистирол, поликарбонат или полиэтилен, при этом каждый из этих материалов может иметь различную форму, такую как, например, трубка, микротитрационный планшет, стержень, шарик, фильтр и др. L-рибо-ЗНК модифицированный олигонуклеотид может быть иммобилизован на твердой подложке через свой 5'- или свой 3'-конец (или через конец линкеров, присоединенных к 5'- или 3'-концу) с помощью множества химических или фотохимических методов, обычно используемых при иммобилизации олигонуклеотидов или при нековалентном соединении, таком как, например, в случае связывания биотинилированного L-рибо-ЗНК модифицированного олигонуклеотида с иммобилизованным стрептавидином. Один предпочтительный метод иммобилизации L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов на различных твердых подложках представляет собой фотохимический метод, использующий фотохимически активный антрахинон, ковалентно присоединенный к 5'- или 3'-концу модифицированного олигонуклеотида (необязательно через линкеры), как описано в WO 96/31557. Таким образом, настоящее изобретение также относится к поверхности, несущей ЗНК модифицированный олигонуклеотид.

В другом аспекте L-рибо-ЗНК-модифицированный олигонуклеотид несет лиганд, ковалентно присоединенный либо к 5'-, либо к 3'-концу. В этом случае L-рибо-ЗНК-модифицированный нуклеотид контактирует с природными или синтетическими нуклеиновыми кислотами в растворе, тогда как образованные гибриды захватываются на твердом носителе, несущем молекулы, которые могут специфически связывать лиганд.

Еще в одном аспекте L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды, способные осуществлять "замещение цепи", используют при захвате природных и синтетических нуклеиновых кислот без предварительной денатурации. Такие модифицированные олигонуклеотиды особенно приемлемы для использования в тех случаях, когда до целевой последовательности трудно или невозможно добраться с использованием нормальных олигонуклеотидов в связи с быстрым образованием стабильных внутримолекулярных структур. Примерами нуклеиновых кислот, включающих такие структуры/являются рРНК, тРНК, мяРНК и мцРНК.

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды, сконструированные с целью достижения высокой специфичности, используют как праймеры при секвенировании нуклеиновых кислот и как праймеры в рамках любой из ряда известных реакций амплификации, таких как ПЦР. Как показано в настоящем описании, конструирование L-рибо-ЗНК-модифицированных олигонуклеотидов позволяет определять, будут ли они поддерживать целевую амплификацию в экспоненциальном или линейном режиме. Продукты реакции амплификации могут быть проанализированы далее с использованием множества методов, применимых для анализа продуктов амплификации, получаемых с нормальными праймерами ДНК. В конкретном случае, когда L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотидные праймеры сконструированы для поддержания линейной амплификации, полученные ампликоны будут содержать одноцепочечные концы, которые могут быть специфичны к комплементарным зондам без денатурации. Такие концы могут, например, использоваться для захвата ампликонов другими комплементарными L-рибо-ЗНК-модифицированными олигонуклеотидами, присоединенными к твердой поверхности.

В другом аспекте L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды, способные к "замещению цепи", используют в качестве праймеров линейной или экспоненциальной реакции амплификации. Использование таких олигонуклеотидов, как ожидается, будет повышать общий выход ампликонов за счет эффективной конкуренции с ампликоном в повторной гибридизации на более поздних стадиях реакции амплификации. Демерс с соавт. (Demers et al., Nucl. Acid Res. 1995, 23, 3050-3055) раскрывает использование высокоаффинных неудлиняемых олигомеров в качестве средства повышения общего выхода ПЦР. Считается, что олигомеры проявляют указанные эффекты за счет препятствия повторной гибридизации ампликона на поздних стадиях реакции ПЦР. Ожидается, что L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды, блокированные на своем 3'-конце, будут обладать тем же самым преимуществом. Блокирование 3'-конца может быть достигнуто различными способами, такими как, например, обмен 3'-гидроксильной группы на водород или фосфат. Такие 3'-блокированные L-рибо-ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды могут также использоваться для селективной амплификации очень близких последовательностей нуклеиновых кислот способом, аналогичным тому, что был описан Ю с соавт. (Yu et al., Biotechnigues, 1997, 23, 714-716).

В последние годы были изобретены новые классы зондов, которые могут использоваться, например, для обнаружения в реальном времени ампликонов, генерированных в реакциях целевой амплификации. Один такой класс зондов был назван «молекулярные буи» ("Molecular Beacons"). Указанные зонды синтезируют как частично самокомплементарные олигонуклеотиды, включающие флуорофор на одном конце и молекулу гасителя на другом конце. В свободном состоянии в растворе зонд складывается в шпилечную структуру (под контролем самокомплементарных участков), в которой гаситель расположен в достаточно близком от флуорофора положении для гашения его флуоресцентного сигнала. При гибридизации со своей целевой нуклеиновой кислотой шпилька раскрывается, тем самым отделяя флуорофор и гаситель и прекращая флуоресцентный сигнал.

Другой класс зондов был назван «Такман-зонды» ("Taqman probes"). Указанные зонды также включают флуорофор и молекулу гасителя. Однако, в отличие от молекулярных буев, способность гасителей гасить флуоресцентный сигнал от флуорофора поддерживается после гибридизации зонда с его целевой последовательностью. Вместо этого флуоресцентный сигнал генерируется после гибридизации при физическом разъединении гасителя или флуорофора и зонда с помощью 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, которая инициирует синтез праймера, расположенного в 5'-направлении к сайту связывания Taqman-зонда.

Высокая аффинность к целевому сайту является важной особенностью обоих типов зондов, и следовательно, такие зонды имеют тенденцию к сравнительно большим размерам (в типичном случае от 30 до 40 мер). В результате этого возникают существенные проблемы при производстве высококачественных зондов. В этой связи в предпочтительном варианте реализации изобретения ЗНК используют для улучшения образования и последующего функционирования таких Taqman-зондов и молекулярных буев за счет снижения их размера при сохранении требуемой аффинности.

В еще одном аспекте L-рибо-ЗНК используют для конструирования новых аффинных пар (полностью или частично модифицированных олигонуклеотидов). Константы аффинности могут быть легко скорректированы в широком диапазоне, и может быть разработано и синтезировано большое множество аффинных пар. При этом одна часть аффинных пар может быть присоединена к рассматриваемой молекуле (например, к белкам, ампликонам, ферментам, полисахаридам, антителам, гаптенам, пептидам, ПНК и др.) с использованием стандартных методов, тогда как другая часть аффинных пар может быть присоединена, например, к твердой подложке, такой как шарики, мембраны, микротитрационные планшеты, стержни, трубочки и др. Твердая подложка может быть выбрана из широкого диапазона полимерных материалов, таких как, например, полипропилен, полистирол, поликарбонат или полиэтилен. Аффинные пары могут использоваться при селективном выделении, очистке, захвате и обнаружении множества различных указанных выше целевых молекул.

Принцип захвата L-рибо-ЗНК-меченой молекулы через взаимодействие с другим комплементарным L-рибо-ЗНК олигонуклеотидом (либо полностью, либо частично модифицированным) может использоваться для создания бесконечного множества новых аффинных пар.

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения высокая аффинность и специфичность L-рибо-ЗНК-модифицированных олигонуклеотидов используется при конструировании зондов, используемых для гибридизации in situ. Так, например, L-рибо-ЗНК могут использоваться для снижения размера традиционных зондов ДНК при поддержании нужной аффинности посредством повышения кинетики зонда и его способности проникать в образец.

Очистка

В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к использованию L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов, в особенности -L-рибо-ЗНК олигонуклеотидов, в процедурах очистки, специфичных для РНК. Методы, традиционно применяемые для выделения нуклеиновых кислот из прокариотических клеток, эукариотических клеток или комплекса биологических образцов, включают использование органических растворителей, таких как фенол и хлороформ. При этом выделение нуклеиновых кислот в типичном случае начинают с энзиматического расщепления образца протеазами с последующим лизисом клетки с помощью ионных детергентов и затем проводят экстракцию фенолом и/или сочетанием фенола/хлороформа. Далее разделяют органическую и водную фазы, и нуклеиновые кислоты, вошедшие в водную фазу, осаждают спиртом. Однако фенол или смесь фенол/хлороформ разрушительно действуют на кожу человека и относятся к вредным веществам, работать с которыми нужно очень аккуратно и соответствующим образом обращаться с отходами. Кроме того, стандартные методы экстракции с использованием методов фенол/хлороформного выделения приводят к получению смеси РНК и ДНК. В этой связи при проведении выделения нуклеиновых кислот было бы выгодно использовать способность -L-рибо-ЗНК к различению РНК и ДНК, что позволит получать образцы чистой РНК.

Наборы

Настоящее изобретение также относится к набору для выделения, очистки, амплификации, обнаружения, идентификации, количественного определения или захвата природных или синтетических нуклеиновых кислот, причем указанный набор включает реакционную подложку и один или более L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов (олигомер), определенных в настоящем описании. L-рибо-ЗНК модифицированные олигонуклеотиды предпочтительно иммобилизуются на указанной реакционной подложке.

Настоящее изобретение также относится к набору для выделения, очистки, амплификации, обнаружения, идентификации, количественного определения или захвата природных или синтетических нуклеиновых кислот, причем указанный набор включает реакционную подложку и один или более L-рибо-ЗНК, определенных в настоящем описании. L-рибо-ЗНК предпочтительно иммобилизуются на указанных реакционных подложках (например, с использованием описанных выше методов иммобилизации).

В наборах согласно настоящему изобретению реакционная подложка представляет собой предпочтительно материал твердой подложки, например, выбираемый из боросиликатного стекла, натриево-известкового стекла, полистирола, поликарбоната, полипропилена, полиэтилена, полиэтиленгликоль-терефталата, поливинилацетата, поливинилпирролидинона, полиметилметакрилата и поливинилхлорида, предпочтительно полистирола и поликарбоната. Реакционная подложка может иметь вид трубки для образца, флакона, пластинки, листа, пленки, шарика, мелкого шарика, диска, пластины, кольца, стержня, сети, фильтра, подноса, микротитрационного планшета, палочки или палочки с множеством лезвий.

Наборы в типичном случае сопровождаются вкладышем с инструкцией, в которой указываются оптимальные условия использования набора.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Общие указания

Реакции проводят в атмосфере азота в том случае, когда используются безводные растворители. Колоночную хроматографию проводят на стеклянных колонках с силикагелем 60 (0,040-0,063 мм). После колоночной хроматографии фракции, содержащие продукт, объединяют, выпаривают досуха при пониженном давлении и высушивают в вакууме с получением продукта. После высушивания органических фаз с помощью Na₂SO₄ проводят фильтрование. Используют петролейный эфир в диапазоне перегонки 60-80°С. Значения химических сдвигов выражают количеством частей на миллион (ррт) относительно тетраметилсилана, используемого в качестве внутреннего стандарта (¹Н и ¹³С ЯМР), и относительно 85° Н₃РО ₄ (³¹Р ЯМР). Микроанализы проводят в лаборатории микроанализа отделения химии Копенгагенского Университета (The Microanalytical Laboratory, Department of Chemistry, University of Copenhagen).

Приведенные ниже конкретные описания сопровождаются фиг.1-4 и таблицами 1-3.

Получение L-рибо-ЗНК мономеров

Пример 1

5-O-бензоил-4-С-бензоилоксиметил-3-O-бензил-1,2-O-изопропилиден--D-глюкофураноза (2)

К перемешиваемому на льду охлажденному раствору 3-О-бензил-4-С-гидроксиметил-1,2-изопропилиден--D-глюкофуранозы (1) (5,00 г; 0,016 моль) в безводном пиридине (60 см³ ) добавляют бензоилхлорид (4,1 см³; 0,035 моль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 часов реакционную смесь охлаждают до 0°С, добавляют Н₂O (50 см ³) и смесь экстрагируют дихлорметаном (100 см³ ×3). Объединенную органическую фазу промывают насыщенными водными растворами гидрокарбоната натрия (30 см³ ×3) и соли (20 см³ ×3), высушивают (Na₂ SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента вначале смеси петролейный эфир/дихлорметан (1:1, объем/объем) и затем смеси дихлорметан/метанол (99:1, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей при пониженном давлении фуранозы 2 (7,50 г; 90°) в виде желтоватого масла.

_H (CDCl₃) 8,02-7,23 (15Н, м), 6,08 (1Н, д, J 4,2), 4,81-4,50 (7Н, м), 4,22 (1H, д, J 1,0), 1,59 (ЗН, с), 1,37 (3Н, с).

_c (CDCl₃) 166,1, 165,8, 136,7, 133,1, 133,0, 129,9, 129,7, 129,6, 129,5, 128,5, 128,4, 128,3, 128,0, 127,9, 113,3, 105,4, 86,4, 85,1, 83,8, 72,3, 64,3, 63,8, 27,0, 26,4. FAB-MS m/z 521 [М+Н]⁺. Найдено (%) С, 69,1; Н, 5,9; С₃₀Н₂₂О₈, расчет С, 69,2; Н, 6,2.

Пример 2

5-O-бензоил-4-С-бензоилоксиметил-3-O-бензил-1,2-ди-О-ацетил-Р-глюкофураноза (3)

Раствор фуранозы 2 (7,40 г; 0,014 моль) в 80% уксусной кислоте (60 см³) перемешивают в течение 9 часов при 90°С. Смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток выпаривают совместно с толуолом (10 см³ ×3) и растворяют в безводном пиридине (80 см³). Добавляют уксусный ангидрид (5,5 см³) и раствор перемешивают в течение 46 часов при комнатной температуре. Смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток выпаривают совместно с толуолом (10 см³ ×3) и растворяют в дихлорметане (150 см³). Раствор промывают насыщенными водными растворами гидрокарбоната натрия (30 см³ ×3) и соли (30 см³ ×3), высушивают (Na₂SO₄ ) и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента вначале смеси петролейный эфир/дихлорметан (1:1; объем/объем) и затем смеси дихлорметан/щетанол (99:1; объем/объем) с получением после выпаривания растворителей при пониженном давлении аномерной смеси 3 (:=3:1; 7,33 г; 92%) в виде прозрачного масла. Указанное масло используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

_с (CDCl₃) 169,4, 169,0, 165,8, 165,6, 137,0, 133,2, 133,1, 133,0, 129,6, 129,5, 129,2, 128,3, 127,8, 127,7, 127,4, 99,4, 92,3, 87,0, 83,2, 82,2, 80,7, 77,4, 76,9, 76,3, 73,2, 72,4, 20,9, 20,8, 20,6, 20,3. FAB-MS m/z 562 [М]⁺ .

Пример 3

1-(2-O-ацетил-5-O-бензоил-4-С-бензоилоксиметил-3-O-бензил--D-ксилофуранозил)тимин (4)

К перемешиваемой суспензии аномерной смеси 3 (7,26 г; 0,013 моль) и тимина (3,25 г; 0,028 моль) в безводном ацетонитриле (80 см³) добавляют N,O-бис(триметилсилил)ацетамид (19,1 см³; 0,077 моль). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 1 часа и затем охлаждают до 0°С. Добавляют по каплям в течение 10 минут триметилсилилтрифлат (4,1 см³; 0,023 моль) и смесь впоследствии нагревают в течение 22 часов при температуре кипения с обратным холодильником. После охлаждения до комнатной температуры добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (30 см³) и проводят экстракцию дихлорметаном (100 см³ ×3). Объединенную органическую фазу промывают насыщенными водными растворами гидрокарбоната натрия (30 см³ ×3) и соли (50 см³ ×3), высушивают (Na₂SO₄) и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол (0,5-2,0% метанол, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей при пониженном давлении нуклеозида 4 (6,88 г; 85%) в виде белого твердого материала.

_H (CDCl₃) 8,97 (1Н, шир. с), 8,04-7,23 (16Н, м), 6,37 (1Н, д, J 3,6), 5,42 (1Н, т, J 3,1), 4,89-4,56 (6Н, м), 4,22 (1Н, д, J 2,6), 2,13 (3Н, с), 1,74 (1Н, д, J 0,8).

_c (CDCl₃) 169,9, 166,0, 165,7, 163,4, 150,4, 136,2, 135,2, 133,5, 133,4, 129,8, 129,7, 129,6, 129,5, 129,0, 128,6, 128,4, 128,2, 112,0, 87,4, 86,0, 81,3, 80,3, 72,6, 63,1, 62,9, 20,8, 12,3. FAB-MS m/z 629 [М+Н]⁺. Найдено (%) С, 64,4; Н, 4,9; N, 4,4; C₃₄H₃₂N₂ O₁₀,25H₂O, расчет С, 64,5; Н, 5,1; N, 4,4.

Пример 4

1-(3-O-бензил-4-С-гидроксиметил--D-ксилофуранозил)тимин (5)

К перемешиваемому раствору нуклеозида 4 (9,00 г; 0,014 моль) в метаноле (130 см³) добавляют метоксид натрия (3,87 г; 0,0716 моль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов и затем нейтрализуют разбавленной соляной кислотой. Смесь выпаривают досуха при пониженном давлении с проведением впоследствии совместного выпаривания с толуолом (15 см³ ×3). Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол (4-15% метанол, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей при пониженном давлении нуклеозидного триола 5 (4,82 г; 89%) в виде белого твердого материала.

_H (CD₃OD) 7,89 (1Н, д, J 1,2), 7,40-7,24 (5Н, м), 5,97 (1Н, д, J 6,2), 4,83-4,65 (2Н, м), 4,53 (1H, т, J 6,2), 4,21 (1Н, д, J 6,2), 3,84 (1H, д, J 12,0), 3,63 (1H, д, J 12,0), 3,59 (2Н, д, J 2,6), 1,82 (1H, д, J 1,1). _с (CD₃OD) 164,4, 150,9, 137,5, 136,6, 127,5, 127,0, 126,9, 109,8, 86,7, 86,4, 82,8, 78,0, 72,1, 62,3, 61,1, 10,5 (CH,). FAB-MS m/z 379 [М+Н]⁺. Найдено (%) С, 56,2; Н, 6,0; N, 7,0; С₁₈H₂₂N₂ O₇, 0,25Н₂О расчет С, 56,5; Н, 5,9; N, 7,3.

Пример 5

1-(3-О-бензил-4-С-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-(3-D-ксилофуранозил)тимин (6)

К раствору нуклеозида 1-(3-О-бензил-4-С-гидроксиметил--D-ксилофуранозил)тимина 5 (5,38 г; 14,2 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (400 см ³) добавляют AgNO₃ (2,66 г, 15,7 ммоль) и затем безводный пиридин (5,7 см³) и 4,4'-диметокситритилхлорид (5,30 г, 15,6 ммоль). Смесь перемешивают в темноте в атмосфере азота в течение 18 часов при комнатной температуре. Далее реакцию гасят добавлением насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия (10 см³) и полученную смесь экстрагируют дихлорметаном. Объединенную органическую фазу выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток выпаривают совместно с толуолом и затем очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол/пиридин (0,5% метанол, 0,5% пиридин, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей нуклеозида 6 (3,13 г; 31%) в виде белой пены.

_с ((CD)₂SO) 164,1 (С-4), 158,4, 145,1, 138,5, 137,0, 135,9, 135,7, 130,1, 130,1, 129,2, 128,5, 128,5, 128,2, 128,1, 127,7, 127,6, 127,0, 125,7, 113,5 (DMT, бензил, С-6), 151,4 (С-2), 110,1 (С-5), 85,8, 85,2, 84,6, 83,5 (С-1', С-3', С-4', DMT), 76,8 (С-2'), 72,3 (CH₂ Ph), 65,2 (С-5''), 62,1 (С-5'), 55,4 (2× СН ₃O), 12, 6 (5-СН₃).

Пример 6

1-(3-О-бензил-4-С-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-2,5-ди-O-(п-толуолсульфонил)--D-ксилофуранозил)тимин (7)

К раствору нуклеозида 6 (2,79 г; 3,9 ммоль) в безводном пиридине (50 см³) добавляют каталитическое количество 4-(N,N-диметиламино)пиридина и п-толуолсульфонилхлорид (6,50 г; 34 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакцию гасят добавлением насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия (100 см ³) и полученную смесь экстрагируют дихлорметаном. Объединенную органическую фазу промывают насыщенными водными растворами гидрокарбоната натрия (3×75 см³) и хлорида натрия (2×75 см³). Далее отделенную органическую фазу вьгушивают (Na₂SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол/пиридин (0,5% метанол; 0,5% пиридин; объем/объем ) с получением после выпаривания растворителей нуклеозида 7 (2,40 г; 62%) в виде желтой пены.

_c ((CD₃)₂SO) 163,2 (С-4), 158,2, 145,9, 145,1, 144,3, 136,8, 135,0, 134,9, 134,8, 131,8, 131,6, 130,2, 130,0, 129,7, 128,2, 127,9, 127,8, 127,6, 127,5, 127,5, 127,4, 126,8, 113,3 (DMT, C-6, 2× Ts, бензил), 150,2 (С-2), 110,8 (С-5), 95,0, 86,2 (DMT, С-4'), 82,2, 81,9, (С-1', С-2'), 81,2 (С-3'), 72,9 (CH₂Ph), 79 (С-5''), 64 (С-5'), 55,1 (2× СН₃O), 21,2, 21,2 (2× СН₃), 12,0 (5-СН₃).

Пример 7

(1R,3R,4S,7R)-7-бензилокси-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (8)

К раствору нуклеоэида 7 (3,87 г, 3,92 ммоль) в смеси этанола и Н₂O (1:1, объем/объем) добавляют водный раствор NaOH (2М, 8 см³). Смесь нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 24 часов и после охлаждения экстрагируют дихлорметаном. Объединенную органическую фазу промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (2×75 см³) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол/ пиридин (0,5% метанол; 0,5% пиридин, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей нуклеозида 8 (2,10 г, 81%) в виде белой пены.

_c ((CD₃)₂SO) 163,8 (С-4), 158,2, 158,1, 144,7, 137,7, 135,9, 135,2, 135,1, 129,8, 129,7, 128,3, 127,9, 127,7, 127,7, 127,4, 126,7, 113,35 (DMT, бензил, С-6), 150,3 (С-2), 108,1 (С-5), 88,4, 85,5 (С-4', DMT), 86,4 (С-1'), 79,5 (С-2' ), 76,3 (С-3'), '72,6 (С-5'), 71,2 (CH₃Ph), 58,9 (С-5''), 55,1 (2× СН ₃О), 12,4 (5-СН₃).

Пример 8

(1R,3R,4S,7R)-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-7-гидрокси-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (9)

К раствору нуклеозида 8 (1,09 г, 1,65 ммоль) в метаноле (30 см³) добавляют формиат аммония (0,33 г, 5,29 ммоль). Затем к смеси добавляют каталитическое количество Pd/C, суспендированного в метаноле (10 см³), и смесь нагревают в течение 2 часов при температуре кипения с обратным холодильником. После охлаждения до комнатной температуры смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол/пиридин (2% метанол, 0,5% пиридин, объем/объем) с получением после выпаривания растворителей нуклеозида 9 (0,76 г, 80%) в виде белого твердого материла.

_c ((CD₃)₂SO) 163,9 (С-4), 158,2, 144,8, 135,8, 135,4, 135,3, 129,8, 127,9, 127,7, 126,8, 113,3 (DMT, C-6), 150,4 (С-2), 108,0 (С-5), 89,2, 85,4 (С-4', DMT), 86,4 (С-1'), 78,9 (С-2'), 72,9 (С-3'), 72,3 (С-5'), 59,9 (С-5''), 55,1 (2× СН₃O), 12,5 (5-СН ₃).

Пример 9

(1R,3R,4S,7R)-7-(2-цианоэтокси(диизопропиламино)фосфинокси)-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (10)

К раствору нуклеозида 9 (420 г, 0,73 ммоль) в безводном дихлорметане (4 см³) добавляют N,N-диизопропилэтиламин (0,4 см³) и 2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидохлоридит (0,4 см³). Смесь перемешивают в темноте в атмосфере азота в течение 18 часов при комнатной температуре. Затем реакцию гасят добавлением метанола и смесь разбавляют этилацетатом (10 см³), промывают насыщенными водными растворами гидрокарбоната натрия (3×10 см³) и хлорида натрия (2×10 см³) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток выпаривают совместно с безводным ацетонитрилом и очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси петролейный эфир/этилацетат/пиридин (30-40% этилацетат, 0,2% пиридин, объем/объем) с получением масла. Указанное масло растворяют в дихлорметане (1 см³) и продукт осаждают из петролейного эфира (20 см³) при -40°С при интенсивном перемешивании. Осадок собирают фильтрованием и выпаривают совместно с безводным ацетонитрилом с получением нуклеозида 10 (117 мг, 21%) в виде белой пены. _p (СН₃CN) 149,9, 149,3.

Получение ЗНК олигонуклеогидов

Пример 10

Синтенемодифицированных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, включающих L-рибо-ЗНК, полученные из фосфорамидита 10 (формула X).

L-рибо-ЗНК и контрольные олигонуклеотиды получают на синтезаторе ДНК Biosearch 8750. Присоединение амидита 10 проводят «ручным связыванием» (предварительно перемешивают амидит и активатор с ацетонитрилом в шприце и затем пропускают через реакторную колонку со скоростью примерно два раза в минуту в течение всего времени связывания; используют твердые подложки CPG). Синтез L-рибо-ЗНК проводят с использованием пиридина гидрохлорида в качестве активатора (10-30-минутное связывание: выход амидита 10 при ступенчатом связывании составляет 96-99%). Немодифицированные 2-дезоксинуклеозид 2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидиты связывают с использованием стандартной ДНК-программы для синтезатора, за исключением того, что связывание сразу после Х мономера проводят в соответствии с РНК-программмой для синтезатора. После завершения формирования последовательностей и удаления защитных групп с помощью концентрированного аммиака в метаноле (32%, объем/объем, комнатная температура, 12 часов) из 5'-O-DMT-ON олигонуклеотидов с последующей очисткой с обращением фаз (при использовании коммерчески доступных сменяемых картриджей (Cruachem) и с включением в процедуру детритилирования) получают готовые олигомерные продукты. В случае всех немодифицированных олигонуклеотидов и L-рибо-ЗНК, включающего только один Х мономер, 5'-O-DMT группу удаляют на синтезаторе сразу после завершения образования последовательностей. Последующая обработка концентрированным аммиаком в метаноле (32%, объем/объем, 12 часов, 55°С) и осаждение этанолом дают олигомерные продукты. Для анализа чистоты синтезированных L-рибо-ЗНК используют капиллярный гель-электрофорез.

Данные по гибридизации

Пример 11

Термостабильность олигонуклеотидов, включающих Х мономер

Термостабильность L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов определяют спектрофотометрически с использованием спектрофотометра, снабженного терморегулирующим элементом Пелтиера (Pettier element). Готовят гибридизационные смеси объемом 1 мл с использованием среды, содержащей солевой буферный раствор (10 мМ Na₂ HPO₄, pH 7,0, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА) и эквимолярные (1 мкМ или 1,5 мкМ) количества различных L-рибо-ЗНК модифицированных олигонуклеотидов и их комплементарных ДНК или РНК олигонуклеотидов. В качестве контроля получают идентичные гибридизационные смеси, содержащие немодифицированные олигонуклеотиды. Записывают поглощение при 260 нм при линейном повышении температуры в диапазоне от 10 до 90°С (1°С/мин.). Значения температур плавления (величины Т_пл) получают в виде максимального значения (+/-1°С) первой производной кривых плавления. В таблицах 1-3 суммированы полученные результаты (L-рибо-ЗНК выделены жирным шрифтом). Фиг.2 иллюстрирует использование мономерных L-рибо-ЗНК.

Из таблицы 1 видно, что включение одного или большего числа последовательных -L-рибо-ЗНК мономеров Х в олигонуклеотидную последовательность (А) или (В) не меняет связывающей аффинности -L-рибо-ЗНК в отношении комплементарной ДНК, тогда как ее связывающая аффинность в отношении комплементарной РНК значительно возрастает.

В таблице 2 показаны результаты изучения связывания гомотимин диастереоизомерных ЗНК с РНК (rA₁₄), с РНК с одним ошибочным спариванием оснований (5'-r(А₆СА ₇)), с энантиомерной РНК (ent-rA₁₄) и с энантиомерной РНК с одним ошибочным спариванием (ent-5'-r(А₆ СА₇)).

В таблице 3 приведены результаты изучения связывания смешанной 9-мерной последовательности ДНК, ЗНК и a-L-рибо-ЗНК.

Альтернативный метод

Пример 12

1-(3-О-бензил-2,5-ди-O-метансульфонил-4-С-(метансульфонилоксиметил)--D-ксилофуранозил)тимин (11)

К раствору нуклеозида 5 (1100 мг; 2,91 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (20 см³) добавляют безводный пиридин (5 см³) и затем метансульфонилхлорид (1,2 мл, 15,5 ммоль). Смесь перемешивают в атмосфере азота в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и растворяют в этилацетате. Органическую фазу промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3×10 см³) и высушивают (Na₂SO ₄). Органическую фазу выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол (2% метанол, объем/объем) с получением нуклеозида 11 (908 мг, 51%).

_c (CDCl₃) 163,3, 150,6, 135,6, 134,6, 128,7, 128,3, 112,2, 87,9, 85,0, 83,1, 80,9, 77,2, 76,9, 76,6, 73,3, 66,6, 66,2, 38,6, 37,6, 37,6, 12,2.

Пример 13

(1R,3R,4S,7R)-1-(гидроксиметил)-7-бензилокси-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (12)

К раствору нуклеозида 11 (329 мг, 0,54 ммоль) в смеси этанол/вода (10 см³, 1:1, объем/объем) добавляют 6М NaOH (водн.) (0,9 мл, 5,4 ммоль). Смесь нагревают с обратным холодильником при температуре 80°С в течение 43 часов и затем выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси дихлорметан/метанол (2,4% метанол, объем/объем) с получением нуклеозида 12 (8,5 мг, 44%).

_c ((CD₃)₂SO) 163,8, 150,3, 138,0, 135,8, 128,3, 127,7, 127,5, 108,0, 90,2, 86,5, 86,4, 79,3, 76,5, 72,5, 71,2, 57,2, 40,2, 40,0, 39,8, 39,6, 39,4, 39,2, 39,0, 12,3.

Пример 14

Синтез нуклеозида 8 из нуклеозида 12

Стандартная методика ДМТ-защиты первичной гидроксигруппы в нуклеозиде 12 (например, с использованием той же процедуры, что и при получении нуклеозида 6 при ДМТ-защите первичной гидроксигруппы в нуклеозиде 5) приводит к получению нуклеозида 8, который может использоваться в синтезе фосфорамидитного производного -L-рибо-ЗНК-нуклеозида 10 (см. фиг.2 и соответствующие примеры).

Пример 15

9-(2-O-ацетил-5-O-бензоил-4-С-(бензоилоксиметил)-3-O-бензил--L-рибофуранозил)-6-N-бензоиладенин (14)

Сахар 3 (2,05 г) растворяют в безводном ацетонитриле (30 мл). Добавляют N-6-бензоиладенин (1,86 г) и затем SnCl ₄ (1,3 мл) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3,7 часа, после чего добавляют насыщенный водный раствор NaHCO₃ до нейтрализации. Фильтруют через целит и фильтрат промывают последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (3×150 мл) и Н₂О (2×150 мл), высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (40-60% NaOAc в петролейном эфире) с получением полностью защищенного нуклеозидного промежуточного соединения (1,40 г, 52% выход). Указанный промежуточный продукт (1,29 г) растворяют в метаноле (35 мл) и добавляют насыщенный раствор NH₃ в метаноле (35 мл). После перемешивания при 0°С в течение 2,3 часа смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (1% метанол в дихлорметане) с получением промежуточного соединения, которое растворяют в безводном дихлорметане (40 мл). После охлаждения до -50°С добавляют безводный пиридин (3 мл) вместе с ангидридом трифторметансульфоновой кислоты (0,65 мл). После перемешивания в течение 50 минут добавляют еще ангидрид трифторметансульфоновой кислоты (0,65 мл) и продолжают перемешивание при -10°С в течение 1 часа. Далее добавляют дихлорметан (100 мл) и проводят промывку с использованием насыщенного водного раствора NaHCO ₃ (3×100 мл). Отделенную органическую фазу высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении с получением промежуточного продукта. Указанный промежуточный продукт растворяют в толуоле (20 мл), добавляют КОАс (0,85 г) и 18-краун-6 (0,92 г) и полученную смесь перемешивают при 80°С в течение 7 часов, после чего выпаривают досуха при пониженном давлении с получением остатка, который очищают хроматографией на колонке с силикагелем (0-1,5% метанол в дихлорметане) с получением нуклеозида 14(1,1 г, 84% за три стадии).

_c (CDCl₃) 168,8, 165,8, 142,7, 136,0, 133,5, 133,3, 132,7, 129,6, 129,6, 128,8, 128,6, 128,5, 128,4, 128,4, 128,1, 127,8, 83,8, 82,2, 78,4, 74,3, 70,8, 64,7, 63,4, 20,5. MS (m/z) 742,0 [М+Н]⁺.

Пример 16

(1R,3R,4S,7R)-7-бензилокси-1-гидроксиметил-3-(N-6-бензоиладенин-9-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (15)

Нуклеозид 14 (3,05 г) растворяют в насыщенном растворе NH₃ в метаноле (200 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 дней, после чего добавляют 33% водный раствор NH₃(60 мл) и перемешивание продолжают еще в течение 4 часов. Смесь выпаривают досуха при пониженном давлении с получением промежуточного продукта, который растворяют в безводном пиридине (100 мл). Добавляют TMSC1 (7,8 мл) и продолжат перемешивание при комнатной температуре в течение 5 часов. После охлаждения до 0°С добавляют бензоилхлорид (2,4 мл) и перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляют Н₂О (50 мл) и затем через 5 минут 25% насыщенный водный раствор NH₃(25 мл). После перемешивания в течение 20 минут при комнатной температуре смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (2-5% метанол в дихлорметане) с получением промежуточного продукта (1,76 г, 87% за две стадии). Указанный промежуточный продукт (326 мг) растворяют в безводном пиридине (50 мл) и при 0°С добавляют мезилхлорид (0,11 мл) при перемешивании. После перемешивания в течение 2 часов добавляют Н₂O(5 мл) и объем смеси уменьшают примерно на 50% выпариванием при пониженном давлении. Добавляют дихлорметан (100 мл) и проводят промывку насыщенным водным раствором NaHCO₃ (3×20 мл). Органическую фазу высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (2-4% метанол в дихлорметане) с получением промежуточного соединения (284 мг). Указанное промежуточное соединение (354 мг) растворяют в смеси диоксана (15 мл), Н₂O (15 мл) и 2М NaOH (5,5 мл). После перемешивания в течение 72 часов при кипячении с обратным холодильником добавляют 7% (вес/вес) раствор HCl в диоксане до нейтрализации. Проводят промывку насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2×100 мл), и органическую фазу высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (0-4% метанол в дихлорметане) с получением бициклического нуклеозида 15 (24 мг).

_c ((CD₃)₂SO) 156,0, 152,6, 149,4, 138,8, 138,0, 128,3, 127,7, 127,5, 118,3, 89,7, 83,9, 79,7, 77,0, 73,0, 71,2, 57,2. _н ((CD₃)₂SO) 8,38 (1Н, с), 8,14 (1Н, с), 7,40-7,30 (7Н, м), 6,37 (1Н, с), 5,06 (1Н, т, J 5,8 Гц), 4,73-5,66 (3Н, м), 4,46 (1Н, с), 4,15 (1H, д, J 8,4 Гц), 4,04 (1Н, д, J 8,2 Гц), 3,75 (2Н, д, J 5,7 Гц).

Пример 17

(1S,3R,4S,7R)-7-(2-цианоэтокси(диизопропиламино)фосфинокси)-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил-3-(6-N-бензоиладенин-9-ил)-2,5-диоксабицикло[2.2.1]гептан (16)

ДМТ-защита нуклеозида 15 с последующим дебензилированием и 3'-O-фосфитилированием приводит, как ожидается, к получению фосфорамидитного производного 16. Другой возможный путь получения 16 из нуклеозида 15 включает дебензилирование 15 с последующей селективной ДМТ-защитой первичной гидроксильной группы и затем 3'-O-фосфитилированием. Указанные в примере реакции проводят в соответствии со стандартными процедурами, описанными в литературе (см, например, Koshkin, A.A., Singh, S.K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607).