вещества, проявляющие антимикробную, антигрибковую, антипротозойную активности

Формула изобретения

1. Средство, проявляющее антимикробную, антигрибковую, антипротозойную, радиозащитную активности, отличающееся тем, что оно представляет собой производные гетероциклических арилнитроалкенов общей формулы:

где R=Н, СН₃

2. Средство, проявляющее антимикробную, антигрибковую, антипротозойную, радиозащитную активности, отличающееся тем, что оно представляет собой производное гетероциклического арилнитроалкена, а именно, бензимидазол-5- -нитропропилен структурной формулы:

3. Средство, проявляющее антимикробную, антигрибковую, антипротозойную, радиозащитную активности, отличающееся тем, что оно представляет собой производное гетероциклического арилнитроалкена, а именно, 2-метилбензимидазол-5- -нитроэтилен структурной формулы:

4. Средство, проявляющее антимикробную, антигрибковую, антипротозойную, радиозащитную активности, отличающееся тем, что оно представляет собой производное гетероциклического арилнитроалкена, а именно, бензоксазол-5- -нитроэтилен структурной формулы:

5. Средство, проявляющее антимикробную, антигрибковую, антипротозойную, радиозащитную активности, отличающееся тем, что оно представляет собой производное гетероциклического арилнитроалкена, а именно, 2-метилбензоксазол-5- -нитропропилен структурной формулы:

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии, в сельском хозяйстве для борьбы с возбудителями бактериальной, грибковой и протозойной природы, а также для защиты живых организмов от лучевого поражения.

В настоящее время ассортимент средств с широким спектром активности по отношению к возбудителям бактериальной, грибковой и протозойной природы довольно ограничен.

Наиболее широкое применение для борьбы с патогенными микроорганизмами получили антибиотики. Однако, как правило, антибиотики обладают узкой специфичностью. Одним из наиболее универсальных антибиотиков является полимиксин, проявляющий активность в отношении большой группы грамотрицательных бактерий, но в отношении возбудителей грибковой и протозойной природы указанный антибиотик неэффективен.

Выбор средств для защиты живых организмов от радиоактивного излучения также достаточно ограничен.

Среди радиопротекторов наиболее эффективными являются серосодержащие соединения [1].

Известно официально применяемое радиозащитное средство цистамин [2]. Индекс защиты указанного препарата не превышает 1,45. Недостатком средства является то, что он вызывает диарею.

Известным радиозащитным препаратом является меркамин (b-меркаптоэтиламин) [3].

Недостатками меркамина являются невысокий терапевтический индекс, небольшая длительность действия (0,5 - 1 час), малая отсроченность радиозащитного действия (15-30 мин).

Известны вещества - производные арилнитроалкенов, которые проявляют антимикробную, антигрибковую, антипротозойную активности [4].

Их структурная формула:

где R₁ = Н, СН ₃; R₂, R₃ - одинаковые или различные заместители, выбранные из ряда Н, ОСН ₃, ОН, NO₂, (СН₃ )₂N или R₂ и R ₃ вместе (-CH₂O-).

Их активности удовлетворительны, но стремление получить более дешевые, из более доступного сырья низкотоксичные препараты с широким спектром биологических активностей предполагает изучение других химических соединений.

Целью заявляемого изобретения является расширение арсенала средств, эффективных в отношении широкого круга патогенных микробов, грибков и простейших, а также расширение арсенала радиозащитных средств. Указанная цель достигается тем, что в качестве антимикробных, антигрибковых, антипротозойных и радиозащитных веществ применяют производные гетероциклических арилнитроалкенов (диоксолы, оксазолы и имидазолы).

Предлагаемый для патентования ряд биологически активных веществ относится к классу конденсированных ароматических систем: бензольной и пятичленной гетероциклической, содержащей в гетерокольце два гетероатома: кислород или азот, или оба вместе в положении 1,3, а также боковую цепь в положении 5-нитроалкен.

Наличие пятичленной гетероциклической системы, сконденсированной с арилнитроалкеном, обуславливает особые свойства, позволяющие выделить такие соединения в особый класс.

К классу гетероциклических арилнитроалкенов относятся диоксолы, оксазолы и имидазолы. Диоксолы описаны в литературе [5]. Синтез производных бензимидазола и бензоксазола осуществляли стандартным способом [6, 7].

Реакция конденсации:

где х = N, О; у = N, NH, О; R = СН ₃, Н

Катализаторы: NaOH, KOH или первичные алифатические амины низкомолекулярного ряда или этилендиамин

Эквимолекулярную смесь соответствующего альдегида и первичного нитроалкильного соединения с катализатором выдерживали в течение 7-10 дней при t=16 - 22°С в темноте. Выпавшие кристаллы отделяли, промывали спиртом, сушили. Выход 95 - 97%. Температура плавления соединений совпадает с известной в литературе. При многократной перекристаллизации Т_пл. повышается на 1 - 1,5°С. ИК-спектры полученных веществ совпадают с описанными в литературе: [8, 9, 10].

Известно, что -нитростирол и некоторые его производные проявляют биологическую, в частности, фунгицидную, активность [11]. Известные арилнитроалкены [4] обладали антимикробной, антигрибковой, антипротозойной активностями, способностью защиты живых организмов от лучевого поражения.

Однако в опубликованных источниках информации нами не выявлено сведений о применении заявляемых соединений, а именно 3,4-замещенных гетероарилнитроалкенов при указанных в формулах заместителях и их сочетании в качестве веществ, проявляющих антимикробную, антигрибковую, антипротозойную и радиозащитную активности.

Примеры наиболее эффективных соединений из заявляемого ряда с точки зрения активности и спектра действия представлены ниже:

1. 1,3-бензодиоксол-5- -нитроэтилен

2. 1,3-бензодиоксол-5- -нитропропилен

3. бензимидазол-5- -нитропропилен

4. 2-метилбензимидазол-5- -нитроэтилен

5. бензоксазол-5- -нитроэтилен

6. 2-метилбензоксазол-5- -нитропропилен

Влияние природы и положения заместителей, а также бициклической структуры на биологические свойства и действие вещества не может быть точно определено и предсказано теоретически, несмотря на принципиальную известность некоторых общих закономерностей, поскольку существует ряд факторов, который проявляется лишь при экспериментальной проверке на живых организмах, например, взаимодействие с рецептором, способность проникать через мембраны, наличие равновесия между лечебным действием и детоксикацией в организме, побочные эффекты и другие факторы.

Исследования, проведенные авторами в опытах in vitro и in vivo, показали, что соединения заявляемой группы проявляют достоверно широкий спектр антимикробного, антигрибкового, антипротозойного действия и, кроме того, обладают радиозащитными свойствами. Из приведенного перечня сединений наилучшие результаты в испытаниях на биологическое действие показало соединение 1, которое ранее на биологическую активность не проверяли [9, 10]. Минимальная концентрация, при которой проявляется активность указанных соединений, составляет 0,03%.

Из шести заявляемых веществ два вещества (1 и 2): 1,3-бензодиоксол-5- -нитроэтилен и 1,3-бензодиоксол-5- -нитропропилен были известны на дату приоритета заявляемого изобретения под названием соответственно piperonyliden-nitromethan и piperonyliden-nitroathan и три метода их получения были описаны в литературе [9] соответственно на стр.4504-4505 и стр.4508.

Заявляемые диоксолы могут быть описаны общей структурной формулой:

где R=Н, СН₃

Остальные четыре вещества (3, 4, 5, 6): бензимидазол-5- -нитропропилен, 2-метилбензимидазол-5- -нитроэтилен, бензоксазол-5- -нитроэтилен и 2-метилбензоксазол-5- -нитропропилен не были известны из уровня техники на дату подачи заявки.

Заявляемые вещества являются малотоксичными - средняя летальная доза составляет для мышей не более 1,5 г на 1 кг веса.

В испытаниях использовали музейные (с индексом "М") штаммы возбудителей и штаммы, выделенные (с индексом "В") из патологического материала, взятого от больных, и прошедшие не более трех лабораторных пассажей. Для каждого рода возбудителей использовали соответствующие оптимальные питательные среды. Был применен метод импрегнации исследуемыми веществами питательных твердых сред в дозах от 0,03% до 2,0%. Частично использовали метод диффузии в агаре по аналогии со стандартными методиками определения чувствительности к антибиотикам.

Метод диффузии в агаре осуществляли следующим образом.

Готовили среду АГВ (официальный стандарт), импрегнированную исследуемыми соединениями в концентрации от 0,01 до 2,0%. Среду разливали в чашечки Петри и после застывания из нее вырезали столбики диаметром 10 мм, которые накладывали на поверхность чашек Петри сразу же после посева на них испытуемых микроорганизмов (не менее 6-ти столбиков на культуру). Через сутки инкубации при 37°С измеряли диаметр зон задержки роста культуры вокруг столбиков. Оценку результатов выполняли в соответствии с официальными нормативами тестирования антибиотикочувствительности: диаметр 20 мм соответствовал устойчивости культуры, 21 - 28 мм - ее умеренной устойчивости и 29 мм - чувствительности.

Параллельно проводили испытания чувствительности возбудителей к 15-ти антибиотикам по официальной инструкции Управления по внедрению новых лекарственных средств и медтехники (метод дисков).

В пределах каждого рода использовали несколько видов и штаммов возбудителя для выявления пределов штаммовых и видовых вариаций чувствительности к исследуемым веществам с целью оценки их вероятной общеродовой широты действия.

В таблице 1 представлены результаты испытаний соединений при концентрации 1,0%, при которой они подавляли размножение

5·10⁵ - 5·10⁷ микр. тел/мл, и сравнительные результаты испытаний чувствительности к 15-ти антибиотикам:

1 - пенициллин,

2 - ампициллин,

3 - гентамицин,

4 - карбенициллин,

5 - канамицин,

6 - линкомицин,

7 - левомицетин,

8 - оксациллин,

9 - полимиксин,

10 - рифамицин

11 - ристомицин,

12 - стрептомицин,

13 - тетрациклин,

14 - эритромицин,

15 - цефалоспорин.

В таблице 2 представлены результаты испытаний чувствительности некоторых микроорганизмов к исследуемым соединениям методом диффузии в агаре.

В таблице 3 представлены результаты испытаний чувствительности патогенных грибов к исследуемым соединениям.

Проводили также испытания действия исследуемых соединений на трихомонады.

Использовали штаммы паразита, выделенные от больных. Трихомонады культивировали в среде 199 с добавлением 5,0% нативной сыворотки эмбрионов коров, углеводов и антибиотиков для подавления сопутствующей флоры. В культуральные пробирки на поверхность Среды наслаивали вазелиновое масло. Опытные образцы содержали исследуемые соединения в концентрации 0,3%.

Было исследовано 7 исходных проб, содержащих подвижные формы паразита в количестве 5-8 клеток в 1,0 см³ . Культивирование паразита в контроле при рН 5,8 - 6,5 и t = 37°С удавалось в пределах 3 - 4-х пассажей (5-6 дней каждый пассаж). Во всех случаях культивирование подвижных форм в среде, содержащей испытуемые вещества, не удалось. Уже после первого пассажа подвижные формы не воспроизводились.

Лечебно-профилактическое действие веществ определяли в опытах in vivo на мышах, зараженных внутрибрюшинно или интраназально бактериями псевдотуберкулеза и сальмонеллеза.

Испытуемые вещества в дозе < 20% ЛД ₅₀/0,2 вводили внутрибрюшинно, внутримышечно и перорально в разные сроки от дня заражения. За 2 и 1 день до заражения (схемы 2, 1), в день заражения (схема 0) и после заражения через 1, 2, 3 и т. д. дней (схемы +1, +2, +3 и т. д.).

Учитывали ежедневные показатели смертности, вычисляли их кумулятивные вариации, на основе которых определяли результаты действия препарата по формуле

ИД=[(Б-А):Б] 100,

где ИД - индекс действия препарата, %;

А - кумулята смертности в опыте;

Б - кумулята смертности в контроле.

Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Результаты испытаний показали наличие у всех исследуемых соединений лечебной и профилактической активности на моделях сальмонеллезной псевдотуберкулезной инфекции.

При внутримышечном введении препаратов лечебно-профилактическое действие в виде снижения смертности животных составило 52 - 53%. Лечебное действие для сальмонеллеза варьировало в пределах 50,0% - 20,0%. Для псевдотуберкулеза профилактическое действие составило 50,0%.

Радиозащитное действие исследуемых соединений испытывали на белых мышах, самцах, с массой 18-20 г.

Дозы R₀ - 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, Гр (1 Гр = 100 рентген).

Срок наблюдений - 25 дней.

Метод учета: смертность в динамике, расчет кумулятивной смертности и фактические изменения дозы (ФИД).

Схема введения: 50 мг/кг по 0,2 мл в мышь.

1 группа - контроль,

2 группа - за 2 и 1 сутки до облучения.

Результаты испытаний радиозащитного действия исследуемых соединений представлены в таблице 5.

Как показали результаты испытаний, при профилактическом применении существенно снижается смертность облученных животных по сравнению с контролем для всех доз облучения. ФИД (ЛД ₅₀ контр.) = 1,39-1,43, что говорит о высоком радиозащитном эффекте указанных соединений, не уступающих по своему действию табельным средствам.

Таким образом, заявляемые вещества проявляют широкий спектр антимикробной, антигрибковой и антипротозойной активности и по спектру действия превосходят антибиотики. Кроме того, указанные соединения обладают высоким радиозащитным действием.

Благодаря описанным свойствам заявляемые вещества могут найти применение при лечении раневых инфекций, септических состояний, пневмонии, трахомы, оринтоза, трихомониаза, грибковых поражений, в ветеринарной практике - для профилактики и лечения сальмонеллезов. Кроме того, данные вещества могут быть использованы для защиты живых организмов от лучевого поражения. Возможно также применение заявляемых соединений в различных отраслях, где требуется антисептическая обработка материалов.

ТАБЛИЦА 2
Название микроорганизма	Диаметр зон в мм для концентрации препарата в диске, %
	2,0	1.0	0,1
Гамма-гемолитический стрептококк В-672	35 #	34 #	32 #
Вета-гемолитический стрептококк В-624	31 #	32 #	31 #
Staph. Aurens B-685	39 #	37 #	35 #
Staph. epidermis B-513	38 #	34#	32 #
Shigella flexner M-2A6907	36 #	33 #	31 #
Shigella Sonnei B-720	39 #	35 #	30 #
Salmonella typhimyrium M-727	32 #	30 #	24 #
Salmonella paratyphi M-16469	36 #	30 #	28 #
Acinetobakter B-681	38 #	35 #	32 #
Alkaligenes sp. B-689	40 #	38 #	36 #
Enterobakter agglomerans B-679	33 #	30 #	25 #
Corynebakterium B-670	40 #	35 #	31 #
Bacillus sp. B-575	38 #	34 #	29
Примечание: # чувствителен; + умеренно чувствителен; - устойчив.

ТАБЛИЦА 3
Название грибка	Посевная доза	Результат	Число микробных тел в присутствии препарата при концентрациях, %
			2,0	0,5	0,1
Candida albicans В-45	5×10 4	рост	0	0	о
		задержано	5×104	5×106	5×106
Candida albicans М-3	5×10 4	рост	0	0	0
		задержано	5×106	5×106	5×106
Trichophyton (музей ГИДУВ)	10 2	рост	0	0	0
		задержано	107	107	107
Geotrichum М-158	10 5	рост	0	0	0
		задержано	105	105	104
Torula histolytika (Cryptococcus)	105	рост	0	0	о
		задержано	10 5	105	105

ТАБЛИЦА 4
№ п/п	Возбудитель и метод заражения	Схема введения препара-та	Инкубационный период в днях		Кумулята смертности		Индекс дейст-вия, %
			опыт контр.		опыт	контр
1	2	3	4	5	6	7	8
1	Сальмонелла внутрибрюшинно	-1,0, +1, +2, +3 200 мг/кг внутримышечно	0	0	47	99	+52,53
2	Сальмонелла интраназально	+2, +3 200 мг/кг внутримышечно	1	0	15	30	+50,00
3	Сальмонелла внутрибрюшинно	+1, +2, +3 200 мг/кг внутримышечно	5	5	17	22	+22,73
4	Ерсения псевдотуберкулеза внутрибрюшинно	-3, -2 200 мг/кг внутримышечно	4	4	20	40	+50,00
5	Сальмонелла внутрибрюшинно	+1, +2, +5 200 мг/кг внутримышечно	0	0	56	70	+20,00
6	Сальмонелла внутрибрюшинно	0 внутрибрюшинно 100 мг/кг	0	0	31	44	+36,36

ТАБЛИЦА 5
Доза R (Гр*)	Кумулятивная смертность в группах, %
	контроль	профилактика
2	2,9	0
4	3,6	0
6	13,1	3,8
8	21,1	9,5
10	43.8	13,3
15	66,7	45,5
20	94,1	83,3
ФИД		1,39-1,48
ЛД50	10,73 Гр	15,88 Гр
Примечание: *1 Гр = 100 Рентген

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Куна П. Химическая радиозащита. Москва, 1989 г., стр.25-28.

2. Владимиров В.Г. и др. Радиопротекторы, структура и функция. Киев, 1989 г., стр.139.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч.2, Москва, 1986 г., стр.189.

4. Денисенко П.П., Тарасенко А.А. Патент РФ на изобретение No.2145215. Вещества, проявляющие антимикробную, антигрибковую, антипротозойную активности. БИ No.4, 10.02.2000 г.

5. Перекалин В.В. Непредельные нитросоединения. Ленинград, 1961 г., стр.67.

6. Перекалин В.В. Непредельные нитросоединения. Москва, 1966 г., стр.119.

7. Перекалин В.В. Непредельные нитросоединения. Ленинград, 1982 г. стр.55, 59, 61, 71, 73, 88, 89, 91, 95.

8. Otto Senates, Heinz A. Graefe "Arylnitroalkenes: a new group of antibacterial agents"; Journal of the American Chemical Society, том 74, стр.4486-4490 (1952 г.).

9. Е. Knoevenagel, Leonard Walter "Condensation aliphatischer Nitrokorper mit aromatischen Aldehyden durch organische Basen"; Berichte der Deutschen chemischen Gesellschaft, том 37, стр.4502-4510 (1904 г.)

10. H.Burton, (miss) J. A. Duffield "The synthesis of derivatives of 5:6-dihydroxyindole.Part 1. 5:6-methylenedioxyindole and its 2-methyl derivative"; Journal of the Chemical Society, London, 1949 г., стр.78-79

11. Г.Фойер. Химия нитро- и нитрозогрупп. Москва, 1973 г., ч.2, стр.194-195; Liebigs Annalen der Chemie, 1987 г., стр.495-498; н.з. Японии No.62 - 42923, А 61 К 31/04, публ. 1987 г.; а.с. ГДР No. 234782, опубл. 1986 г.