инактивированная сорбированная вакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц

Формула изобретения

1. Инактивированная сорбированная вакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц, содержащая авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве авирулентного антигенного материала она содержит авирулентный антигенный материал из штамма вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, коллекция ВГНКИ «О №112-ДЕП», в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса в количестве 13,6-15,2 мас.%.

4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно защитную среду.

5. Вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит защитную среду, содержащую лактозу, и/или сахарозу, и/или желатозу в количестве 0,8-2,4 мас.%.

6. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и фосфатно-буферный раствор в соотношении, мас.%:

Аэросил	1,5-2,0
Сапонин	0,007-0,009
Глицерин	23,0-27,0
Фосфатно-буферный раствор	До 100,0

7. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит адъювант в количестве 84,0 мас.%.

8. Вакцина по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, защитную среду и адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	13,6-15,2
Защитная среда	0,8-2,4
Адъювант	До 100,0

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и производстве средств специфической профилактики инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц.

ИЛТ - острое контагиозное заболевание птиц, которое является причиной высокого процента смертности (обычная смертность составляет 10-20%, известны случаи высокой смертности, которая составляет 50-70%), у переболевших особей снижается суточный привес и яйценоскость. ИЛТ вызывается герпесвирусом. В комплексе мер борьбы с ИЛТ одним из основных средств является вакцинация с помощью живых и инактивированных вакцин.

В мировой практике известно более 20 штаммов вируса ИЛТ, различающихся по своим антигенным свойствам и используемых при изготовлении вирусвакцин против ИЛТ птиц (1-7). В России при изготовлении вирусвакцин против ИЛТ нашли широкое применение штаммы «ВНИИБП» (8) и клон «НТ» штамма «ЦНИИПП» (9).

Хотя преимущество живых вакцин из-за технологичности производства и простоты применения не вызывает сомнения, однако иммунная реакция у птиц при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации. Кроме того, при ИЛТ введение живых вакцин взрослой птице не формирует напряженный иммунитет.

Для профилактики ИЛТ птиц нашли также применение инактивированные эмульсионные вакцины, для изготовления которых используют вирулентные штаммы гомологичного вируса.

Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц, содержащая инактивированный этиленимином антигенный материал из штамма SZ-81-ILT гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур, и неполный адъювант Фрейнда при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Антигенный материал	50,0
Неполный адъювант Фрейнда	50,0(10).

В доступных источниках информации заявителем не обнаружено сведений об использовании для профилактики ИЛТ птиц инактивированных сорбированных вакцин.

По мнению заявителя, наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная вакцина против ИЛТ птиц, содержащая авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и адъювант в эффективном соотношении (11).

Недостатки известных инактивированных вакцин против ИЛТ птиц, в том числе и вакцины-прототипа, состоят в том, что для приготовления антигенного материала используют вирулентные штаммы возбудителя инфекции, которые всегда создают проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности.

В связи с этим актуальной остается проблема создания инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, обладающей одновременно высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц на основе нового штамма гомологичного вируса, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью как в нативном виде, так и после инактивации, и пригодного для изготовления высокоиммуногенной и безвредной инактивированной сорбированной вакцины.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных вакцин против ИЛТ птиц, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1) инактивированная сорбированная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе;

3) в качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур;

4) из вакцинных штаммов вакцина содержит штамм «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц;

5) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³;

6) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см ³, в количестве 13,6-15,2 мас.%;

7) инактивант;

8) из инактивантов - димер этиленимина (ДЭИ);

9) ДЭИ в концентрации 0,1%;

10) по окончании инактивации ДЭИ нейтрализуют тиосульфатом натрия;

11) защитная среда;

12) защитная среда, содержащая лактозу и/или сахарозу, и/или желатозу, в количестве 0,8-2,4 мас.%;

13) адъювант;

14) адъювант содержит аэросил, сапонин, глицерин и ФБР в соотношении, мас.%:

Аэросил	1,5-2,0
Сапонин	0,007-0,009
Глицерин	23,0-27,0
ФБР	до 100,0;

15) адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в количестве 84,0 мас.%;

16) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³, защитная среда, содержащая лактозу и /или сахарозу, и/или желатозу, и адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	13,6-15,2
Защитная среда	0,8-2,4
Адъювант	до 100,0.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1) инактивированная сорбированная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, в эффективном количестве;

3) Защитная среда;

4) Адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:

1) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³;

2) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11 суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀ /см³, в количестве 13,6-15,2 мас.%;

3) защитная среда, содержащая лактозу и/или сахарозу, и/или желатозу, в количестве 0,8-2,4 мас.%;

4) адъювант содержит аэросил, сапонин, глицерин и ФБР в соотношении, мас.%:

Аэросил	1,5-2,0
Сапонин	0,007-0,009
Глицерин	23,0-27,0
ФБР	до 100,0.

5) адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в количестве 84,0 мас.%;

6) авирулентный антигенный материал из штамма «О№112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³, защитная среда, содержащая лактозу и /или сахарозу, и/или желатозу, и адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	13,6-15,2
Защитная среда	0,8-2,4
Адъювант	до 100,0.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1) инактивированная сорбированная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе;

3) адъювант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:

1) авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительньми признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:

1) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³;

2) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см ³, в количестве 13,6-15,2 мас.%;

3) защитная среда, содержащая лактозу и/или сахарозу, и/или желатозу, в количестве 0,8-2,4 мас.%;

4) адъювант содержит аэросил, сапонин, глицерин и ФБР в соотношении, мас.%:

Аэросил	1,5-2,0
Сапонин	0,007-0,009
Глицерин	23,0-27,0
ФБР	до 100,0;

5) адъвант, содеожащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в количестве 84,0 мас.%;

6) авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³, защитная среда, содержащая лактозу и/или сахарозу, и/или желатозу, и адъювант, содержащий аэросил, сапонин, глицерин и ФБР, в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	13,6-15,2
Защитная среда	0,8-2,4
Адъювант	до 100,0.

Предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью, является безвредной и расширяет арсенал инактивированных вакцин против ИЛТ птиц.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется использованием в ее составе авирулентного антигенного материала из штамма «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц, обладающего по сравнению со штаммом «ВНИИБП» и «ЦНИИПП» более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью как в нативном виде, так и после инактивации.

Штамм «О №112-ДЕП» является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус (авторское наименование штамм «О») для получения штамма «О №112-ДЕП» выделен из гортани и трахеи курицы с признаками латентной формы заболевания в Казахстане в 1992 году. Производственный штамм «О №112-ДЕП» получен путем последовательных многократных пассажей на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 05.06.2000 г. под регистрационным наименованием «О №112-ДЕП».

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц.

Штамм «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ относится к семейству Herpesviridae. При электронной микроскопии (инструментальное увеличение 4,5×10 ⁵ и 5×10⁵) в поле зрения микроскопа наблюдают хорошо различимые вирусные частицы ИЛТ со свойственной им морфологией. Вирионы имеют сферическую форму, их размеры варьируют от 200 до 250 нм (у некоторых до 330 нм). Вирионы ИЛТ состоят из сферического нуклеокапсида, окруженного суперкапсидной оболочкой сложной формы. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Икосаэдрический капсид покрыт липопротеидной оболочкой, имеющей на своей поверхности морфологические единицы-пепломеры. Диаметр нуклеокапсида равен 113±2 нм, усредненный диаметр нуклеокапсидной оболочки около 350 нм.

Нуклеокапсиды размером 100-110 нм располагаются в вирусной частице, как правило, эксцентрично, реже - в центре частиц. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155000 пар нуклеотидов и состоит из длинной уникальной последовательности U_L, (120000 п.н.) и короткой уникальной последовательности U_S (17000 п.н.). Вирус содержит гликопротеины (205, 160, 115, 90, 85, 74, 60 и 50 кД). Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ.

Антигенные свойства

Штамм «О№112-ДЕП» вируса ИЛТ стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой, идентифицируется в сыворотках крови кур, содержащих антитела к данному вирусу, в РДП, РН и ИФА. В РДП идентифицируется гомологичными гипериммунными сыворотками в титре 1:8. В РН индекс нейтрализации гомологичными гипериммунными сыворотками в разведениях 1:10 и 1:20 в среднем составляет 3,8 lg ЭИД₅₀/см³ соответственно. В ИФА идентифицируется полевыми и лабораторными гипериммунными сыворотками в титре до 1:24579. Антигенные различия штамма «О №112-ДЕП» по отношению к другим штаммам вируса ИЛТ не установлены. Гемагглютинирующими свойствами штамм не обладает. Биотехнологические характеристики

Штамм «О №112-ДЕП» проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм «О №112-ДЕП» используют для изготовления живой и инактивированной вакцин против ИЛТ птиц и диагностических препаратов. Вирус имеет выраженный тропизм к эпителиальным клеткам слизистой оболочки гортани, трахеи и клоаки птиц. Штамм культивируют в 9-11 суточных эмбрионах SPF-кур. Репродукция вируса происходит в ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО). Инфекционный титр вируса в 10-20% суспензии ХАО на 5 сутки культивирования при условии генерализованного распространения по всей оболочке составляет не менее 6,2 lg ЭИД₅₀/см ³.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм «О №112-ДЕП» является ДНК-содержащим вирусом.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфектантам. Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 минут, а 38°С - за 48 часов. В замороженных тушках больных и вынужденно убитых кур, хранившихся при температуре минус 10, 18 и 28°С, вирус оставался активным более 19 месяцев, на поверхности скорлупы в условиях термостата инактивируется через 12 часов, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дней. Полностью инактивируется в 1% растворе креола в течение 30 секунд. Он длительно сохраняет свою активность в лиофилизованном состоянии или при минус 20-60°С. В лиофилизованном гомогенате ХАО вирус сохраняет инфекционность не менее 1,5 лет. В замороженной ткани ХАО инфекционность вируса сохраняется не менее 4 лет.

Иммуногенность штамма

При вакцинации кур старше 15-дневного возраста окулярным способом в дозе 1000 ЭИД₅₀ и оральным способом (выпойкой) в дозе 4000 ЭИД₅₀ индуцирует выработку специфических антител и создает иммунитет против ИЛТ у 100% вакцинированных кур. В лиофилизованном гомогенате ХАО вирус сохраняет иммуногенность не менее 1,5 лет.

Эпизоотичность штамма

При совместном содержании вакцинированных и интактных птиц передача вакцинного вируса штамма «О №112-ДЕП» по контакту не установлена.

Условия поддержания штамма

Лиофилизованный материал из штамма «О №112-ДЕП» хранят при температуре 4°С, вируссодержащие ХАО - при температуре не выше минус 40°С. Для лиофилизации используют защитную среду «ВНИИЗЖ». Для ресуспендирования лиофилизованного вируса используют изотонический фосфатно-буферный раствор рН 7,4-7,6.

Генетическая чистота

После 20 пассажей на ХАО 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур каких-либо изменений иммунобиологических свойств штамма «О №112-ДЕП» не установлено.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность отсутствует, патогенность отсутствует, вирулентность отсутствует, онкогенность отсутствует, контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации отмечена при проведении 4 пассажей на чувствительных цыплятах.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИЛТ.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, приведенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемой вакцины), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемой вакцины преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

Инактивированную сорбированную вакцину против ИЛТ птиц получают следующим образом.

Матровым вирусом из штамма «О №112-ДЕП» заражают хорошо развитые 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур. Для этого в скорлупе куриного эмбриона со стороны воздушной камеры образуют отверстие диаметром 8-10 мм. В подскорлупной оболочке и хориоаллантоисной оболочке (ХАО) инъекционной иглой производят четыре прокола в углы мнимого квадрата с диагональю около 5 мм. После этого на ХАО наносят вируссодержащий материал в объеме 0,1 см³. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют в течение 3-6 суток при 37,7°С и влажности 60%. По результатам овоскопии и последующего вскрытия эмбрионов определяют наличие характерных для вируса ИЛТ поражений ХАО. Пораженные ХАО используют в качестве вируссодержащего материала. Из пораженных ХАО готовят 15-30-процентную суспензию, которую промораживают и освобождают от крупнодисперсных частиц низкоскоростным центрифугированием. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях в общую емкость и подвергают контролю на инфекционную активность. Для изготовления вакцины используют материал с титром инфекционной активности, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³. Затем полученный вирус подвергают инактивации. Для инактивации используют ДЭИ. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию вносят 10% водный раствор ДЭИ до концентрации 0,1%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации ДЭИ нейтрализуют тиосульфатом натрия в течение 120 минут и антигенный материал охлаждают до температуры 2÷8°С. К полученному антигену добавляют защитную среду, в качестве которой можно использовать отдельно или в комбинации лактозу и/или сахарозу, и/или желатозу. Антиген и защитную среду смешивают в соотношении, мас.%: 95:5÷85:15. Полученную смесь расфасовывают во флаконы по 4 см³, промораживают при температуре минус 48÷50°С и подвергают лиофилизации. Продолжительность сушки 59-68 часов. Полученный полуфабрикат представляет собой однородную мелкопористую массу в виде таблетки цилиндрической формы бежевого цвета. Препарат хранится в лиофилизованном виде при температуре 2÷6°С до применения.

Адъювант готовят путем смешивания аэросила, сапонина, глицерина и ФБР при следующем соотношении указанных ингредиентов, мас.%:

Аэросил	1,5-2.0
Сапонин	0,007-0,009
Глицерин	23,0-27,0
ФБР	до 100,0.

Готовый адъювант имеет вид опалецирующей жидкости с рыхлым осадком белого цвета (около 1/5 объема). При встряхивании флакона образуется гомогенная взвесь с легким пенообразованием.

Для получения вакцины лиофилизованный полуфабрикат (первоначальный объем 4 см³) регидратируют в 25 см³ адъюванта. После смешивания с адъювантом вакцина приобретает розовый оттенок. Полученную вакцину контролируют на безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Вакцину применяют клинически здоровой птице в возрасте 25-30 суток для создания высокого уровня иммунитета. Препарат в объеме 0,5 см³ вводят внутримышечно. Иммунитет у привитой птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против вирулентного вируса ИЛТ птиц.

Оптимальный компонентный состав полученной вакцины против ИЛТ птиц приведен в таблице 1.

Согласно таблице 1 содержание антигена в вакцине в указанных пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Пример 2.

Инактивированную сорбированную вакцину против ИЛТ птиц, изготовленную так, как описано в примере 1, и содержащую, мас.%:

Авирулентный антигенный
материал из штамма «О №112-ДЕП»
гомологичного вируса	14,4
Защитная среда	1,6
Адъювант	до 100,0

подвергли контролю на реактогенность. Для этого из 3 флаконов отобрали по 6 см³ вакцины, образуя общую пробу. Вакцину ввели 10 цыплятам внутримышечно в область груди по 1,5 см ³. За птицей вели ежедневное наблюдение в течение 10 суток. Действие препарата не повлекло за собой падежа или возникновения клинических признаков заболевания ИЛТ. В период наблюдения (10 суток) какого-либо токсического действия или проявления клинических признаков заболевания ИЛТ не установлено.

Пример 3.

Инактивированную сорбированную вакцину против ИЛТ птиц, изготовленную так, как описано в примере 1, и содержащую, мас.%:

Авирулентный антигенный
материал из штамма «О №112-ДЕП»
гомологичного вируса	14,4
Защитная среда	1,6
Адъювант	до 100,0

подвергли контролю на антигенную и иммуногенную активность. Для этого из 3 флаконов вакцины, содержащей антигенный материал в концентрации 14,4%, отобрали по 6 см³ препарата, образуя единую пробу. Кроме того, были изготовлены пробы, включающие 1/4 и 1/16 вышеуказанной концентрации антигена. Пробы были обозначены: «Ц» - цельная, «1/4» - и «1/16» соответственно. Для испытания указанных препаратов сформировали 3 группы по 15 подопытных птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область груди по 0,5 см³ . Параллельно образовали контрольную группу, состоящую из 10 интактных птиц, которые в течение всего эксперимента содержались в условиях, аналогичных подопытной птице.

На 21 сутки после прививки у вакцинированных цыплят в ИФА исследовали сыворотки крови на присутствие антител к вирусу ИЛТ. Для постановки ИФА использовали диагностические наборы фирмы KPL (USA, Catalog №54-93-01; Serial №F 032). В соответствии с инструкцией по использованию наборов реакцию считали положительной, если величина титра антител была равной или превосходила значение 1:336.

Через 21 сутки после вакцинации подопытных и контрольных птиц заражали патогенным штаммом «Богатищевский» вируса ИЛТ, который вводили интратрахеально в дозе 1000 ЭИД ₅₀ в объеме 0,5 см³. В течение 10 суток за инфицированной птицей вели наблюдение. Выявляли клинические признаки ИЛТ. Проводили патологоанатомические исследования (устанавливали специфические для ИЛТ поражения: экссудативно-геморрагические воспаления слизистой трахеи и глотки, а также наличие фибринозных пробок в верхнем отделе трахеи). В подопытной и контрольной группах определяли долю заболевших и павших от ИЛТ птиц.

Результаты исследования антигенного и протективного действия сорбированной вакцины в виде показателей титра сывороточных антител, а также доли заболевших и павших птиц после заражения патогенным штаммом вируса ИЛТ, соответственно испытанным концентрациям антигена в препаратах, представлены в таблице 2.

Представленные в таблице 2 результаты позволяют считать, что сорбированная вакцина продемонстрировала выраженное антигенное и протективное действие, которое зависело от концентрации антигена в препарате.

Было установлено, что показатель заболеваемости вакцинированных птиц (С) при контрольном заражении патогенным штаммом вируса был устойчиво связан с долей положительно реагирующих сывороток в исследуемой группе. Величина коэффициента корреляции указанных переменных составила для сорбированной вакцины 0,908.

Анализ полученных результатов показал, что связь между оценками D и Т может быть описана эмпирическим уравнением, позволяющим определять ожидаемую величину титра антител (Т) для заданной концентрации антигена в вакцине. Уравнение для сорбированной вакцины имело вид:

lgT'=3,584+(-0,722)×lg D

Установленные значения эмпирических коэффициентов не имели статических различий. После применения сорбированной вакцины экспериментальные и ожидаемые величины титров антител были высокими.

Оценкой протективного действия вакцин для заданной концентрации антигена считали показатель Р=1-С (долю не заболевших птиц). При этом, ориентируясь на получение более осторожных результирующих оценок, экспериментальные значения С=0 принимали, как С=0,01. Для описания связи между концентрацией антигена (D) и ожидаемым протективным действием вакцины установленные оценки Р выражали в виде соответствующих им нормальных эквивалентных отклонений (Y - табличное значение). Таким образом, было построено уравнение для сорбированной вакцины

lgY'=2,192+(-2,146)×lgD,

где Y' - прогнозируемая величина нормального эквивалентного отклонения доли не заболевших птиц для заданного значения D.

Данное уравнение позволило определить, что для защиты 50% вакцинированного птицепоголовья ожидаемая концентрация антигена (величина разведения цельного препарата) должна составлять D' _собр=10,76 в сорбированной вакцине. При этом для защиты 95% птиц эта величина составила D'_95copб=1,82. Цельный препарат этой вакцины (D=1) имел ожидаемую оценку защиты около 99%.

Таким образом, сорбированная вакцина продемонстрировала выраженное антигенное и протективное действие. Установлена и количественно оценена связь между концентрацией антигена и долей защищенных птиц, а также величиной среднего титра сывороточных антител. В эксперименте вакцина, содержащая цельный антиген, обусловила защиту 100% птиц. Значение средних титров антител в данных группах составило 1:3981 для сорбированной вакцины.

Пример 4.

Проведены исследования изменений мышечной ткани птицы на месте инъекции инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «О №112-ДЕП» (в объеме иммунизирующей дозы) через 30, 40, 60 и 90 дней после прививки. Для этого из числа вакцинированных, но не заболевших после контрольного заражения птиц, была сформирована группа в количестве 32 голов. После прививки подопытной птице сорбированной вакцины в месте инъекции через 30 суток видимых изменений не обнаружили.

Пример 5.

Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный
материал из штамма «О №112-ДЕП»
вируса ИЛТ птиц	13,6
Защитная среда	2,4
Адъювант	до 100,0.

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили по 0,5 см³ в мышцу бедра. Через 21 день у птиц брали кровь, получали сыворотки и исследовали их в реакции ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Результаты таблицы 3 свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной из антигенного материала из штамма «О №112-ДЕП».

Пример 6.

Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный
материал из штамма «О №112-ДЕП»
вируса ИЛТ птиц	14,4
Защитная среда	1,6
Адьювант	до 100,0.

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 25-30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили по 0,5 см³ в мышцу бедра. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Пример 7.

Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный
материал из штамма «О №112-ДЕП»
вируса ИЛТ птиц	15,2
Защитная среда	0,8
Адъювант до	100,0.

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 25-30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили по 0,5 см³ в мышцу бедра. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Результаты таблицы 5 свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины из штамма «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- инактивированная сорбированная вакцина против ИЛТ птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- инактивированная сорбированная вакцина против ИЛТ птиц, приготовленная из штамма «О №112-ДЕП» в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Пат. США №3331736; 167-78, 18.07.67.

2. Пат. США №3444293; 167-78, 13.05.69.

3. Авт. свид. СССР №129791; 30,6; 1960.

4. Авт. свид. CCCH №1750683, А 61 К 39/245, 30.07.92.

5. Пат. РФ №2138290, А 61 К 39/245, 39/265, 35/78; 27.09.99.

6. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных //М. - ВНИТИБП, - 1998. - С.672-683.

7. Glissen J.R. Proceedings. - 1988. - 137.

8. Малушко В.В., Соколов В.Д. и др. Опыт борьбы с инфекционным ларинготрахеитом //Птицеводство. - 1983. - 12. - С.21-23.

9. Дутко Ю.С., Шевченко А.А. и др. Иммунологическая эффективность вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита кур //Ветеринария. - 1991. - 3. - С.32-34.

10. Barhoom S., Forgacs A. and Solyom F. Development of an inactivated vaccine against infectious laryngotracheitis (ILT) - serological and protection studies //Avian Pathology. - 1986. - V.15, №2. - P.213-221.

11. Бабкин В.Ф. Инфекционный ларинготрахеит птиц (Разработка инактивированных вакцин, методов диагностики и системы противоэпизоотических мероприятий): Автореф. дис. докт. вет. наук. - Харьков. - 1996. - 33 с.(на укр. языке) (прототип).

Таблица 1 Оптимальный компонентный состав инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «О №112-ДЕП»
Ингредиенты	Минимум, мас, %	Средний, мас.%	Максимум, мас.%
Авирулентный антигенный материал из штамма «О №112-ДЕП» вируса ИЛТ птиц	13.6	14,4	15,2
Защитная среда	2,4	1,6	0,8
Адъювант	84,0	84,0	84,0

Таблица 2 Антигенное и протективное действие инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «О №112-ДЕП», содержащей различные концентрации антигена
Значения титров сывороточных антител, их средние оценки (Т), а также доля заболевших (С) и павших (L) птиц после контрольного заражения ИЛТ, соответственно концентрации антигена
Концентрация антигена (D)			Контроль
Ц(D=1)	1/4(D=4)	1/16(D=16)
4476	1321	509	109{-}
2548	826	98{-}	-
8128	1346	-	-
6427	241{-}	359	54{-}
3040	2705	896	46{-}
5296	991	-	-
2301	557	134{-}	17{-}
4645	2450	б4{-}	-
2051	75{-}	-	-
3097	826	872	-
6950	2301	-	203{-}
4295	-	-	-
3372	306{-}	304{-}	74{-}
2523	1953	457	32{-}
5887	636	-	-
Т=3981	Т=1278	Т=580	Т=0
С=0/15	С=4/15	С=9/15	С=15/15
L=0	L=1/4	L=3/9	L=8/15

Таблица 3 Иммуногенность инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «O №112-ДЕП»
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцинированной птицы	2600
2.	Сыворотка вакцинированной птицы	3850
3.	Сыворотка вакцинированной птицы	4073
4.	Сыворотка вакцинированной птицы	4645
5.	Сыворотка вакцинированной птицы	2380
6.	Сыворотка вакцинированной птицы	3020
7.	Сыворотка вакцинированной птицы	2700
8.	Сыворотка вакцинированной птицы	3200
9.	Сыворотка вакцинированной птицы	2950
10.	Сыворотка вакцинированной птицы	4500
11.	Контроль	0

Таблица 4 Иммуногенная активность инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «O №112-ДЕП»
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцин. птиц	3550
2.	Сыворотка вакцин. птиц	3400
3.	Сыворотка вакцин. птиц	2950
4.	Сыворотка вакцин. птиц	4350
5.	Сыворотка вакцин. птиц	3730
6.	Сыворотка вакцин. птиц	2900
7.	Сыворотка вакцин. птиц	3200
8.	Сыворотка вакцин. птиц	3650
9.	Сыворотка вакцин. птиц	4050
10.	Сыворотка вакцин. птиц	3800
11.	Контроль	0

Таблица 5 Иммуногенная активность инактивированной сорбированной вакцины против ИЛТ птиц из штамма «O №112-ДЕП»
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцинированных птиц	4200
2.	Сыворотка вакцинированных птиц	3850
3.	Сыворотка вакцинированных птиц	4050
4.	Сыворотка вакцинированных птиц	3600
5.	Сыворотка вакцинированных птиц	2890
6.	Сыворотка вакцинированных птиц	3630
7.	Сыворотка вакцинированных птиц	3850
8.	Сыворотка вакцинированных птиц	2990
9.	Сыворотка вакцинированных птиц	4100
10.	Сыворотка вакцинированных птиц	3100
11.	Контроль	0