способ выделения биологически активной фракции (баф), содержащей s-липополисахариды (s-лпс) из грамотрицательных бактерий, баф для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичные s-лпс, фармацевтическая композиция, способы индукции протективного иммунитета и улучшения состояния пациента при состояниях, требующих повышения иммунного статуса

Формула изобретения

1. Способ выделения биологически активной фракции (БАФ), содержащей преимущественно S-ЛПС из грамотрицательных бактерий, производящих эндотоксичные S-ЛПС, который включает следующие стадии:

(I) экстракция суспензии, в состав которой входят клетки и/или продукты их лизиса и/или продукты их жизнедеятельности, горячим водным фенолом по Вестфалю с последующим диализом, отделением нерастворимого материала и лиофилизацией,

(II) очистка промежуточного продукта, полученного на стадии (I), от примеси белков и нуклеиновых кислот с помощью одновременной обработки рибонуклеазой и дезоксирибонуклеазой и далее протеиназой К с последующим выделением ЛПС диализом и лиофилизацией и

(III) фракционирование промежуточного продукта, полученного на стадии (II) способом, выбираемым из ультрацентрифугирования, фракционирования путем экстракции смесью хлороформ - метанол - водный HCl 1:1:0,4-0,5 (по объему), гель-электрофореза в полиакриламидном геле, колоночной хроматографии, гель-проникающей хроматографии и ультрафильтрации или комбинацией указанных способов и,

(IV) выделение конечного продукта с помощью диализа и/или гель-хроматографии.

2. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию очистки промежуточного продукта, получаемого на стадии (II) или (III), в ходе которой осуществляют фракционирование ЛПС на пористых матрицах, где метод фракционирования выбирается из группы методов, в которую входят препаративный гель-электрофорез в полиакриламидном геле, колоночная хроматография, ультрафильтрация.

3. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что обработку рибонуклеазой и дезоксирибонуклеазой на стадии (II) осуществляют при температуре 4-60°С в течение 0,2-60 ч.

4. Способ выделения БАФ по п.3, отличающийся тем, что обработку осуществляют дезоксирибонуклеазой с активностью 600-4000 ед/мг и рибонуклеазой с активностью 50-140 ед/мг.

5. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (II) используют протеиназу К с активностью 1-20 ед/мг.

6. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что ультрацентрифугирование на стадии (III) осуществляют при температуре 4-50°С, при ускорении 50000-150000 g в течение 0,5-24 ч.

7. Способ по п. 1, где на стадии (III) используют колоночную хроматографию, выбранную из группы методов, в которую входят ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, гель-проникающая хроматография.

8. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что фракционирование на стадии (III) осуществляют при помощи гель-проникающей хроматографии на пористых гелях в водных буферных элюентах, содержащих, необязательно, хаотропные агенты или детергенты.

9. Способ выделения БАФ по п.8, отличающийся тем, что гель-проникающую хроматографию осуществляют на колонке с сефадексом при элюции буфером, содержащим 0.05-4.0 моль лиофилизующегося буфер-образующего компонента, при 4-50°С.

10. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что диализ на стадиях (I) и (II) осуществляют в течение 3-5 суток.

11. Способ выделения БАФ по п.1, отличающийся тем, что лиофилизацию на стадиях (I) и (II) осуществляют в течение 16-24 ч.

12. БАФ для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичный- S-ЛПС, содержащая преимущественно S-ЛПС из грамотрицательных бактерий, производящих эндотоксичные ЛПС, которая характеризуется тем, что в липиде А S-ЛПС мольное соотношение D-глюкозамина и -гидроксикислот, выбираемых из группы, содержащей -гидроксидекановую, -гидроксидодекановую, -гидрокситетрадекановую, -гидроксигексадекановую, составляет приблизительно 2:1-4 и мольное соотношение D-глюкозамина и высших жирных кислот, присоединенных как амидной, так и сложноэфирной связью, в липиде А S-ЛПС составляет приблизительно 2:3-7, и полученная способом по любому из пп.1-11.

13. БАФ по п.12, отличающаяся тем, что она выделена из эндотоксических штаммов бактерий Salmonella enterica sv typhi, Shigella sonnei phase 1, Shigella flexneri 2a, Shigella dysentereae type 1 (Shiga), Escherichia coli 055.

14. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что уровень пирогенности, определяемый в тесте на пирогенность препарата в дозе, не превышающей 25 нг на кг веса кролика, соответствует суммарному повышению температуры не более 1,15°С.

15. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что при подкожном введении взрослым в дозе до 75 мкг слабые (до не более 37,6°С) температурные реакции проявляются не более чем в 20% случаев.

16. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что при подкожном введении детям в дозе до 50 мкг слабые (до 37,5°С) температурные реакции наблюдаются не более чем в 20% случаев.

17. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что максимально переносимая доза при однократном подкожном введении взрослому не превышает 150 мкг.

18. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является вакциной для млекопитающих, включая человека.

19. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она получена из культуры Sh. sonnei и при парентеральном введении в дозах 1-100 мкг активирует специфический иммунный ответ, продуцируя системные и секреторные IgA антитела, и обеспечивает сероконверсию (4-х и более кратное повышение анти-О антител) выше 80%.

20. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что при парентеральном введении детям в дозах 1-50 мкг она активирует специфический иммунный ответ, продуцируя системные и секреторные IgA антитела, и сероконверсию (4-х и более кратное повышение анти-О антител) выше 80%.

21. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является вакцинным носителем, способным образовывать с гетерологичными протективными природными антигенами белковой и полисахаридной природы и синтетическими антигенами нетоксичные комплексы или конъюгированные соединения с целью повышения иммуногенности таких антигенов для млекопитающих, включая человека.

22. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является безопасной толерогенной противошоковой вакциной и при парентеральном введении индуцирует снижение чувствительности к действию бактериального эндотоксина у млекопитающих.

23. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является иммуностимулятором и оказывает лечебный эффект при заболеваниях и состояниях, требующих стимуляции иммунитета у млекопитающих, включая человека.

24. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является иммуностимулятором и оказывает лечебный эффект при вирусных инфекциях, требующих стимуляции иммунитета у млекопитающих, включая человека.

25. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является иммуностимулятором и оказывает лечебный эффект при бактериальных инфекциях, требующих стимуляции иммунитета у млекопитающих, включая человека.

26. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что она является иммуностимулятором и оказывает лечебный эффект при онкологических заболеваниях, требующих стимуляции иммунитета у млекопитающих, включая человека.

27. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что при введении человеку в дозах до 100 мкг не вызывает индукции эндотоксического шока и побочных реакций.

28. БАФ по любому из пп.12 и 13, отличающаяся тем, что активирует продукцию цитокинов, в частности -интерферона in vivo.

29. Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичные S-ЛПС, отличающаяся тем, что содержит БАФ по любому из пп.12-17 и фармацевтически приемлемые добавки.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что грамотрицательной бактерией является Shigella sonnei и при парентеральном введении взрослым в дозах 1-100 мкг активирует О-специфический гуморальный иммунный ответ, продукцию системных и секреторных IgA антител, сероконверсию (4-х и более кратное повышение уровня анти-О антител) выше 80%, иммунитет на слизистых и защиту в полевых условиях от шигеллеза Зонне.

31. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что грамотрицательной бактерией является Shigella sonnei и при парентеральном введении детям в дозах 1-50 мкг активирует О-специфический гуморальный иммунный ответ, продукцию IgA антител, сероконверсию (4-х и более кратное повышение уровня анти-О антител) выше 80%, иммунитет на слизистых и защиту в полевых условиях от шигеллеза Зонне.

32. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что грамотрицательной бактерией является Sh. flexneri 2a и при парентеральном введении млекопитающим в дозах 1-100 мкг активирует О-специфический гуморальный иммунный ответ, продукцию системных и секреторных IgA антител, сероконверсию (4-х и более кратное повышение уровня анти-О антител) выше 80%.

33. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что грамотрицательной бактерией является Sh. dysenteriae, type. 1 и при парентеральном введении млекопитающим в дозах 1-100 мкг активирует О-специфический гуморальный иммунный ответ, продукцию системных и секреторных IgA антител, сероконверсию (4-х и более кратное повышение уровня анти-О антител) выше 80%.

34. Фармацевтическая композиция по п.29, отличающаяся тем, что грамотрицательной бактерией является S. enterica, sv typhi и при парентеральном введении млекопитающим в дозах 1-100 мкг активирует О-специфический гуморальный иммунный ответ, продукцию системных и секреторных IgA антител, сероконверсию (4-х и более кратное повышение уровня анти-O антител) выше 80%, защиту от заражения брюшным тифом.

35. Фармацевтическая композиция по п.29, представляющая собой толерогенную противошоковую вакцину, которая при парентеральном введении индуцирует снижение чувствительности к действию бактериального эндотоксина у млекопитающих, включая человека.

36. Способ индукции протективного иммунитета, отличающийся тем, что млекопитающим, включая человека, вводят фармакологическую композицию по п.29 одно- или многократно, подкожно, перорально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, сублингвально, вагинально, ректально, интраназально, трансдермально.

37. Способ улучшения состояния пациента при заболеваниях, требующих повышения иммунного статуса, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вводят фармкомпозицию по п.29 в приемлемой дозе.

38. Способ по п.37, где заболеванием, требующим стимуляции иммунитета, является онкологическое заболевание, требующее повышения иммунного статуса.

39. Способ по п.37, где заболеванием, требующим стимуляции иммунитета, является вирусное заболевание.

40. Способ по п.37, где заболеванием, требующим стимуляции иммунитета, является бактериальное заболевание.

41. Способ по п.37. где заболеванием, требующим стимуляции иммунитета, является грибковое заболевание.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу выделения биологически активной фракции (БАФ), содержащей преимущественно нативный низкотоксичный S-липополисахарид (S-ЛПС), полученной из бактерий, продуцирующих эндотоксичные липополисахариды (ЛПС), для применения в клинической и экспериментальной медицине с целью профилактики и лечения заболеваний.

Уровень техники

ЛПС являются основными полисахаридными антигенами грамотрицательных бактерий. Они расположены на внешней поверхности наружной мембраны клеточной стенки и играют важнейшую роль в патогенезе многих инфекций (1). ЛПС активно участвуют в построении и функционировании физиологической мембраны микроорганизма и чрезвычайно важны для его роста и выживания (1, гл.2). С другой стороны ЛПС являются первичной мишенью для взаимодействия с антибактериальными лекарственными препаратами и компонентами иммунной системы организма хозяина.

В состав ЛПС входит гидрофильный гетерополисахарид (О-специфический полисахарид), построенный из повторяющихся олигосахаридных звеньев, который в основном определяет иммунологическую специфичность бактериальной клетки. О-Специфический полисахарид ковалентно присоединяется к разветвленному олигосахариду "кора", содержащему 10-12 моносахаридных остатков, который в свою очередь связан с гидрофобным липидным фрагментом - липидом А, удерживающим молекулу ЛПС во внешней мембране микробной клетки. На границе между "кором" и липидом А расположены три остатка 2-кето-З-дезоксиоктулозоновой кислоты (КДО), кетозидная связь которых чрезвычайно кислотолабильна. Полноценные ЛПС, содержащие все три фрагмента - О-специфический полисахарид, "кор" и липид А, выделяют из штаммов грамотрицательных микроорганизмов, которые культивируют на твердых культуральных средах в виде гладких (smooth) колоний и которые, поэтому, называют S-ЛПС. Из штаммов, которые вырастают в виде шероховатых (rough) колоний, обычно выделяют ЛПС, лишенные О-специфической полисахаридной цепи - так называемые R-ЛПС.

В отличие от O-специфического полисахарида, который сам по себе иммунологически неактивен, липидная компонента ЛПС определяет весь комплекс патофизиологических свойств ЛПС, в частности его высочайшую эндотоксичность и пирогенность. Липид А также определяет адъювантные свойства ЛПС и, как следствие, их чрезвычайно высокую иммуногенность.

ЛПС обладают широким спектром "положительных" биологических характеристик, которые интенсивно изучаются в экспериментах на животных и людях, а также in vitro. Под широким спектром "положительных" биологических свойств обычно подразумевают способность ЛПС проявлять себя в качестве мощных протективных антигенов, оказывать антибактериальное и антивирусное действие, а также выступать в качестве иммуностимулятора и адъюванта (1).

Иммунизация животных микрограммовыми количествами ЛПС вызывает индукцию высоких титров специфических антител различных классов, что определяет их вакцинный потенциал. С другой стороны узнавание ЛПС макрофагами приводит к индукции многих провоспалительных медиаторов, включая фактор некроза опухоли- (ФНО-), интерлейкины 1,6 и 12 (ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-12 соответственно), интерфероны (ИФН) и , хемокины и липидные медиаторы (1). Кроме того, макрофаги, активированные ЛПС, могут выступать в роли антиген-презентирующих клеток для CD4⁺ Т-клеток. В кооперации с ИФН- ЛПС стимулирует макрофаги к транскрипции генов, кодирующих NO-синтетазу, что, в свою очередь, приводит к синтезу токсичного окислителя - NO. Стимуляция макрофагов с помощью ЛПС и ИФН- приводит к появлению высокоактивного фенотипа, характеризующегося мощным бактерицидным и противоопухолевым потенциалом (1, гл.63). Таким образом, стимуляция макрофагов ЛПС приводит к развитию местного иммунитета к грамотрицательным бактериям и, посредством продукции ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-, к различным отдаленным и системным эффектам, что играет важную роль в борьбе не только с инфекцией, но и с опухолями.

С другой стороны, нативные традиционные ЛПС являются весьма опасными для человека биологически активными веществами. Попадание в организм небольшого количества ЛПС в составе бактериального продукта или в качестве контаминирующей субстанции может привести к эндотоксическому шоку, сопровождаемому тяжелыми гемодинамическими расстройствами (1, гл.55). Однако полезные фармакологические эффекты, проявляемые ЛПС при целом ряде патологических состояний (инфекция, опухолевой процесс), являются настолько важными, что в нескольких направлениях предпринимаются попытки применения ЛПС или их производных в клинической медицине (1, гл.63).

Существующие подходы к получению клинически применимых ЛПС сегодня связаны с изменением их нативности, то есть с частичной модификацией их структуры.

Одним из таких подходов является химическая модификация ЛПС, например мягкая щелочная или ферментативная обработка, приводящая к изменениям в структуре липида А. Происходящее при этом элиминирование части жирных кислот и фосфатсодержащих заместителей приводит с одной стороны к уменьшению эндотоксичности ЛПС, но с другой - к снижению уровня иммунного ответа вплоть до полной утраты некоторых иммунобиологических функций модифицированных ЛПС.

До разработки группы соединений, защищаемых настоящим патентом, не удавалось непосредственно использовать ЛПС в качестве вакцин, вследствие их высокой токсичности. Поэтому в состав нескольких разработанных к настоящему времени конъюгированных вакцин против инфекций, вызываемых Salmonella enterica sv paratyphi A, Shigella sonnet, Shigella flexneri, испытывающихся на добровольцах (2, 3, 4), входят конъюгаты О-специфического полисахаридного компонента ЛПС с белковым носителем. Потерянный в результате элиминирования липида А иммуногенный потенциал ЛПС частично восстанавливается с помощью использования белкового носителя и оптимизации схем иммунизации, направленных на индукцию вторичного иммунного ответа.

Патент США 6221386, опубл. 24.04.2001, описывает способ выделения S-ЛПС из грамотрицательных бактерий (Brucella melitensis), производящих эндотоксичные S-ЛПС, в ходе которого:

1) выращивают культуру Brucella melitensis;

2) инактивируют клетки 2% фенолом, затем проводят центрифугирование и неочищенный S-ЛПС осаждают метанолом в 1% ацетате натрия;

3) проводят экстракцию (фенол-водную) с последующим диализом, отделением нерастворимого материала (ультрацентрифугированием) и лиофилизацией;

4) очищают полученный на стадии (3) экстракт от примесей с помощью обработки лизоцимом, нуклеазами и далее протеиназой К.

Однако выделенные S-ЛПС применяются исключительно в капсулированной форме (липосомальных системах), для исключения побочных действий при введении их в организм в эффективных количествах, требуемых для формирования иммунитета.

Другое направление клинического применения денатурированных ЛПС - толерогенные противошоковые вакцины. Идея использовать ЛПС в качестве толерогенной противошоковой вакцины для создания рефрактерности организма к последующему массивному попаданию эндотоксина не нова (1, гл.50). Вместе с тем этот подход не теряет свою актуальность вследствие исключительной важности контроля клинических ситуаций, приводящих к эндотоксическому шоку. Сравнительно недавно в клинических и экспериментальных исследованиях продемонстрирована индукция ранней или поздней толерантности к последующему введению эндотоксина не только с помощью ЛПС, но и его производного монофосфориллипида A (MPL), а также синтетических аналогов липида А (1, гл.50). MPL - также хорошо известен как иммуномодулятор широкого спектра действия и адъювант.

Другой путь снижения эндотоксичности ЛПС - это функциональная детоксификация ЛПС с помощью циклических пептидов (1, гл.23), специфических белков (1, гл.19, 21) или поликатионных соединений (1, гл.11), причем каждое из перечисленных выше соединений способно специфически связываться с липидным фрагментом ЛПС. Это направление представляется перспективным для очистки крови или плазмы больных в системах экстракорпоральной обработки, используя твердофазную матрицу, содержащую лиганды, специфические для липида А. Однако в настоящее время недостаточно изучено, какие процессы могут происходить при введении в организм млекопитающего подобного рода комплексов. Так остается неясным вопрос об их иммуногенности, биодеградируемости, токсичности, возможности накопления в различных тканях и т.д.

Отдельного рассмотрения требует опыт применения ЛПС для лечения опухолевых процессов. Клинические исследования по применению ЛПС для терапии опухолей достаточно хорошо известны (1, гл.63). В настоящее время для лечения опухолей используются не только все возможные варианты модифицированного ЛПС (химические производные, синтетические аналоги, продукты функциональной детоксификации), но и нативный высокотоксичный эндотоксин. Последние исследования в этом направлении посвящены изучению возможностей комбинированной терапии ЛПС с -интерфероном. Высокая эндотоксичность позволила авторам данного исследования использовать лишь исключительно низкие дозы для внутривенного введения - 1-4 нг на кг веса.

В отличие от традиционных ЛПС группа низкоэндотоксичных нативных БАФ ЛПС, защищаемых настоящим патентом, отличается чрезвычайно широким интервалом доз клинического применения, что создает новые возможности для клинициста в создании эффективных схем лечения.

Сущность изобретения

Предлагаемый нами оригинальный подход к получению БАФ низкоэндотоксичных нативных S-ЛПС представляет собой комбинацию современных и эффективных методов, при использовании которой появляется возможность, с одной стороны, получения высокоочищенных ЛПС (содержание примесных соединений не более 4%), а с другой стороны - выделения из суммарного "родительского" ЛПС низкоэндотоксичной фракции, причем условия проведения всех этапов выделения и очистки предполагают максимальное сохранение первичной структуры ЛПС.

Выделение и очистка заявляемых БАФ включает экстракцию, ферментативную обработку экстракта для разрушения примесных нуклеиновых кислот и белков и последующее фракционирование сырого ЛПС с помощью различных методов.

Основным методом на стадии экстракции является обработка 45%-ным горячим водным фенолом по Вестфалю (5). В настоящее время именно этот метод используется для выделения ЛПС, так как он, с одной стороны, обеспечивает высокий выход ЛПС, а с другой - предполагает устойчивость гликозидных и кетозидных связей моносахаридных остатков и связей неуглеводных заместителей в полисахаридном и липидном фрагменте ЛПС.

Ферментативную обработку экстракта проводят для расщепления до моно- и олигомерных фрагментов рибо- и дезоксирибонуклеиновых кислот, а также белковых компонентов бактериальной клетки. Ферментативный гидролиз нуклеиновых кислот проводят одновременным действием рибонуклеазы-А и дезоксирибонуклеазы в буферах, содержащих ионы кальция и магния. Выбор нуклеаз не носит принципиального характера: при использовании фермента с пониженной активностью необходимо увеличить его концентрацию и время реакции. Далее к реакционной смеси прибавляют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты для связывания ионов двухвалентных металлов и протеазу, обычно протеиназу К.

Выделение БАФ S-ЛПС из неочищенного ЛПС, полученного после обработки ферментами, может быть проведено экстракцией смесью хлороформ-метанол-0,2М HCl [6]. Однако при использовании для экстракции смеси с указанным в работе [6] соотношением экстрагентов выделяется продукт с пирогенностью, в 8-16 раз превышающей предел, установленный Фармакопеей для полисахаридных вакцин (0,050 мкг/кг веса кролика).

В этой связи соотношение растворителей в смеси для экстракции с целью повышения ее полярности и гидрофильности было изменено по сравнению с описанным в работе [6] и составило 1:1:0,4-0,5. Выход апирогенной БАФ S-ЛПС при этом не превышал 1% от веса неочищенного ЛПС.

Ультрацентрифугирование проводят в водных, возможно забуференных растворах, возможно содержащих хаотропные агенты, при концентрации ЛПС, не превышающей 1%. Для ЛПС, выделенного из каждого конкретного микроорганизма, условия ультрацентрифугирования, включая скорость и время, подбираются специально. Так при снижении скорости и/или уменьшении времени ультрацентрифугирования наблюдается повышение содержания низкомолекулярного ЛПС в конечном продукте, а при превышении этих параметров - резкое падение выхода. Критерием оптимальности выбора условий ультрацентрифугирования может служить уровень эндотоксичности, БАФ, выделенной из супернатанта.

Важно подчеркнуть, что ультрацентрифугирование, а также все описанные ниже способы выделения апирогенной БАФ S-ЛПС могут быть применены как к продукту ферментативной обработки, так к продукту, полученному на стадии экстракции смесью хлороформ-метанол-0,2М HCl.

Фракционирование БАФ с помощью препаративного электрофореза в полиакриламидном геле представляется достаточно перспективным, т.к. появляется возможность выделять достаточно узкие фракции ЛПС, варьируя количество сшивок в геле (от 7,5 до 12,5%), но, в свою очередь, имеет ряд недостатков. Так, очевидны трудности в разделении граммовых количеств исходного ЛПС, а также осложнения, связанные с возможностью загрязнения целевого продукта фрагментами деградации (механической или химической) полиакриламидного геля.

Указанных выше недостатков лишен метод фракционирования ЛПС с использованием мембран для ультрафильтрации фирмы "Миллипор". Однако в силу значительного разброса в размерах пор этих мембран в результате фракционирования могут быть выделены лишь достаточно 'широкие' фракции S-ЛПС, для которых интервал в значениях молекулярной массы может достигать 20-30kDa, т.е. при использовании. например, мембран с "cut off" 50kDa сквозь поры могут проходить молекулы S-ЛПС с молекулярной массой 60 или даже 70kDa. Кроме того в некоторых случаях для повышения качества разделения возникает необходимость в использовании детергентов, таких как, например, Тритон X-100, роль которых заключается в демицеллировании ЛПС. В этом случае особой проблемой становится удаление детергента из конечного продукта. Для этого часто используется прибавление к раствору ЛПС при фракционировании низших спиртов, обычно этанола в концентрациях до 30%. В этой связи данный подход удобнее всего использовать для удаления из нефракционированного ЛПС его низкомолекулярных фракций.

Ионообменная гель-хроматография представляется достаточно удобным методом выделения целевых S-ЛПС только в том случае, если в их состав входят О-специфические полисахариды, содержащие заряженные остатки, как, например, при фракционировании ЛПС Sh.sonnei, фаза 1(O-полисахарид несет карбоксильные и аминогруппы) (7).

Основным затруднением при использовании как ионообменной, так и гель-проникающей хроматографии является заметная склонность ЛПС к агрегации. Для того чтобы исключить влияние этого нежелательного фактора, возможно введение в элюэнт органических растворителей (спирты, ацетонитрил), хаотропных агентов или детергентов (неионных в случае ионообменной хроматографии). Несмотря на огромный выбор коммерчески доступных носителей для ионообменной хроматографии обычно используется DEAE-Sephadex, а для гель-проникающей хроматографии - Sepharose 2В, 4В или 6B-CL.

Одним из наиболее удобных методов разделения амфифильных высокомолекулярных соединений является гидрофобная хроматография с использованием бутил-, октил- или фенил- Sepharose. Нами показано, что электродиализ с последующим образованием триэтиламмониевой соли ЛПС при подготовке образца для препаративной гидрофобной хроматографии [7] может быть с успехом заменен на обработку хелатирующими ионообменными смолами. Необходимо также обращать внимание на то, что суммарную гидрофобность молекулы ЛПС определяет не только липидная компонента, но и, в заметной степени, природа моносахаридов, входящих в состав O-специфического полисахарида (наличие в нем О- и N-ацетил-, а также дезоксисахаров). С другой стороны, широкий выбор носителей и элюентов для градиентного разделения позволяет во многих случаях успешно оптимизировать процесс выделения целевой фракции S-ЛПС.

Таким образом, предложена методология выделения заявляемой БАФ из различных грамотрицательных бактерий, которая в качестве обязательных стадий включает экстракцию с последующей деградацией примесных белков и нуклеиновых кислот действием ферментов, тогда как дальнейшее фракционирование для получения целевого продукта может быть осуществлено с использованием одного из описанных выше способов или их комбинаций. При этом на выбор стадии процесса фракционирования в каждом конкретном случае влияет несколько факторов, в частности вид микроорганизма, желаемый набор иммунобиологических характеристик (например, пирогенность, токсичность), выход БАФ при использовании того или иного подхода, необходимый количественный уровень целевого продукта, стоимость и характеристики производства и др. факторы.

Приведенная выше схема выделения и очистки заявляемой БАФ на основе S-ЛПС (в отличие от препаратов модифицированных ЛПС) предполагает полное сохранение "нативности" и "неизменяемости" первичной структуры ЛПС.

Анализируя состав и строение заявляемых БАФ, необходимо отметить, что, как и указывалось выше, исходя из данных ЯМР-спектров, во всех случаях структура О-специфического полисахаридного компонента ЛПС, входящего в состав заявляемой БАФ, не отличалась от описанной ранее в литературе.

Что касается олигосахаридного "кора", расположенного в ЛПС на границе О-специфический полисахарид - липид А, исследование, подтверждающее его наличие в составе заявляемых БАФ, было проведено с помощью идентификации в них двух "обязательных" для "кора" компонентов - гептозы [методом комбинированной газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС)] и КДО (колориметрической реакцией с тиобарбитуровой кислотой).

Единственные обнаруженные к настоящему времени отличия в структуре между "родительскими" ЛПС и заявляемыми препаратами БАФ были установлены нами в результате сопоставления данных анализа жирнокислотного состава методом липида А.

Поэтому в рамках настоящей работы особое внимание было уделено именно липидному компоненту заявляемых БАФ, так как он, как указывалось выше, определяет весь комплекс патофизиологических свойств ЛПС. Ниже после краткого обзора структур липида А из ЛПС семейства Enterobacteriaceae будут рассмотрены некоторые особенности липидного компонента заявляемых БАФ.

В основе липида А лежит дисахарид -(1'-6)-D-глюкозаминил-D-глюкозамин, который несет две фосфатные группировки - одну в положении 4' невосстанавливающего остатка D-глюкозамина, а другую (присоединенную -связью) - в положении 1 восстанавливающего остатка D-глюкозамина. Обе аминогруппы остатков аминосахаров в дисахариде замещены остатками (R)-3-гидрокситетрадекановой кислоты [14:0(3-ОН)], а два других остатка этой кислоты присоединены сложноэфирной связью в положения 3 и 3' обоих остатков D-глюкозамина дисахаридного фрагмента. Оба остатка [14:0(3-ОН)], локализованные в невосстанавливающем остатке D-глюкозамина, в свою очередь замещены по гидроксильным группам остатками тетрадекановой и додекановой кислот. Эта, так называемая, "классическая" структура липида А характерна (с некоторыми незначительными вариациями в природе заместителей при фосфатных группах) для подавляющего большинства ЛПС семейства Enterobacteriaceae.

Многочисленные публикации последних десяти лет посвящены установлению первичной структуры липида А ЛПС, выделенных из микроорганизмов этого и других семейств и родов грамотрицательных бактерий, их встречному синтезу и синтезу их многочисленных аналогов, а также исследованию и сопоставлению биологических характеристик выделенных и синтезированных липидов (1, гл.14,46,47). Из анализа результатов этих работ сделан вывод, что любое значительное отклонение от "классической" структуры липида А приводит к заметному, а в некоторых случаях к драматическому снижению их эндотоксичности (1, гл.46, 47). Главную роль при этом играет качественный и количественный состав жирных кислот. Так липид А, содержащий не "классический" набор из шести жирных кислот, а имеющий в своем составе семь или пять их остатков, проявляет значительно более низкую in vivo эндотоксическую активность [пирогенность (кролики) и летальную токсичность (мыши)] (1, гл.46,47) по сравнению с "классическим" липидом А. Кроме того в отличие от "классического" липида А для указанных выше липидов А характерно наличие жирных кислот с более длинной или более короткой углеводородной цепью, которые могут содержать НО-группу при С-2 (а не при С-3), оксогруппу, двойную связь, разветвление у метиленого звена, соседнего с метильной группой, и даже циклопропановый фрагмент. Так, показано, что низкая эндотоксичность ЛПС Bacteroides fragilis связана с тем, что липид А этих ЛПС обладает уникальным набором жирных кислот: часть жирных кислот с тетрадекановым скелетом заменяется жирными кислотами с шестнадцатью атомами углерода (1, гл.7).

В рамках настоящего исследования было показано, что липид А заявляемой БАФ наряду с "обязательными" для "классического" липида А жирными кислотами (в частности, [14:0(3-ОН)], тетрадекановой и додекановой кислотами), содержал и редко встречающиеся жирные кислоты, например, гекса- и октадекановую, при этом наблюдалось также резкое падение содержания [14:0(3-ОН)]. Следовательно строение липида А заявляемых БАФ на основе S-ЛПС заметно отличается от "классического", что явным образом может сказываться на их эндотоксических характеристиках.

В этой связи становится возможным констатировать, что в состав высокоэндотоксичных ЛПС грамотрицательных микроорганизмов могут входить фракции S-ЛПС с пониженным уровнем эндотоксичности и пирогенности, которые могут быть использованы в клинической практике.

В данной работе мы получили несколько доказательств "нативности" заявляемых препаратов. Во-первых, сопоставление жирнокислотного состава липида А и ЯМР-спектров полисахаридных фрагментов БАФ, выделенных разными способами (напр., действием водного фенола и трихлоруксусной кислоты) показало их полную идентичность по этим параметрам. Во-вторых, во всех случаях наблюдались ярко выраженные серологические реакции между БАФ и соответствующих анти-O-сыворотками, а также сыворотками больных людей (с бактериологически подтвержденным диагнозом). В-третьих, в случае наиболее распространенного метода выделения ЛПС - экстракции горячим водным фенолом удалось показать, что при повторной обработке выделенных препаратов в условиях экстракции ни изменения жирнокислотного состава, ни спектральных характеристик выделенных препаратов не происходит. В-четвертых все БАФ проявляли высокую иммунобиологическую активность.

БАФ, защищаемые настоящим патентом, по уровню безопасности резко отличаются от препаратов ЛПС, получаемых традиционными методами. Они удовлетворяют требованиям Технического комитета экспертов ВОЗ по параметрам безопасности для менингококковых и брюшно-тифозной Vi-антигенной полисахаридных вакцин (8).

При парентеральном введении добровольцам БАФ Sh.sonnet в дозах 25, 50, 75 мкг под контролем Национального Контрольного Органа России (НКО) в рамках клинических испытаний дизентерийной вакцины не только не наблюдалось эндотоксического шока, но и существенных общих или местных эндотоксических реакций. Таким образом, дозы клинического применения заявляемых БАФ сравнимы с таковыми для капсульных вакцинных полисахаридов и существенно (в 100-1000 раз) выше доз введения человеку рутинных ЛПС при различных клинических исследованиях (9). Многократные последующие клинические испытания препарата подтвердили его высокий уровень безопасности: отсутствие общих реакций, таких как озноб, головная боль, только легкие (<37,6) подъемы температур не более чем у 10% привитых, весьма редкие местные реакции в виде покраснения или болезненности в месте введения.

БАФ Sh.sonnet был также безопасен при введении детям разных возрастных групп 3-6, 7-10, 10-14 лет в дозе 25-50 мкг подкожно. Уровень реактогенности, оцениваемый по общим и местным реакциям, существенно не отличался у детских и взрослых контингентов.

Безопасность БАФ, отсутствие пирогенных реакций при подкожном введении вакцинных доз препарата в клинических и экспериментальных исследованиях может быть иммунологически объяснена сравнительно низкой активацией БАФ продукции -TNF - одного из ключевых медиаторов эндотоксической реакции. Подкожное введение БАФ Sh.sonnet добровольцам в дозах 50, 75 мкг не приводит к достоверному росту содержания -TNF в сыворотке крови добровольцев после первичной или вторичной иммунизации.

Проведенные экспериментальные и клинические исследования также свидетельствуют о том, что заявляемые БАФ являются мощными иммуногенами и могут быть использованы в качестве вакцин. Они вызывают индукцию О-специфических протективных антител у млекопитающих, включая человека, при этом гуморальный иммунный ответ представлен всеми основными классами антител IgG, IgA, IgM. Такие антитела являются бактерицидными для микроорганизмов, против которых они направлены. На моделях противоинфекционного иммунитета они обеспечивают защиту макроорганизма от гомологичного штамма возбудителя брюшного тифа или шигеллеза (10). При иммунизации добровольцев отдельными препаратами БАФ отмечается выраженный подъем уровня сывороточных O-специфических антител и сероконверсия (подъем уровня антител 4 раз) у 80-90% иммунизированных лиц. Персистенция высоких уровней специфических антител приводит к защите популяции от инфекции шигеллеза Зонне.

Характерной особенностью иммуногенности низкоэндотоксичных БАФ является мощная сочетанная активация как системного, так и местного IgA иммунного ответа. Иммунизация БАФ Sh.sonnei морских свинок приводит к индукции местного иммунитета и защищает их слизистую конъюнктивы глаза от заражения гомологичным вирулентным штаммом. В слюне иммунизированных добровольцев определяются О-специфические антитела, продуцируемые локально и выявляемые с помощью MAT к -цепи и секреторному компоненту. При этом сероконверсия IgA специфических антител достигает 100% (11).

Проведенные НКО России полевые испытания вакцины против шигеллеза Зонне, представляющей собой фармацевтическую композицию на основе БАФ в эндемичном по инфекции районе Саратовской области, выявили высокую профилактическую эффективность препарата. Препарат обеспечивал защиту гражданского населения в наиболее неблагоприятный летне-осенний период подъема заболеваемости шигеллезом Зонне. Средний индекс эффективности вакцины превысил 90% (12).

Использование низкоэндотоксичных БАФ в качестве толерогенной противошоковой вакцины эффективно и может снять проблему токсичности подобного препарата, весьма важную для пациентов хирургической клиники. Полная выживаемость экспериментальных животных после инъекции БАФ из ЛПС Shigella sonnei, Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli за 12 часов перед последующем введением летальной дозы эндотоксина свидетельствует о формировании выраженной невосприимчивости к бактериальному эндотоксину.

Низкоэндотоксичные БАФ обладают разносторонним воздействием на иммунную систему и являются иммуномодуляторами, оказывающими влияние на резистентность макроорганизма к опухолевому росту. Иммуномодулирующее действие БАФ в отличие от вакцинного особенно четко проявляется при более высоких дозах препаратов 50-150 мкг и многократном введении.

Группа заявляемых препаратов обладает противораковым эффектом, установленным в эксперименте in vivo с использованием перевиваемых клеток мастоцитомы Р855. Двукратное введение препарата БАФ из Salmonella enterica sv typhi мышам Balb/c до инокуляции клеток мастоцитомы приводит к росту выживаемости животных. Сходный эффект отмечался при введении препарата в ранние (до 24 часов) сроки после инокуляции

БАФ ЛПС существенно повышает резистентность мышей к заражению естественной инфекций Salmonella enterica sv typhimurium - бактериальному патогену с облигатным внутриклеточным паразитированием.

Основой иммуномодулирующего эффекта группы заявляемых препаратов является рациональная активация цитокинов, опосредующих механизмы противоинфекционного иммунитета. Среди ключевых медиаторов иммунитета, играющих важную роль в иммунитете к вирусным и бактериальным инфекциям с внутриклеточным паразитированием, главным представляется -интерферон. БАФ из ЛПС Shigella sonnei является мощным индуктором -ИФН in vivo в дозе 100 мкг.

БАФ, заявляемые в настоящем патенте, могут быть использованы не только как вакцины, но и как вакцинные носители для конструирования конъюгированных вакцин для млекопитающих, включая человека. С использованием конъюгирующих агентов, в частности карбодиимида, был получен конъюгат капсульного полисахарида вакцинного качества S.typhi (Vi-антигена) с БАФ Sh.sonnei, выбранной в качестве носителя. Конъюгаты, связанные прочной амидной связью, были стабильны в диссоциирующих условиях. БАФ может быть использована также в качестве носителя для белковых антигенов, что особенно важно, вследствие практически полного отсутствия таких матриц в вакцинологии.

Следует подчеркнуть возможность конструирования вакцин и иммуногенов на основе заявляемых БАФ без создания ковалентных химических связей между полимерными молекулами. Нами установлен факт включения в состав высокомолекулярных мицелл, формирующихся при самосборке БАФ, модельного белкового антигена - сывороточного альбумина человека. Подобные "квазиконъюгированные" вакцины представляют собой высокомолекулярные 1000-5000 Кд комплексы, включающие молекулы необходимых антигенов и мицеллообразующего иммуностимулирующего носителя БАФ.

Отдельного рассмотрения требует вопрос об архитектонике надмолекулярных структур ЛПС, которые существуют во внешней мембране клеточной стенки грамотрицательных бактерий и явным образом разрушаются в процессе экстракции, но воссоздаются вновь после удаления полимерных и низкомолекулярных бактериальных компонентов в процессе очистки ЛПС. Выделенные ЛПС в водных растворах склонны к самоорганизации в структуры, которые, как показано с помощью электронной микроскопии (1, гл.11), напоминают фрагменты бактериальной мембраны.

Таким образом, группа заявляемых препаратов представляет собой высокоиммуногенные клинически применимые БАФ, содержащие преимущественно S-ЛПС с низким уровнем эндотоксичности и пирогенности, в состав которого входит липид А, жирнокислотный состав которого может отличаться от жирнокислотного состава, определенного для исходного суммарного ЛПС данного микроорганизма.

ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР ЧЕРТЕЖЕЙ

Полученные продукты по настоящему изобретению были подвергнуты анализу с помощью ЯМР-спектроскопии и хроматомасс-спектрометрии.

Фиг.1 демонстрирует спектр ¹³С-ЯМР О-специфического полисахарида Sh.sonnei.

Фиг.2 демонстрирует спектр ¹Н-ЯМР О-специфического полисахарида Sh.sonnei.

Фиг.3 демонстрирует хроматограмму метанолизата липида А, выделенного из БАФ Sh.sonnei.

Фиг.4 демонстрирует хроматограмму метанолизата липида А из ЛПС Sh.sonnei, выделенного по методу Вестфаля.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры, приведенные в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеют цели ограничения притязаний настоящего изобретения.

Пример 1.

I. Экстракция

Экстракцию высушенных ацетоном бактериальных клеток Sh.sonnei. фаза 1 (20 г) проводили 45%-ным водным фенолом (700 мл) при интенсивном механическом перемешивании в термостатированном при 68-72°С сосуде в течение 15 минут, охлажденную до 10-15°С суспензию подвергали центрифугированию в течение 40 минут при 5000 g, верхний водный слой отделяли и диализовали в течение 5 суток против дистиллированной воды, нерастворимый осадок отделяли центрифугированием при 13,000 g и супернатант лиофилизовали. Выход продукта экстракции составил 12% от веса сухих клеток. Содержание нуклеиновых кислот (УФ-поглощение) и белков (метод Лоури) составляло 35-40% и 10-15%, соответственно. Полученный таким образом продукт экстракции (начальная концентрация 100 мкг/мл) был активен в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) с кроличьей сывороткой, полученной при иммунизации убитой культурой Sh.sonnei, фаза 1, в разбавлении 1:128.

II. Ферментативный гидролиз

2 г сырого экстракта, содержащего в основном ЛПС, нуклеиновые кислоты и водорастворимые белки, растворяли в 100 мл буфера, содержащего 0,2М NaCl, 0,05М ТРИС-HCl и 0,001М MgCl ₂H CaCl₂, рН 7,2-7,6, полученный раствор перемешивали 2 часа при температуре 37°С с рибонуклеазой А (активность 50-100 единиц/мг, 50 мкг/мл раствора) и дезоксирибонуклеазой (активность 400-800 единиц/мг, 5 мкг/мл раствора), далее к раствору прибавляли протеиназу К (активность 10-20 единиц/мг, 20 мкг/мл раствора), раствор перемешивали 1 час при температуре 50°С. Реакционную смесь диализовали 3 суток против дистиллированной воды и лиофилизовали.

III. Ультрацентрифугирование

1 г продукта, полученного на стадии II, растворили в 120 мл воды, ультрацентрифугирование раствора проводили с использованием ультрацентрифуги Бекман (США) при температуре 5°С, ускорении 80,000 g в течение 8 часов. Полученный супернатант лиофилизовали.

IV. Выделение БАФ с помощью экстракции.

При необходимости вместо стадии III проводили экстракцию смесью хлороформ-метанол-0,2М водн. HCl. Для получения БАФ Sh.sonnet использовали указанную выше смесь при соотношении компонентов 14:13:5; содержание твердой фазы 10 мг/мл.

V. Фракционирование на пористых матрицах.

При необходимости вместо стадии III и/или IV использовали препаративный электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле, (толщина геля 1,5 мм, подвижность БАФ относительно бромфенолового синего 0,1-0,3; элюцию проводили с помощью Whole Gel Eluter, Bio-Rad) или гидрофобную хроматографию (колонка с октил-Сефарозой в буфере, содержащем 10% пропанола и 0,05М бикарбоната аммония, рН 8,1) или с помощью гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-50 (1,5M водный бикарбонат аммония) или ультрафильтрацию с помощью системы Pellicon (Millipore) (мембрана с "cut-off" 10kD) или ионообменную хроматографию на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (0.01-0.75 М градиент бикарбоната аммония).

VI. Очистка БАФ

Обессоливание БАФ после фракционирования, если необходимо, проводили с помощью гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4B-CL в воде или 0,05М пиридин-ацетатном буфере при температуре 4°С, фракции, содержащие БАФ, которые элюировались вблизи свободного объема колонки, объединяли и лиофилизовали.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Выделение БАФ из неочищенного ЛПС Sh.sonnet с использованием различных методов фракционирования
Стадия	Метод	Выход апирогенной (в дозе 0,050 мкг/кг веса кролика) БАФ в % веса сырого ЛПС
III	Ультрацентрифугирование	3-5%
IV	Экстракция ЛПС смесью хлороформ-метанол-0,2 М HCl	<1%
V	Препаративный гель-электрофорез в ПААГ	1-3%*
V	Ультрафильтрация на мембранах фирмы "Millipore"	5-7%*
V	Ионообменная хроматография	<1%
V	Гидрофобная хроматография	3-5%
V	Гель-хроматография	3-5%
* - доза снижена до 0,0125-0,0250 мкг/кг веса кролика из-за того, что в более высокой дозе продукт пирогенен.

ПРИМЕР 2. Подтверждение строения О-специфического полисахарида и липида А, выделенных из БАФ Sh.sonnei, с помощью ЯМР-спектроскопии и хроматомасс-спектрометрии.

O-Специфический полисахарид и липид А были выделены из БАФ Sh.sonnei в результате мягкого кислотного гидролиза и последующего осаждения нерастворимого липида А.

Спектры ¹³С-ЯМР и ¹Н-ЯМР О-специфического полисахарида (фиг.1 и 2, соответственно) были записаны с использованием прибора Brucker WM-250 в растворе D ₂O (образец перед съемкой ¹Н был лиофилизован из D₂O) при температуре 297 К или 303 К.

Анализ спектральных данных, полученных по методикам COSY, TOCSY и ROESY, позволил сделать однозначное отнесение всех сигналов в спектрах ¹³С-ЯМР и ¹Н-ЯМР и подтвердить, что повторяющееся звено ПС представляет собой -(1-3)-связанный дисахарид 2-ацетамидо-2-дезокси-4-O-(2-ацетамидо-4-амино-2,4,6-тридезокси--D-галактопиранозил)-L-альтропиранозилуроновую кислоту.

Жирнокислотный состав липида А из БАФ Sh.sonnei был установлен с помощью метода ГЖХ-МС при использовании метиловых эфиров жирных кислот, образующихся из липида А в результате метанолиза (1М HCl в МеОН, 100°С, 6 часов). Хроматограммы метанолизата липида А, выделенного из БАФ Sh.sonnei, и липида А из ЛПС, выделенного по методу Вестфаля, приведены на фиг.3 и 4, соответственно.

ПРИМЕР 3. Получение конъюгата БАФ Sh.sonnei и Vi-антигена Salmonella enterica sv typhi

К раствору 20 мг Vi-антигена в 2 мл воды прибавляли при перемешивании при комнатной температуре в течение 10 минут 20 мг 1-этал-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, поддерживая рН около 5,0 прибавлением 0.1 М HCl. Через 30 минут перемешивания при рН=5,0 к реакционной смеси прибавляли раствор 5 мг БАФ Sh.sonnei. Реакционную смесь перемешивали ночь при температуре 10-12°С, диализовали в течение 3 суток против дистиллированной воды и лиофилизовали. Полученный продукт подвергли гель-хроматографии на колонке (1Х100) с Сефакрилом S1000 (предел эксклюзии >8×10 ⁸ D) в 0,2 М NaCl. Фракции, элюирующиеся вблизи свободного объема колонки (выход после диализа 7 мг), были активны в РТПГА с сыворотками против ЛПС Sh.sonnei, фаза I и Vi-антигена S.typhi. Исходные антигены элюировались с колонки с гораздо большим временем удерживания. Приведенные выше данные указывали на образование высокомолекулярного конъюгата, в состав которого входят оба исходных антигена, соединенных амидными связями, что позволяет использовать БАФ в качестве матрицы для присоединения антигенов различной природы. В рамках данного подхода появляется также возможность модификации БАФ с помощью различных спейсерных группировок и, т.о., создания "мостиковых" структур, связывающих макромолекулы антигенов.

ПРИМЕР 4. Получение ассоциата БАФ Sh.sonnei с человеческим сывороточным альбумином.

Возможность образования ассоциата БАФ Sh.sonnei с белками определяли с помощью гель-хроматографии.

0.5 мг БАФ Sh.sonnei растворили в 1 мл 0.9% NaCl, полученный раствор нагревали при 60°С в течение 15 минут и подвергли гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4B-CL, уравновешенной 0,9% NaCl. Было показано, что БАФ Sh.sonnei элюируется с колонки вблизи свободного объема. Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в этих условиях элюировался с Kd=0,67, а холерный анатоксин с Kd=0,85. Для образования ассоциата раствор БАФ Sh.sonnei (концентрация 10 мг/мл) смешивали с равным объемом раствора ЧСА (концентрация 1 мг/мл) и термостатировали при 60°С в течение 15 минут. Полученную смесь наносили на колонку (1×100 см) с сефарозой 4B-CL, уравновешенной 0.9% NaCl. Об образовании ассоциата судили по полному отсутствию пика в районе Kd=0,67 и по наличию единственного пика, элюирующегося со свободным объемом колонки. Аналогичные результаты были получены при анализе ассоциата БАФ Sh.sonnet и холерного анатоксина.

Таким образом, способность образовывать ассоциаты, в которых отсутствует ковалентная связь между макромолекулами антигенов липополисахаридной и белковой природы, открывает возможность использования БАФ в качестве носителя для белковых антигенов.

ПРИМЕР 5. Определение уровня пирогенности препаратов БАФ в экспериментах на кроликах

Пирогенность препаратов БАФ Sh.sonnei, фаза I, Sh.flexneri, Sh.dysenteriae, type 1, 5. enterica sv typhi, Escherichia coli 055 определяли в сравнении с образцами ЛПС, полученных по методу Вестфаля из тех же штаммов эндотоксичных микроорганизмов. Тест проводился на кроликах в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XII изд. и Европейской Фармакопеи, USP. Определение пирогенности проводили на 3-х кроликах породы Шиншилла массой 2,80-3,05 кг. После введения препарата трижды измеряли ректальную температуру кроликов с интервалом в 1 час. Апирогенным считали препарат, для которого суммарное (на трех кроликов) повышение температуры не превышало 1,15°С. Результаты измерения температуры представлены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 следует, что всем ЛПС, выделенным по методу Вестфаля, присущ высокий уровень пирогенности, тогда как БАФ, заявляемые в настоящем патенте, в дозе 0,050 мкг на кг массы тела кролика пирогенного эффекта у кроликов не вызывают. По уровню пирогенности они соответствуют требованиям Технического Комитета экспертов ВОЗ для полисахаридных вакцин.

Таблица 2. Пирогенность препаратов БАФ.
Препарат	Данные измерения температуры	Результат определения уровня пирогенности
Вакцина ВИАНВАК 1)	(0.; 0.3; 0.3) 0.7	Апирогенен
Вакцина TYPHIMVi2)	(0.2, 0.5, 0.2) 0.9	Апирогенен
БАФ Sh.flexneri 2а	(0.5, 0.2, 0.4) 1.1	Апирогенен
БАФ Sh.sonnei, фаза 1	(0.5, 0.2, 0.3) 1.0	Апирогенен
БАФ Sh.dysenteriae, type 1	(0.2, 0.5, 0.3) 1.0	Апирогенен
БАФ Salmonella enterica sv typhi	(0.3, 0.3, 0.5) 1.1	Апирогенен
БАФ Escherichia coli	(0.2, 0.4, 0.3) 0.9	Апирогенен
ЛПС Sh."flexneri 2a	(0.8, 0.6, 0.8) 2.2	Высокопирогенен
ЛПС Sh.dysenteriae, type 1	(1.3, 1.2, 1.0) 3.6	Высокопирогенен
ЛПС Escherichia coli (Sigma)	(1.5, 1.0, 1.0) 3.5	Высокопирогенен
ЛПС Sh.sonnei, фаза 1	(1.4, 1.0, 0.9) 3.3	Высокопирогенен
ЛПС Salmonella enterica sv typhi (Sigma)	(1.6, 1.1, 0.9) 3.6	Высокопирогенен
1) Коммерческий образец Vi-антигенной полисахаридной брюшно-тифозной вакцины предприятия "Гритвак", Россия 2) Коммерческий образец Vi-антигенной полисахаридной брюшно-тифозной вакцины фирмы "Пастор-Мерье", Франция

ПРИМЕР 6. Определение эндотоксичности препаратов ЕАФ в экспериментах на мышах, сенсибилизированных к эндотоксическому шоку D-галактозамином.

Оценку эндотоксичности проводили на специальной модели in vivo на беспородных мышах, сенсибилизированных D-галактозамином (D-GalN)- гепатотоксическим агентом, резко повышающим чувствительность мышей к продукции эндогенного фактора некроза опухолей (ФНО), индуцированному ЛПС. Чувствительность организма к токсическим продуктам макрофагов повышается без модификации истинной причины эндотоксичности реактивности макрофагов в ответ на ЛПС. Мышам весом 18-20 грамм внутрибрюшинно вводили 15 мг D-GalN совместно с образцом БАФ или ЛПС, полученных по методу Вестфаля. Выживаемость мышей в группах по 5 животных определяли в течение 48 часов (см. табл. 3). Полная выживаемость мышей была зарегистрирована при введении препаратов БАФ в дозах: БАФ Sh.sonnet фаза 1-100 мкг, БАФ Sh.flexneri - 1 мкг, БАФ Sh.dysenterlae type 1-10 мкг, БАФ Salmonella enterica sv typhi -1 мкг. Выживаемость мышей при введении препаратов ЛПС, полученных по методу Вестфаля, отмечалась в интервале доз, в 1000 раз более низким по сравнению с БАФ.

ПРИМЕР 7. Побочные реакции при клиническом применении БАФ на взрослых добровольцах.

Препарат БАФ Sh.sonnet вводили однократно, двукратно и трехкратно с интервалом 3-4 недели подкожно 1765 взрослым добровольцам под контролем Национального Контрольного Органа Минздрава РФ в верхнюю треть плеча в качестве дизентерийной кандидат-вакцины в дозах 25, 50, 75 мкг в фенол-фосфатном буфере в качестве растворителя. В течение 72 часов регистрировали возникновение токсических реакций, которые относили к трем группам: симптомы эндотоксического шока, общие побочные реакции, местные побочные реакции.

Таблица 3. Определение эндо токсичности препаратов при введении беспородным белым мышам, сенсибилизированым D-GalN.
Препарат	Выживаемость мышей после введения 15 мг D-GalN+препарат ЛПС в дозе (мкг)
	0,001	0,01	0,1	1,0	10	100	400
БАФ Sh.flexneri 2а	ND	ND	100%	100%	0%	0%	0%
БАФ Sh.sonnei	ND	ND	100%	100%	100%	100%	60%
БАФ Sh.dysenteri ае type 1	ND	ND	100	100%	100%	0%	0%
БАФ Salmonella enterica sv typhi	ND	100%	100%	100%	0%	0%	0%
ЛПС Sh.sonnei	0%	0%	0%	0%	0%	ND	ND
ЛПС S. Typhimurium (Sigma, USA)	0%	0%	0%	0%	0%	ND	ND

Симптомы эндотоксического шока: тахикардия, падение давления, резкое повышение температуры не было отмечено ни у кого из 1765 добровольцев в возрасте от 17 до 65 лет, получивших препарат одно- или многократно.

Общие побочные реакции: недомогание, головная боль, тошнота, понос, насморк, боли в животе, озноб, головокружение, отслеживаемые на 129 добровольцах в двух контролируемых клинических опытах с использованием плацебо, не были зарегистрированы при одно- или двукратном введении доз 25, 50 и даже 75 мкг.

Незначительные местные побочные реакции: болезненность и покраснение были обнаружены в 7,47% и 8,3% случаев, соответственно. Такие местные реакции как возникновение инфильтратов, абсцесса, лимфангоита, болезненность или увеличение региональных лимфузлов обнаружены не были.

Таким образом, комплекс побочных реакций был оценен как слабый.

ПРИМЕР 8. Температурные реакции при клиническом применении БАФ на взрослых добровольцах.

Препарат БАФ Sh.sonnet вводили однократно, двукратно и трехкратно с интервалом 3-4 недели подкожно 129 взрослым добровольцам в верхнюю треть плеча в качестве дизентерийной кандидат-вакцины в дозах 25, 50, 75 мкг в фенол-фосфатном буфере в качестве растворителя. В течение 72 часов регистрировали возникновение температурных реакций, которые относили к трем группам - слабые <37,5°С, средние 37,6-38,5°С, сильные >38,6°С. Сильные и средние температурные реакции не зарегистрированы ни у одного из добровольцев при всех использованных схемах и дозах иммунизации. Слабое повышение температуры тела до 37,5°С наблюдалось сравнительно редко (не более 5-10% привитых), и этот показатель достоверно не отличался от количества температурных реакций в группе плацебо.

ПРИМЕР 9. Побочные и температурные реакции при клиническом применении БАФ на детях.

Препарат БАФ Sh.sonnei вводили однократно и двукратно с интервалом 4 недели подкожно в верхнюю треть плеча в качестве дизентерийной кандидат-вакцины в дозах 25 и 50 мкг в фенол-фосфатном буфере 35 детям в возрасте от 2,8 до 6 лет, 21 детям от 7 до 10 лет, 18 детям от 10 до 14 лет под контролем Национального Контрольного Органа Минздрава РФ.

Комплекс побочных реакций оценен как "слабый".

Симптомы эндотоксического шока - резкая тахикардия, падение давления, резкое повышение температуры - не были отмечены ни у одного из 74 детей в возрасте от 2,8 до 14 лет, получивших препарат одно- или многократно.

Общие побочные реакции - недомогание, головная боль, тошнота, понос, насморк, боли в животе, озноб, головокружение - также не были зарегистрированы (таблица 4).

Незначительные местные побочные реакции (болезненность) были обнаружены в 2,7% случаев.

Температурных реакций в виде сильного и среднего повышения температуры тела не наблюдалось у детей при всех использованных схемах и дозах иммунизации. Слабое повышение температуры тела до 37,5°С было обнаружено у 5,4% привитых.

ПРИМЕР 10. Индукция фактора некроза опухолей у добровольцев при подкожном введении вакцинных доз препарата БАФ.

Проводили изучение продукции фактора некроза опухолей (ФНО) через 3 часа как после первичной, так и после вторичной глубокой подкожной иммунизации БАФ Sh.sonnei в дозах 50 и 75 мкг и сравнивали с фоновым уровнем. Содержание ФНО определяли с помощью тест-системы "Pro Cont-TNF" и выражали в пг/мл.

Статистически значимого повышения уровня ФНО основного медиатора эндотоксической реакции - даже в максимальной дозе 75 мкг обнаружено не было (таблица 5).

Таблица 5. Отсутствие индукции фактора некроза опухолей у добровольцев после иммунизации препаратом БАФ.
Доза БАФ Sh.sonnei, Мкг		Фактор некроза опухоли, пг
	N*	До вакцинации	Через 3 часа после вакцинации	До ревакцинации	Через 3 часа после ревакцинации
50	10	208,42153,82	150,76±35,98	118,82±23,99	143,49±16,66
75	12	172,41±49,44	244,31±74,17	79,13±12,58	140,02±38,03
N*- количество тестированных пар сывороток, полученных от добровольцев

ПРИМЕР 11. Анализ серологической активности 0-антигенных детерминант в препаратах БАФ.

Серологическую активность препаратов БАФ Sh.sonnei, Sh.flexneri 2a, Sh.dysenteriae type 1, Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055 определяли в реакции торможения пассивной гемагглютинации с использованием соответствующего коммерческого эритроцитарного диагностикума (МНИИЭМ, Россия) и монорецепторной O-сыворотки Sh.sonnei, Sh.flexneri 2a, Sh.dysenteriae type 1, S. enterica sv typhi, E.coli 055 (СПбНИИВС, Россия; МНИИЭМ, Россия; Diagnostic Pasteur, Франция). В лунки вносились последовательно образцы препаратов БАФ или ЛПС, полученных по методу Вестфаля, в концентрации 50 мкг/мл. Концентрацию соответствующей антисыворотки доводили до 4 ГЕ. Минимальную концентрацию, вызывающую торможение реакции после добавления эритроцитарного диагностикума - точку торможения - выражали в мкг/мл.

В таблице 6 представлены точки торможения для различных образцов БАФ, образцов ЛПС. Серологическая активность БАФ не отличалась от таковой для соответствующих ЛПС. Таким образом, в процессе получения БАФ, описанного в примере 1 настоящего патента, не происходило изменения строения О-специфических полисахаридных цепей, а их антигенная активность оставалась высокой.

Таблица 6. Концентрации торможения РПГА для различных образцов БАФов Sh.sonnei, Sh.flexneri 2a, Sh.dysenteriae type 1, Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055.
Образец	Концентрация торможения мкг/мл
БАФ Salmonella enterica sv typhi	1,56
ЛПС Salmonella enterica sv typhi	1,56
O-ПС Salmonella enterica sv typhi	12,5
БАФ Escherichia coli 055	3,12
ЛПС Escherichia coli 055	1,56
БАФ Sh.flexneri 2a	1,56
ЛПС Sh.flexneri 2a	0,78
БАФ Sh.dysenteriae type 1	0,37
ЛПС Sh.dysenteriae type 1	1,56
БАФ Sh.sonnei	3,125
O-ПС Sh.sonnei	25
ЛПС Sh.sonnei	3,125

ПРИМЕР 12. Активация гуморального иммунного ответа препаратами БАФ в экспериментах на лабораторных животных.

Для определения индукции гуморального иммунного ответа мышей (СВАХС57 В1/6) FI внутрибрюшинно иммунизировали сериями препаратов БАФ Sh.sonnei, Sh.flexneri 2a, Sh.dysenteriae type 1 в дозах 400, 100, 10, 1, и 0,1 мкг на мышь. В другом эксперименте мышей иммунизировали сериями препаратов БАФ Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055 в дозах 1,10, 50 мкг на мышь. Через 15 и/или 30 дней у животных забирали сыворотку периферической крови и определяли уровень О-специфических антител в ELISA-тесте и РПГА. Препараты БАФ стимулируют иммунный ответ после однократного введения, титр анти-О антител определяется на 15 сутки, причем максимальный иммуногенный эффект наблюдается в интервале доз 10 - 50 мкг/мышь. В периферической крови определяли существенное количество антител основных классов IgG, IgM, IgA к гомологичному ЛПС.

ПРИМЕР 13. Индукция адаптивного иммунитета к брюшному тифу при иммунизации лабораторных животных БАФ Salmonella enterica sv typhi.

Мышей (СВАХС57 В1/6) FI внутрибрюшинно иммунизировали препаратом БАФ S. enterica sv typhi и ЛПС S. enterica sv typhi, полученного по методу Вестфаля в дозах 25, 5, 1, 0.2, 0.04, 0.008, 0.0016 мкг. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор. Через 12 дней группы животных заражали дозой 1000 м. к. (50 ЛД ₅₀) вирулентного штамма брюшного тифа Ту2 №4446 в стерильном физиологическом растворе, содержащем 5% муцина. Выживаемость животных в группах регистрировали в течение 7 дней. Как высокоэндотоксичный ЛПС, так и низкоэндотоксичный БАФ индуцировали адаптивный противоинфекционный иммунитет к брюшному тифу и обеспечивали высокий уровень защиты животных (80-100%) от заражения брюшным тифом при введении в дозах 25-5 мкг (см. табл. 7.). В контрольной группе все животные погибли. ED₅₀ БАФ - 0,037 мкг; ED₅₀ - ЛПС - 0,081 мкг.

Таблица 7. Индукция адаптивного иммунитета к брюшному тифу при иммунизации лабораторных животных БАФ Salmonella enterica sv typhi.
Доза иммунизации, (мкг)	Выживаемость мышей, иммунизированных БАФ S. enterica sv typhi и зараженных 1000 клеток штамма S. enterica sv typhi Ty2	Выживаемость мышей, иммунизированных ЛПС S. enterica sv typhi и зараженных 1000 клеток штамма S. enterica sv typhi Ty2
25	10/10	8/10
	8 /10	7/10
1	5/10	6/10
0,2	8/10	6/10
0,04	6/10	4/10
0,008	5/10	6/10
0,0016	2/10	4/10
-	0/10	0/10

ПРИМЕР 14. Индукция местного иммунитета к инфекции Sh.sonnei после системной иммунизации лабораторных животных БАФ Sh.sonnei (тест Sereny).

Морских свинок весом 200-250 г иммунизировали подкожно БАФ Sh.sonnet в дозах 25, 50 мкг в область спины двукратно с интервалом в 10 дней. Контрольным животным вместо препарата вводили физ. раствор. Через 10 дней после последней иммунизации животным вводили в конъюнктиву глаза суспензию клеток вирулентного штамма Sh.sonnei 5063 в дозе, близкой к ИД₁₀₀ (2×10 ⁹ клеток), и в дозе, близкой к 2ИД₁₀₀ (4×10 ⁹ клеток), в 30 мкл стерильного физ. раствора. У всех животных контрольной группы 5, инфицированных дозой 4×10 ⁹ клеток, и у 75% животных контрольной группы 6, инфицированных дозой 2×10⁹ клеток, развился дизентерийный кератоконъюнктивит (см. табл. 8). Двукратная иммунизация дозой 50 мкг обеспечивала защиту 55% глаз животных при заражении дозой 4×10⁹ клеток и 75% защиту глаз животных при заражении дозой 2×10 ⁹ клеток. Двукратная иммунизация дозой 25 мкг обеспечивала защиту 75% глаз животных при заражении дозой 4×10⁹ клеток и 80% защиту глаз животных при заражении дозой 2×10 ⁹ клеток. Таким образом, при подкожной иммунизации препаратом БАФ Sh.sonnei регистрировался выраженный местный противоинфекционный иммунитет.

ПРИМЕР 15. Активация препаратом БАФ системного иммунного ответа при иммунизации взрослых добровольцев.

Изучение иммуногенности БАФ Sh.sonnei в качестве кандидата дизентерийной вакцины против шигеллеза Зонне проводилось в условиях контролируемого опыта при иммунизации взрослых лиц в возрасте 18-22 года под эгидой Национального Контрольного Органа Минздрава РФ. Системный иммунный ответ к БАФ Sh.sonnei изучали путем исследования парных порций сывороток венозной крови, полученной от привитых до иммунизации и через 28-30 дней после иммунизации, тестах РПГА, и ИФА, используя коммерческий набор (серия 3 К 60) для диагностики дизентерии Зонне, выпускаемый НИИЭМ им. Габричевского, и ИФА-тест-систему на основе ЛПС Sh.sonnei для определения сывороточных антител IgG, IgA, IgM классов. Всего было исследовано 380 сывороток, полученных от привитых БАФ Sh.sonnei, и плацебо.

Отмечено 18,5-кратное увеличение среднегеометрических титров агглютинирующих, 5,9-кратное IgG, 2,6-кратное IgM, 19,3-кратное IgA специфических анти-ЛПС Sh.sonnet антител (СТГА) после вакцинации в группе.лиц, привитых БАФ Sh.sonnei (табл.9). СГТА в группе лиц, получивших плацебо, до и после вакцинации статистически значимо не различались.

Таблица 8. Индукция местного иммунитета к инфекции Sh.sonnei после системной иммунизации лабораторных животных БАФ Sh.sonnei (тест Sereny).
№ п/п	Доза вакцины	Доза заражения	Заражено животных	Заражено глаз	Число глаз с кератоконъюнктивитом	Число глаз, защищенных от кератоконъюнктивита	Процент защищенных глаз
1	50 мкг. 50 мкг	0,4×10 10 кл./глаз	10	20	9	11	55%
2	50 мкг. 50 мкг	0,2×1010 кл./глаз	10	20	5	15	75%
3	25 мкг. 25 мкг	0,4×1010 кл./глаз	10	20	5	15	75%
4	25 мкг. 25 мкг	0,2×1010 кл./глаз	10	20	4	16	80%
5	Контроль	0,4×1010 кл./глаз	10	20	20	0	0%
6	Контроль	0,2×1010 кл./глаз	10	20	15	5	25%

Процент лиц с четырехкратным и более подъемом антител - сероконверсиями в группе привитых БАФ Sh.sonnei составил через месяц после вакцинации 94,7% для агглютинирующих антител, 71,6% для IgG, 51% для IgM, 77% для IgA анти-O-антител.

Совокупность клинико-иммунологических данных свидетельствует о высоком уровне активации системного гуморального иммунного ответа к БАФ Sh.sonnei у добровольцев, в особенности его IgA звена.

ПРИМЕР 16. Активация препаратом БАФ иммунного ответа на слизистых при иммунизации взрослых добровольцев.

Наличие специфических секреторных антител к ЛПС изучали в парных образцах слюны добровольцев (30 чел.), полученных до и через 4 недели после иммунизации БАФ Sh.sonnei. Все образцы слюны и копрофильтратов были зашифрованы, объединены в блоки и хранились до тестирования при температуре - 18-20°С.

Для определения антител были использованы методы РПГА и ИФА с применением моноклональных антител к секреторному компоненту IgA (клон GA) и к j-цепи IgA.

В РПГА наблюдали статистически значимое увеличение показателей титров антител в слюне после вакцинации, при этом у 72% лиц были выявлены 4-х кратные конверсии антител в слюне, а кратность нарастания титра антител составила 4,21. В ИФА выявили статистически значимое увеличение среднегеометрического титра для О-специфических IgG, IgA антител, а также для IgA с секреторным компонентом (sIgA), тестируемым в слюне; кратность нарастания титра антител составила соответственно 5,47, 4,37 и 4,0 (таблица 10).

Таблица 10. Среднегеометрические значения титров антител, тестируемых в слюне добровольцев до и после иммунизации БАФ Sh.sonnei.
Антитела	Число исследованных	Среднегеометрические титры анти-ЛПС антител		Кратность нарастания
	образцов слюны	До вакцинации	Через 4 недели после вакцинации
Агглютинирующие	30	2,4	10,1	4,21
IgG	30	9,2	50,3	5,47
IgA	30	358	1563	4,37
SIgA	30	18,2	72,8	4,0

ПРИМЕР 17. Активация препаратом БАФ системного иммунного ответа при иммунизации детей.

Методом случайной выборки (единица выборки 1 ребенок) были сформированы 3 группы детей: 1-ю группу 35 человек составили дети в возрасте 2.8-6 лет; 2-ю группу 21 человека составили дети в возрасте 7-10 лет; 3-ю группу 18 человек составили дети в возрасте 11-14 лет. 69 детей были подкожно проиммунизированы препаратом БАФ Sh.sonnei в дозе 50 мкг, за исключением пяти детей в возрасте 2,8-4 года, получивших дозу 25 мкг. Системный О-ЛПС специфический иммунный ответ изучали путем исследования парных порций сывороток венозной крови, полученной от 41 привитых до иммунизации и через 14 дней после иммунизации, тестах РПГА, и ИФА, используя коммерческий набор (серия 3 К 60) для диагностики дизентерии Зонне, выпускаемый НИИЭМ им. Габричевского и ИФА тест-систему.

Процент 4-х кратных сероконверсий суммарно во всех группах детей, получавших БАФ Sh.sonnei, через 14 дней после вакцинации составил для агглютинирующих, IgG, IgM, IgA антител соответственно 90,2%, 73%, 48,7%, 92,7%. В первой группе вакцинированных (дети 2,8-6 лет) процент четырехкратных сероконверсий составил для агглютинирующих, IgG, IgM, IgA антител соответственно 100%, 57%, 71%, 85,7%. во второй группе (дети 7-10 лет) - 71,4%, 66,7%, 44,4%, 85,7% и третьей (11-14 лет) - 89,5%, 88,7%, 33,3%, 100%.

Среднегеометрические титры анти-O агглютинирующих антител (СГТА) существенно выше после вакцинации в группах детей, привитых БАФ Sh.sonnei, по сравнению с фоновым уровнем (табл.13). СГТА IgG антител до иммунизации в группах вакцинированных составило 44, 74, 71 соответственно в 1-й, 2-й и третьей группах (таблица 13), а через 14 дней после вакцинации 168, 435 и 593 соответственно, а кратность увеличения титра антител - 3.8, 5.9 и 8.9. Нарастание уровня IgM анти-О антител среди иммунизированных препаратом БАФ Sh.sonnei было меньше, тем не менее, статистически значимо во всех группах иммунизированных. Следует отметить выраженную индукцию БАФ Sh.sonnei анти-O IgA антител, играющих ключевую роль в иммунитете против дизентерии. Прирост IgA антител наблюдался значительнее всего, а именно, до иммунизации СГТА составил 42, 44, 58,7, а после 411, 1164, 1280, а кратность увеличения титра антител составила 6,6; 17,3; 21,7 раза (таблица 11).

ПРИМЕР 18. Индукция толерантности к эндотоксину препаратами БАФ.

Для определения индукции толерантности к липополисахариду мышей (СВАХС57 В1/6) F1 (8 мышей на группу) внутрибрюшинно иммунизировали препаратами БАФ Sh.sonnei. Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055 в дозах 0,1, 1,0, 10,0 мкг на мышь. В качестве контролей использовали ЛПС Sh.sonnei, вводимого в тех же дозах и апирогенный физиологический раствор. Через 12 часов с целью создания модели эндотоксического шока животных иммунизировали препаратом ЛПС в дозе 0,1 мкг на мышь внутрибрюшинно совместно с 15 мкг D-галактозамина. Данная доза ЛПС была определена ранее как абсолютно летальная (100 ЛД₅₀). В группах животных, иммунизированных БАФ Sh.sonnei, S. enterica sv typhi, E.coli 055, а также ЛПС Sh.sonnei, выживаемость животных составила 100% вследствие индукции толерантности. В контрольной группе, получившей физиологический раствор, все животные погибли в течение 24 часов. Таким образом, низкоэндотоксичные БАФ Sh.sonnei, S. enterica sv typhi, E.coli 055, также как и классический ЛПС Sh.sonnei, обладали выраженным толерогенным эффектом в интервале доз 0,1-10 мкг.

ПРИМЕР 19. Контролируемая индукция раннего -ИФН in vivo препаратом БАФ.

Для изучения продукции -ИНФ мышей (СВАХС57 В1/6) внутрибрюшинно иммунизировали препаратом БАФ Sh.sonnei и ЛПС Sh.sonnei в дозах 10 и 100 мкг. У животных забирали сыворотку периферической крови в ранее выбранной пиковой точке - через 7,5 часов. Концентрацию -ИНФ определяли с использованием тест-системы OptEIA Mouse IFN-((Pharmagen). Как видно из таблицы 12, препараты БАФ вызывали увеличение концентрации -ИФН в сыворотке. Для БАФ Sh.sonnei отмечен зависимый от дозы эффект увеличения продукции -ИФН.

Таблица 12. Контролируемая индукция раннего -ИФН in vivo препаратом БАФ.
Препарат	Концентрация -ИФН, пг/мл
	10 мкг/мышь	100 мкг/мышь
ЛПС Sh.sonnei	541±158	10391728
БАФ Sh.sonnei	55±50	407±253
Контроль	25±25	50±48

ПРИМЕР 20. Индукция резистентности у мышей к инфекции Stahyilococcus aureus препаратом БАФ Shigella sonnei, Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055.

Для выявления индукции резистентности к Stahyilococcus aureus, штамм 209, белых мышей иммунизировали внутрибрюшинно препаратом БАФ Sh. sonnei в дозе 100 мкг/мышь (эквивалентна человеческой дозе), а через 7 суток заражали 5×10⁶ микробных клеток S. aureus, штамм 209. На 1, 2, 3, 6 и 10 сутки проводилось вскрытие мышей (по 5 мышей на срок) опытной и контрольной (интактной) групп. Из крови, печени, селезенки, брыжейки и почек производился высев на твердую питательную среду, на следующие сутки колонии типировались. Определялся индекс обсемененности: отношение положительных высевов к общему количеству проб. Динамика индекса обсемененности служила показателем неспецифической резистентности мышей к золотистому стафилококку (таблица 13).

Таким образом, препарат БАФ Sh.sonnei в дозе 100 мкг стимулировал неспецифическую резистентность к стафилококковой инфекции

ПРИМЕР 21. Индукция резистентности у мышей к инфицированию вирусом гриппа А, штамм РВА-8 с помощью БАФ Shigella sonnei, Salmonella enterica sv typhi, Escherichia coli 055.

Для изучения индукции резистентности к вирусной инфекции при действии БАФ мышей (линия СВА, самцы 18-20 г, группы по 10 животных) под легким эфирным наркозом заражали интраназально 1 DCL вируса гриппа А, штамм PRA-8. БАФ Sh.sonnei, S. enterica sv typhi, E.coli 055 вводили подкожно в дозе 100 мкг за 2 суток до заражения. Препараты БАФ вызывали 80-90% выживаемость мышей (наблюдение велось в течение 10 суток) при 85-90% гибели животных в контрольных группах. Таким образом, в описанной выше модели БАФ проявляли выраженное профилактическое действие.

ПРИМЕР 22. Противораковая активность препарата БАФ при заражении мышей DBA/2 перевиваемыми клетками мастоцитомы Р815.

Определение противораковой активности проводили на мышах DBA/2. Мышей - 10 животных на группу иммунизировали в/б препаратами БАФ S.typhi в дозах 10 мкг и 100 мкг за 24, 72 часа до и через 12, 24 часа после инъекции клетками мастоцитомы Р815. Инъекции мастоцитомы Р815 проводили в одну из задних конечностей в дозе 1×10⁵ клеток. В качестве контроля использовались мыши той же линии, которым вводили те же дозы клеток опухоли. Фиксировали процент выживаемости животных в течение 31 суток.

Двукратное введение препарата БАФ S.typhi за 24 и 72 часа в дозе 100 мкг до инъекции опухолевыми клетками - группа II или через 12, 24 часа после введения клеток опухоли - группа IV приводило к существенному увеличению продолжительности жизни этих животных по сравнению с группой, не получавшей инъекции препарата БАФ S.typhi - группа I. В то же время однократная инъекция препаратом БАФ S.typhi в дозе 10 мкг не активирует противораковый иммунитет, вне зависимости от времени введения клеток опухоли приводит к снижению показателей выживаемости (группы III, V). Таким образом, препарат БАФ S.typhi обладает защитными эффектами при опухолевом росте при дозе 100 мкг на мышь, вводимой двукратно (таблица 14.).

Таблица 14. Противораковая активность препарата БАФ при заражении мышей DBA/2 перевиваемыми клетками мастоцитомы Р815.
Сутки	Выживаемость животных, %
	I*	II*	III*	IV*	V*
0	100	100	100	100	100
7	60	100	60	100	60
11	-	80	0	80	0
15	0	-	0	-	0
17	0	-	0	-	0
19	0	60	0	60	-
31	0	20	0	60	0

I* - Контроль. Введение клеток мастоцитомы Р815.

II* - Введение БАФ S.typhi в дозе 100 мкг двукратно за 24 и 72 часа до введения клеток мастоцитомы Р815.

III* - Введение БАФ S.typhi в дозе 10 мкг за 24 часа до введения клеток мастоцитомы Р815.

IV* - Введение БАФ S.typhi в дозе 100 мкг через 12, 24 часа после введения клеток мастоцитомы Р815.

V* - Введение БАФ S.typhi в дозе 10 мкг через 24 часа после введения клеток мастоцитомы Р815.

Пример 23. Профилактическая эффективность фармацевтическую композицию на основе БАФ Sh.sonnei в качестве вакцины против шигеллеза Зонне.

Проведенные полевые испытания вакцины против шигеллеза Зонне, представляющей собой фармацевтическую композицию на основе БАФ, проведены в эндемичном по инфекции Романовском районе Саратовской области. Проведена иммунизация 3068 человек. Из них 1802 добровольца получили однократно подкожную инъекцию вакцины, а 1266 - инъекцию плацебо. Уровень заболеваемости в группе привитых составил 0,55 на 1000, в группе плацебо 7,9 на 1000. Средний индекс эффективности вакцины 92,9% за 6 месяцев наблюдения.

Препарат обеспечивал эффективную защиту гражданского населения в наиболее неблагоприятный летне-осенний период подъема заболеваемости шигеллезом Зонне.

ПРИМЕР 24. Фармацевтическая форма БАФ

Вакцинный препарат готовят в жидкой форме в объеме 0,5 мл, смешивая следующие компоненты:

Активная субстанция: БАФ Shigella sonnei	0,050 мг
Дигидроортофосфат натрия	0,052 мг
Гидроортофосфат натрия	0,017 мг
Хлорид натрия	4,150 мг
Фенол	0,750 мг
Дистиллированная вода	0,5 мл

Полученный препарат можно хранить в течение 36 месяцев при 2-8°С.

Список источников

1. Helmut Brade et al., eds. Endotoxin in Health and Disease, New York: Marcel Dekker, 1999.

2. Konadu EY, Lin FY, Ho VA, Thuy NT, Van Bay P, Thanh TC, Khiem HB, Trach DD, Karpas AB, Li J, Bryla DA, Robbins JB, Szu SC. Phase 1 and phase 2 studies of Salmonella enterica serovar paratyphi A O-specific polysaccharide-tetanus toxoid conjugates in adults, teenagers, and 2- to 4-year-old children in Vietnam. Infect Immun. 2000 Mar; 68(3): 1529-34.

3. Ashkenazi S, Passwell JH, Harlev E, Miron D, Dagan R, Farzan N, Ramon R, Majadly F, Bryla DA, Karpas AB, Robbins JB, Schneerson R. Safety and immunogenicity of Shigella sonnei and Shigella flexneri 2a O-specific polysaccharide conjugates in children. J Infect Dis. 1999 Jun; 179 (-6): 1565-8.

4. Cohen D, Ashkenazi S, Green MS, Gdalevich M, Robin G, Slepon R, Yavzori M, Orr N, Block C, Ashkenazi I, Shemer J, Taylor DN, Hale TL, Sadoff JC, Pavliakova D, Schneerson R, Robbins JB. Double-blind vaccine-controlled randomised efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults. Lancet. 1997 Jan 18; 349 (9046): 155-9.

5. Westphal, O., Lueritz, O., and Bister, F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol / Wasser. Z. Naturforsch. 7:148-155. 1952

6. Galanos С, Jiao BH, Komuro Т, Freudenberg MA, Luderitz O. Large-scale fractionation of S-form lipopolysaccharide from Salmonella abortus equi. Chemical and serological characterization of the fractions. J Chromatogr. 1988 May 25;440:397-404.

7. Mikes O et al., eds., Laboratory handbook of chromatographic and allied methods, J. Wiley, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, 1979.

8. WHO Expert Committee on Biologic Standardization. Requirements for Vi-polysaccharide typhoid vaccine. WHO Tech. Rep.Ser.1994; 840:14-33

9. Aparin P.G, Golovina M.E., Yolkina S.I., Gantcho T.V., Ershov V.I., L'vov V.L. FIRST CLINICAL INVESTIGATION OF NEW LIPOPOLYSACCHARIDES: PHASE I-II CLINICAL TRIALS OF Shigellae sonnei LPS VACCINE. Proceedings of The Third Annual Conference on Vaccine Research, Bethesda, USA, 1-2 May, 2000. Abstract S18.

10. L'vov V.L., Verner I.C., Golovina M.E., Aparin P.G. Immunobiology of low toxic & pyrogenic lipopolysaccharide from Salmonella Typhi. Medical Journal of Indonesia, Oct., 1998, V. 7, Suppi. 1: 247-251.

11. Aparin P.G., Golovina M.E., Ershov V.I., Gancho T.V., Shmigol V.L., Pavlova L.I., Chuprynina R.P., Yolkina S.I., Rachmanov R.S., and. L'vov V.L., Systemic and mucosal (local) immune response after immunization with new type low-endotoxic LPS vaccine Shigella sonnei. Proceedings of The Fourth Annual Conference on Vaccine Research, Arlington, USA, April 23-25, 2001. Abstract S6

12. Aparin P.G., Pavlova L.I., Gorbunov M.A., Golovina M.E., Gantcho T.V., Chuprinina R.P., Nemirovskaya T.I., Rachmanov R.S., Ershov V.I., Kurenkova E.В., Prochnitskaya I.A., Ankudinov I.V., Yolkina S.I., and V.L. L'vov. Phase III efficacy trials of LPS Shigella sonnei vaccine: seasonal protection against shigellosis Sonnei in mid-Volga region. Proceedings of The Fifth Annual Conference on Vaccine Research, Baltimore, USA, May 6-8, 2002. Abstract.