способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека

Формула изобретения

Способ дифференциации нормальной микрофлоры урогенитального тракта человека от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса, включающий забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов, определение способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов, отличающийся тем, что в качестве бактерицидного фактора используют антимикробный белок тромбоцитов и к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, обладающие 20%-ной и менее способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов либо не обладающие такой способностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека с целью повышения эффективности диагностики и корригирующей терапии.

Рост вялотекущих и персистирующих инфекций урогенитального тракта человека [1], вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [2], диктует необходимость поиска новых способов дифференциации нормальной микрофлоры урогенитального тракта от этиологических агентов местных инфекционно-воспалительных процессов.

Известно определение видового состава микрофлоры урогенитального тракта человека для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителей местных инфекционно-воспалительных заболеваний [3, 4].

Однако в настоящее время большинство дисбиотических и местных инфекционно-воспалительных состояний урогенитального тракта вызывается микроорганизмами, которые могут быть отнесены к нормальной либо контаминирующей микрофлоре, что затрудняет дифференциацию представителей нормальной микрофлоры от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса [4, 5, 6].

Известна дифференциация резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанная на оценке способности микроорганизмов к инактивации лизоцима [7] или их устойчивости к коммерческому препарату лейкоцитарного интерферона [8].

Однако указанные способы предназначены лишь для дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры у бактерионосителей в носовой полости и не могут быть использованы для других видов микроорганизмов и иных экологических ниш.

Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека, основанный на определении видового состава микроорганизмов и их способности к инактивации бактерицидных факторов - лизоцима (антилизоцимной активности) и комплемента (антикомплементарной активности) [9].

Существенным недостатком данного способа является необходимость определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации нескольких бактерицидных факторов (лизоцима и комплемента), что трудоемко в условиях клинической лаборатории и занимает длительное время. Кроме того, известно, что представители нормальной микрофлоры также обладают выраженной способностью к инактивации лизоцима и комплемента [10, 11], что также затрудняет дифференциацию нормальной микрофлоры от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса.

Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека, что способствует улучшению диагностических и лечебных мероприятий.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека проводят забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов, у выделенных микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, при этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.

Новым в заявляемом способе является то, что у выделенных микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, при этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, заявляемый способ путем определения способности микрофлоры урогенитального тракта к инактивации антимикробного белка тромбоцитов позволяет повысить точность диагностики воспалительных заболеваний урогенитального тракта микробной этиологии, что способствует выбору рациональной антибиотикотерапии.

Известно, что одним из бактерицидных факторов макроорганизма, играющих ключевую роль в уничтожении различных микроорганизмов, является антимикробный белок тромбоцитов [12].

Известно использование феномена способности микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов в клинике для дифференциальной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [13], а также для выбора рациональной терапии и оценки ее эффективности [14].

Авторами установлены различия в распространенности и выраженности способности к инактивации лизоцима, комплемента, антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц и больных хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (уретрит, простатит).

Антимикробный белок тромбоцитов получали известным способом [15].

Таблица 1 Распространенность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10)
микроорганизмы	Распространенность способности к инактивации бактерицидных факторов (абс./%)
	Лизоцим		Комплемент		Антимикробный белок тромбоцитов
Staphylococcus spp. (n=25)	18/72		16/64		5/20
Micrococcus spp. (n=10)	5/50		10/100		2/20
Streptococcus spp. (n=10)	7/70		9/90		1/10
Corynebacterium spp.(n=17)	14/82,4		14/82,4		1/5,9
Таблица 2 Распространенность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21)
микроорганизмы		Распространенность способности к инактивации бактерицидных факторов (абс./%)
		Лизоцим		Комплемент		Антимикробный белок тромбоцитов
Staphylococcus spp. (n=39)		36/92		31/86,1		20/51,3
Micrococcus spp. (n=5)		3/60		5/100		2/40
Streptococcus spp. (n=11)		7/63,6		9/81,8		3/27,3
Enterococcus spp. (n=15)		15/100		15/100		11/73,3
Enterobacteriaceae (n=9)		9/100		9/100		9/100
Corynebacterium spp. (n=11)		10/90,9		10/90,9		4/36,4

Способность выделенных микроорганизмов к инактивации комплемента, лизоцима, антимикробного белка тромбоцитов определяли по известным методикам [16, 17, 18].

Результаты исследований представлены в таблицах 1, 2, 3, 4. Как видно из таблиц 1 и 2, у штаммов микроорганизмов, выделенных от здоровых лиц и больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, отсутствуют достоверные различия по распространенности способности к инактивации лизоцима и комплемента. В то же время от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта достоверно чаще выделяются микроорганизмы, обладающие способностью инактивировать антимикробный белок тромбоцитов.

Таблица 3 Выраженность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10).
Микроорганизмы	Выраженность способности к инактивации бактерицидных факторов
	Лизоцим, мкг/мл	Комплемент, ан ти-СН50	Антимикробный белок тромбоцитов, %
Staphylococcus spp. (n=25)	0,7±0,5	3,6±2,7	11±2,2
Micrococcus spp. (n=10)	0,6±0,3	2,5±1,2	6,5±3,7
Streptococcus spp. (n=10)	0,8±0,5	3,47±2,03	15,0
Corynebacterium spp.(n=17)	0,7±0,3	4,3±2,1	7,0

Таблица 4 Выраженность способности к инактивации различных бактерицидных факторов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21).
микроорганизмы	Выраженность способности к инактивации бактерицидных факторов
	Лизоцим, мкг/мл	Комплемент, анти-СН50	Антимикробный белок тромбоцитов, %
Staphylococcus spp. (n=39)	2,3±0,8	7,3±2,5	27,5±2,5*
Micrococcus spp. (n=5)	1,1±0,2	11±2,2	14,5±2,5
Streptococcus spp. (n=11)	1,3±0,6	3,7±2,5	13,7±2,1
Enterococcus spp. (n=15)	2,1±0,9	7,2±2,9	34,8±2,5*
Enterobacteriaceae (n=9)	1,5±0,5	16,7±0,5	57,7±1,5*
Corynebacterium spp. (n=11)	1,2±1,2	7,4±3,2	9,5±2,5
* - p<0,05 по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых лиц.

Как видно из таблиц 3 и 4, у штаммов микроорганизмов, выделенных от здоровых лиц и больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, отсутствуют достоверные различия по степени выраженности способности к инактивации лизоцима и комплемента, тогда как выраженность способности микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, к инактивации антимикробного белка тромбоцитов достоверно выше.

Авторами при изучении клинических штаммов микроорганизмов установлены пороговые значения способности микроорганизмов к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, позволяющие отнести их к нормальной микрофлоре урогенитального тракта. Результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5 Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных из урогенитального тракта здоровых лиц (n=10)
Микроорганизмы	Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, % (абс./%)
	0-10			11-20		>20
Staphylococcus spp. (n=25)	23/92			2/8		0/0
Micrococcus spp. (n=10)	9/90			1/10		0/0
Streptococcus spp. (n=10)	9/90			1/10		0/0
Corynebacterium spp. (n=17)	17/100			0/0		0/0
Таблица 6 Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов у микроорганизмов, выделенных от больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (n=21)
микроорганизмы		Выраженность способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, %
		0-10	10-20		>20
Staphylococcus spp. (n=39)		20/51,3	2/5,1		17/43,6
Micrococcus spp. (n=5)		3/60	2/40		0/0
Streptococcus spp. (n=11)		8/72,7	3/27,3		0/0
Enterococcus spp. (n=15)		4/26,7	0/0		11/73,3
Enterobacteriaceae (n=9)		0/0	0/0		9/100
Corynebacterium spp. (n=11)		10/90,9	1/9,1		0/0

Как видно из таблиц 5 и 6, микроорганизмы, выделенные из урогенитального тракта здоровых лиц, не обладают способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов более 20%, тогда как микроорганизмы, выделенные от больных местными неспецифическими инфекционно-воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, гораздо чаще (от 43,6 до 100%) инактивируют антимикробный белок тромбоцитов более 20%.

Способ осуществляется следующим образом.

Стерильным уретральным зондом или ложкой Фолькмана осуществляют забор исследуемого материала (отделяемое уретры и/или секрет простаты). Семенную жидкость получают путем мастурбации.

Исследуемый материал методом секторных посевов [19] засевают на селективные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов.

Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводят общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств [20].

У выделенных культур микроорганизмов определяют способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов.

Способность микроорганизмов к инактивации антимикробного белка тромбоцитов выражают в % инактивации антимикробного белка тромбоцитов в опыте по сравнению с контролем.

При этом к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, либо обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. У больного В., 34 лет, с диагнозом "хронический неспецифический уретрит" уретральным зондом был осуществлен забор отделяемого уретры, которое было засеяно на селективные питательные среды (Columbia-agar, среда Эндо, желточно-солевой агар). Через 48 часов инкубации при 37°С были выделены в чистой культуре и по совокупности признаков идентифицированы как Staphylococcus epidermidis (показатель микробной обсемененности - 10⁴ КОЕ/мл) и Corynebacterium genitalium (показатель микробной обсемененности -10³ КОЕ/мл). Для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителя уретрита у выделенных микроорганизмов была изучена способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов. Штамм C.genitalium не обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов, что позволило отнести его к нормальной микрофлоре урогенитального тракта, а штамм S.epidermidis обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 25%, что позволило отнести его к возбудителю уретрита. Изучение спектра чувствительности к антибиотикам и проведение целенаправленной антибиотикотерапии привело к элиминации возбудителя и клиническому выздоровлению.

Пример 2. У больного М., 45 лет, с диагнозом "Хронический простатит. Бесплодие" из эякулята были выделены в чистой культуре микроорганизмы, которые по совокупности признаков идентифицированы как Esherichia coli, Staphylococcus hominis и Enterococcus faecalis. С целью дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителей простатита у выделенных микроорганизмов была определена способность к инактивации антимикробного белка тромбоцитов согласно примеру 1. Выявлено, что штамм E.coli обладал способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 50%, штамм S. hominis обладал указанной способностью 10% и штамм Е. faecalis - 35%. На основании полученных данных S. hominis был отнесен к представителю нормальной микрофлоры урогенитального тракта, a E.coli и E.faecalis - к возбудителям хронического простатита. Проведение курса направленной антибиотикотерапии привело к элиминации E.coli и E.faecalis и купированию воспалительного процесса в предстательной железе.

Таким образом, использование заявляемого способа позволяет повысить точность диагностики воспалительных заболеваний урогенитального тракта человека микробной этиологии и выбора рациональной антибиотикотерапии.

Источники информации

1. Wong E.S., Hooton T.M., Hill C.C. et al. Clinical and microbiological features of persistent or recurrent nongonococcal urethritis in men // J.Infect. Dis. - 1988. - Vol.158(5). - P.1098-1101.

2. Nickel J.C., Costerton J.W. Coagulase-negative staphylococcus in chronic prostatitis // J.Urol. - 1992. - Vol.147(2). - P.398-400; discussion P.400-401.

3. Шмидт У., Хартманн М., Пфютцнер X. Спектр возбудителей при негонококковых уретритах // Вести, дерматол. венерол. - 1988. - №10. - С.32-34.

4. Magnanelli S., Wilks М., Boake T. et al. Quantitative bacteriology of seminal fluid in health and disease // Microb. Ecol. Health. Dis. - 1990. - Vol.3. - No.3. - P.129-137.

5. Kumar В., Dawn G., Sharma М., Malla N. Urethral flora in adolescent boys // Genitourin. Med. - 1995. - Vol.71. - No.5. - P.328-329.

6. Dominigue G.J., Sr., Hellstrom W.J.G. Proctatitis // Clin. Microbiol. Rev. - 1998. - Vol.11. - No.4. - P.604-613.

7. Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков при бактерионосительстве // Персистенция микроорганизмов." Куйбышев, 1987. - С.22-30.

8. Патент РФ 2092562 C 12 Q 1/04. Опубл. 10.10.1997.

9. Иванов Ю.Б. Факторы персистенции микрофлоры репродуктивного тракта мужчин в норме и при патологии. Автореф. дисс... канд. мед. наук. - Оренбург, 1998. - С.7-11. (прототип).

10. Бухарин О.В., Иванов Ю.Б., Кузьмин М.Д., Михайленко С.В. Характеристика изменений микробиоценоза у больных хроническим неспецифическим уретритом // Журн. микробиол. - 2001. - №4. - С.86-89.

11. Черкасов С.В., Забирова Т.М., Сгибнев А.В., Черкасов И.В. Роль биологических свойств вагинальных лакбобацилл в процессах колонизации // Журн. микробиол. - 2003. - №4. - С.61-64.

12. Yeaman M.R. The role of platelets in antimicrobial host defense // din. Infect. Dis. - 1997. - Vol.25. - P.951-970.

13. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство. - Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - С.114-132.

14. Иванов Ю.Б., Кузьмин М.Д. Коррекция микроэкологических нарушений урогенитального тракта мужчин препаратами андрогенов // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2002. - №3. - С.151-154.

15. Yeaman M.R., Puentes S.M., Norman D.C., Bayer A.S. Partial characterization and staphylocidal activity of thrombin-induced microbicidal protein // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60. - P.1202-1209.

16. Брудастов Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук, - Челябинск, 1992. - 21 с.

17. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журн. микробиол. - 1984. - №2. - С.27-28.

18. Бухарин О.В., Сулейманов К.Г., Чернова О.Л. и др. Способность микроорганизмов к инактивации бактерицидного действия тромбоцитарного катионного белка (-лизина) // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1998. - Т.126. - №7. - С.66-67.

19. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г., Шапиро А.В., Кузьменко В.Д. Количественное определение микроорганизмов в клиническом материале // Лаб.дело. - 1984. - №10. - С.616-619.

20. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. // J.G.Holt ed, 9^th ed. Vol.1-2. - Baltimore, 1986.