способ получения толерантных к ионам меди однодольных растений in vitro

Формула изобретения

Способ получения толерантных к ионам меди растений in vitro, заключающийся в культивировании каллуса на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли до получения регенерирующих каллусов, регенерации на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли до получения растений и укоренения растений на среде Мурасиге-Скуга и растворе медной соли, отличающийся тем, что в качестве растений используют газонную траву полевицу, культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 1-3 мг/л и раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-200 мг/л до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде с раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-150 мг/л и укоренении растений на среде с раствором сернокислой меди в концентрации в пересчете на двухвалентную медь 100-150 мг/л.

Описание изобретения к патенту

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Действие тяжелых металлов (ТМ) на культивируемые клетки растений исследовано, главным образом, для кадмия.

В 80-х годах 20 века было проведено довольно много успешных работ по отбору клеток, толерантных к кадмию, однако получить устойчивые растения не удалось. Практически отсутствовали работы по однодольным растениям.

Были выделены клеточная линия дурмана, устойчивая к 250 мМ CdCl₂, (Jackson P.J., Roth E.J., McClure P.R., Naranjo C.M. Selection, isolation and characterization of cadmium-resistant Datura innoria suspension culture // Plant Phys., 1984, v.75, P.914-918) и табака, растущая при содержании в среде 100 мМ CdSO₄ (Domozlicka E., Opatny Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and the sebction of potentially Cd-resistant cell lines. // Biol. Plant., 31(1), 19-27, 1989).

При концентрации кадмия 15 мг/л были отобраны устойчивые клеточные линии льна-долгунца и получены растения-регенеранты (Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Изучение морфофнзиологичсских реакций генотипов льна-долгунца в различных условиях выращивания при воздействии соли кадмия // М., Сельскохозяйственная биотехнология, т.1, 2000, с.88-99).

Медь обладает наибольшей фитотоксичностью среди ТМ, поэтому работ по клеточной селекции на устойчивость к меди практически нет.

В большинстве случаев получить растения из линий, устойчивых к высоким концентрациям тяжелых металлов, не удавалось, отсутствуют работы по получению однодольных растений, толерантных к меди.

Известен способ получения клеточной линии табака устойчивой к высоким концентрациям меди, культивирование проводили при концентрации меди 100 мМ/л в течение 6 месяцев. Были получены растения, однако семян получено не было (Cori P., Schiff S. Response of in vitro Cultures of Nicotiana-Tabacum L to copper stress and selection of plants from Cu - tolerant callus // Plant cell tissue and organ culture - 1998, vol. 53, Iss 3, p. 161-169).

Недостатком данных методов являлось длительное культивирование, которое значительно уменьшало регенерационную способность клеток.

Раскрытие изобретения

По мнению авторов сущность нашего метода заключается в относительно коротком периоде культивирования, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток, и с использованием меди на каждом этапе культивирования, благодаря чему устойчивость сохраняется на уровне целых растений.

Устойчивость растений к тяжелым металлам обеспечивается молекулярными и физиологическими механизмами, которые могут быть специфичными как для одного вида растений, так и для целой таксономической группы. Вероятно ведущую роль в устойчивости растений играет ряд соединений, которые участвуют в детоксикации ионов ТМ, поступивших в клетки, и выведении их из цитоплазмы. К таким веществам относятся органические кислоты, а также белки фитохелатины, ферритины и металлотиониены.

Задачей нашего метода было исключить вышеизложенные недостатки других методов и получить устойчивые растения газонных трав, которые относятся к однодольным растениям.

Данная задача была решена созданием нового способа толерантных ионам меди однодольных растений in vitro, отличающегося тем, что культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 100-200 мг/л меди до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди.

Добавление CuSO₄·5H₂O в питательную среду ингибировало рост каллуса (табл.1).

Пример 1. Одна и та же степень подавления роста отмечена у овсяницы при дозе Cu 100 мг/л, а у полевицы при дозе 150 мг/л.

При содержании меди 100-200 мг/л значительная часть каллусных тканей овсяницы и полевицы погибала в течение 1-2 недель, однако рост выживших каллусов был сопоставим с контролем.

При концентрации 300 мг/л и выше каллус газонных трав приобретал голубую окраску, вероятно вследствие интенсивного накопления меди в клетках, выжившие каллусные инокулюмы теряли способность к регенерации растений.

Каллус культивировали в течение 2-3 пассажей, увеличение числа пассажей приводило к полной потере регенерационой способности клеток.

Пример 2. При концентрации меди 100-150 мг/л были получены каллусы, способные к регенерации (табл.1, графа процент образования эмбриогенного каллуса). При концентрации меди выше 200 мг/л лишь единичные каллусы были способны к регенерации. Регенерацию и укоренение растений проводили на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/л меди.

Таблица 1. Влияние меди на рост и способность к морфогенезу каллуса газонных трав.
Вид	Концентрация меди, мг/л	% прироста по отношению к контролю	% образования эмбриогснного каллуса по отношению к контролю
Полевица	100	61,5	33,3
	150	36,9	20,5
	200	20	6,4
	300	3,8	2,5
	450	0	0
Доверительный интервал различий (%)	-	4,0	4,4
Овсяница	100	34,2	21
	150	28,5	18
	200	10,7	5
	300	2,1	2,5
	450	0	2,5
Доверительный интервал различий (%)	-	4,5	6,5

Таблица 2. Отбор толерантных к ионам меди растений овсяницы и полевицы.
Общее число каллусов		Число устойчивых клонов		Число регенерантов In vitro
полев.	овеян.	полев.	овеян.	полев.	овеян.
700	250	256	62	80	10

Всего в селективных условиях было получено 80 регенерантов полевицы и 10 регенерантов овсяницы (табл.2). Жизнеспособность последних была крайне низкой, семян получить не удалось. Большинство регенерантов полевицы имели нормальную морфологию и хороший рост. Пять регенерантов зацвели и дали семена.

Для проверки устойчивости к высоким концентрациям меди регенеранты полевицы были высажены в почву со 150 мг/л Cu. Около 80% растений, полученных из устойчивых к меди клеток, росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.

Технический результат

Результаты проверки на устойчивость к солям меди показывают, что неожиданно было получено, что 80% полученных растений полевицы обладали высокой устойчивостью к солям меди и эта устойчивость закреплялась в следующих поколениях. Кроме того, всхожесть семян регенеранта полевицы, при концентрации меди - 150 мг/л, была в 3 раза выше, чем у растений, неотселектированных в соответствии с заявляемым способом, а также соли меди не угнетали рост этих растений и не вызывали хлороза.