потенциирование цитотоксичности, обусловленной анти-cd38- иммунотоксином

Формула изобретения

1. Способ лечения больного патофизиологическим состоянием, выбранным из группы, состоящей из миелом и резистентного к лекарственным средствам лейкоза, предусматривающий следующие стадии:

а) введение указанному больному фармакологически эффективной дозы ретиноида, который повышает экспрессию антигена CD38, и

б) введение указанному больному фармакологически эффективной дозы иммунотоксина, действующего против усиленно экспрессирующегося антигена CD38.

2. Способ по п.1, где указанный резистентный к лекарственным средствам лейкоз представляет собой резистентный к адриамицину лейкоз.

3. Способ по п.1, где указанный ретиноид выбран из группы, состоящей из all-транс-ретиноевой кислоты (РК); 9-цисретиноевой кислоты (9-цис РК); (Е)-4-[2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]бензойной кислоты (ТТНПБ); (Е)-4-[2-(5,6,7,8-тетрагидро-3,5,5,8,8-пентаметил-2-нафталенил)-1-пропенил]бензойной кислоты (3-met ТТНПБ).

4. Способ по п.1, где указанный иммунотоксин представляет собой моноклональное антитело против антигена CD38, конъюгированного с молекулой токсина.

5. Способ по п.4, где указанный токсин является гелонином.

6. Способ по п.4, где моноклональное антитело выбрано из группы, состоящей из IB4 или IB6.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится главным образом к области иммунологии и биологии опухолей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к обработке приводящей к усилению экспрессии белка CD38 в опухолевой клетке-мишени, с целью повышения цитотоксичности основанных на анти-СD38-иммунотоксинов.

Описание уровня техники

Использование моноклональных антител для разработки лекарств или токсинов с целью распознавания молекулярных структур, экспрессированных на поверхности нежелательных опухолевых клеток, представляет собой привлекательную и потенциально применимую стратегию. Теоретически подобный целенаправленный подход к терапии злокачественных опухолей может обеспечить большое преимущество для селективной элиминации опухолевых клеток наряду с уменьшением токсичности воздействия по отношению к нормальным тканям, не являющимся мишенями. Тем не менее в практике существует множество проблем, которые необходимо решить для того, чтобы терапия с использованием иммунотоксинов или лекарств на основе антител могла быть действительно эффективной in vivo.

Одним из потенциальных ограничений на пути к успеху любого целенаправленного подхода к терапии является гетерогенность экспрессии антигенов-мишеней в популяции опухолевых клеток. Из этого следует, что в том случае, если небольшое количество клеток опухоли было негативно по отношению к антигену-мишени или экспрессируют антиген очень слабо, данные клетки возможно смогут избежать разрушения из-за нарушения опосредованного антителом образования цитотоксического агента в данных особенных клетках. Возможным способом преодоления этой проблемы может являться идентификация агентов, которые индуцируют высокий уровень содержания поверхностных клеточных молекул-мишеней в расчете на то, что опухолевые клетки-мишени, которые ранее были негативны по отношению к антигену, смогут экспрессировать эти молекулы-мишени в избытке.

All-транс-ретиноевая кислота (РК) является агентом, который индуцирует высокий уровень экспрессии поверхностного клеточного антигена CD38 в некоторых миелоидных и лимфоидных лейкозных клетках. Экспрессия CD38, индуцированная ретиноевой кислотой, в этих клетках является специфичной, быстрой, зависящей от дозы и высоко чувствительной, с 4-кратной индукцией при такой малой дозе ретиноевой кислоты, как 10^-13 М. Было показано, что индукция экспрессии CD38 ретиноевыми кислотами вовлекает RAR-рецептор к ретиноидам. RAR-рецепторы образуют гетеродимеры с RXR-рецепторами; затем RXR/RAR-гетеродимер взаимодействует с последовательностями ДНК, известными как элементы ответа на ретиноевые кислоты (RARE), которые вовлекаются в транскрипцию, индуцированную ретиноидами.

CD38 является поверхностным клеточным белком массой 45 кДа, который экспрессируется главным образом активированными клетками-предшественниками и зрелыми клетками системы кроветворения. Он является трансмембранным гликопротеином с коротким N-концевым цитоплазматическим доменом и длинным С-концевым внеклеточным доменом. Было показано, что внеклеточный домен является бифункциональным ферментом, обладающим как АДФ-рибозилциклазной, так и АДФ-рибозилгидролазной активностью, тем самым катализируя превращение НАД⁺ в цАДФ-рибозу (циклаза) и может в дальнейшем гидролизовать ее до АДФ-рибозы (гидролаза). цАДФ-рибоза вовлечена в мобилизацию кальция из внутриклеточных запасов, который обладает активностью вторичного мессенджера, важного для клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Считается, что CD38 действует в качестве рецептора для неидентифицированного лиганда и действует в качестве клеточной адгезионной молекулы путем взаимодействия с CD31. В экспериментах, в которых функция CD38 активировалась выработанными против него антителами, было показано, что CD38 вовлечен как в пролиферацию зрелых В-лимфоцитов и клеток миелолейкоза, защиту клеток зародышевого центра от апоптоза и супрессию роста поддерживающих строму культур предшественников В-клеток, так и в индукцию цитокинов IL-6, IGN-g, GM-CSF и IL-10. В дополнение было показано, что он сигнализирует о повышении содержания TNF-, IL-1, IL-6 и транскрипции IL-8 в клетках миелолейкоза.

В предшествующем уровне техники отсутствует способ индукции экспрессии молекулы-мишени для иммунотерапии опухолей и других обуславливающих заболевание клеток. Настоящее изобретение восполняет эту давнишнюю потребность в данной области техники.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение показывает возможность индуцированной ретиноидами экспрессии CD38, служащего в качестве мишени для действия анти-СD38-гелонина. Полученные результаты подтверждают тот факт, что обработка лейкозных клеток ретиноевой кислотой даже в очень низких концентрациях (субнаномолярных) делает данные клетки чрезвычайно чувствительными к индуцированной иммунотоксином гибели.

Настоящее изобретение относится к способу лечения субъектов с наличием патофизиологического состояния, включающему в себя стадию введения указанному субъекту фармакологически эффективной дозы агента, который повышает экспрессию клеточной мишени, а также введения фармакологически эффективной дозы иммунотоксина, действующего против клеточной мишени.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения субъектов с наличием патофизиологического состояния, устойчивого к воздействию ретиноидов, включающему в себя стадию введения указанному субъекту фармакологически эффективной дозы метаболита ретиноевой кислоты и фармакологически эффективной дозы иммунотоксина.

Другие и следующие аспекты, характерные черты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными при последующем описании предпочтительных в настоящее время воплощений изобретения. Эти воплощения даны с целью раскрытия сущности настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Для того чтобы объект, в котором станут очевидны указанные выше признаки, преимущества и цели настоящего изобретения, был осуществлен и мог быть досконально понят, более подробное описание настоящего изобретения, вкратце освещенного выше, может быть дано на примере конкретных его воплощений, которые проиллюстрированы на приложенных фигурах. Данные фигуры образуют часть описания изобретения. Тем не менее необходимо отметить, приложенные фигуры лишь иллюстрируют предпочтительные воплощения изобретения, а потому не должны истолковываться как ограничивающие объем притязаний.

На фигуре 1 показан дот-блот мРНК, полученной из различных тканей человека, после гибридизации с помеченной радиоактивным изотопом пробы СD38-специфичной нуклеиновой кислоты человека. Относительно низкая экспрессия CD38 мРНК наблюдалась только в тканях тимуса [как взрослого (Е5), так и фетального (G6)], в то время как наименьший уровень экспрессии наблюдался в нормальной простате (С7).

На фигуре 2 показаны эффекты 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК) на цитотоксичность иммунотоксина и эффекты повышения добавляемой концентрации неконъюгированного анти-СD38 моноклонального антитела (IB4). Точка С показывает эффект одного иммунотоксина. Точка РК+ИТ показывает эффект 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК) на цитотоксичность иммунотоксина. В остальных образцах по отдельности добавлялись повышающиеся концентрации IB4 с иммунотоксином и 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК). После 3 суток инкубации выживаемость клеток определялась с помощью MTS анализа. Результаты представлены исходя из % выживших клеток.

На фигуре 3 показан эффект предварительной обработки ретиноевой кислотой на цитотоксичность анти-СD38 иммунотоксина на клетки линии HL-60. Клетки линии HL-60 инкубировали в течение ночи в присутствии или в отсутствие ретиноевой кислоты. После удаления среды и двукратного отмыва клеток клетки повторно инкубировали с повышающимися концентрациями иммунотоксина (представленными как нг на лунку) в присутствии или в отсутствие 100-кратного избытка неконъюгированного анти-СD38 моноклонального антитела IB4. Спустя трое суток для определения выживаемости клеток, результаты которой представлены исходя из % выживших клеток, использовали MTS-анализ.

На фигуре 4 показан эффект обработки или иммунотоксином, или гелонином на выживаемость клеток линии HL-60. Клетки линии HL-60 инкубировали в течение трех суток с повышающимися концентрациями иммунотоксина или гелонина (представленными как нг токсина на лунку) в присутствии или в отсутствие 5 нМ ретиноевой кислоты. Выживаемость клеток определяли с помощью MTS-анализа, результаты которого представлены здесь исходя из процента выживших клеток по отношению к контрольному образцу (без токсина).

На фигуре 5 показан эффект повышающихся концентраций all-транс-ретиноевой кислоты (РК) (в нМ) на выживание клеток. Клетки линии HL-60 инкубировали или с иммунотоксином или с неконъюгированным анти-СD38 моноклональным антителом в отсутствие или в присутствии повышающейся концентрации ретиноевой кислоты (показана в нМ). Спустя трое суток с помощью MTS-анализа определяли выживаемость клеток, результаты которой показаны исходя из процента выживания клеток по отношению к необработанному контрольному образцу.

На фигуре 6А и 6В показан эффект повышающихся концентраций иммунотоксина (показанного в нг на лунку) в присутствии или в отсутствие 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК) на выживание клеток различных клеточных линий, включая линии Daudi, THP-1, K562 (которые резистентны к индуцированной РК экспрессии CD38) и RAR-экспрессирующий вариант линии HL60. Выживаемость клеток определяли с помощью MTS анализа спустя трое суток и ее результаты представляли исходя из процента выживания клеток по отношению к необработанному контрольному образцу.

На фигуре 7 показана индуцированная иммунотоксином гибель Doxo-резистентных клеток линии HL-60, которые являются резистентными к индуцированной адриамицином гибели. Клетки инкубировали с повышающимися концентрациями иммунотоксина (показанного в нг на лунку) в присутствии или в отсутствие 5 нМ РК. Выживаемость клеток анализировали спустя трое суток с помощью MTS-анализа.

На фигуре 8 показана опосредованная иммунотоксином гибель клеток линии неходжкинской лимфомы MZ(NHL), которые обладают высокой начальной экспрессией СD38-антигена. Клетки инкубировали повышающимися концентрациями иммунотоксина (показанного в нг на лунку) в присутствии или в отсутствие 5 нМ ретиноевой кислоты. Спустя трое суток выживаемость клеток анализировали с помощью MTS-анализа, результаты которого представляли исходя из процента выживших клеток.

На фигуре 9 показана опосредованная иммунотоксином гибель резистентного к действию ретиноевой кислоты варианта линии клеток HL60 (HL60R). Данные клетки являются резистентными к индуцированной ретиноевой кислотой экспрессии CD38 антигена из-за точечной мутации гена альфа-рецептора ретиноевой кислоты (RAR). Клеточную линию культивировали с повышающимися концентрациями иммунотоксина (в нг/мл) при различных условиях. Спустя трое суток выживаемость клеток анализировали с помощью MTS анализа, результаты которого представляли, выражая их в оптической плотности. Присутствие ретиноевой кислоты не стимулировало индуцированную иммунотоксином гибель данных клеток из-за их неспособности экспрессировать СD38-антиген в ответ на обработку ретиноевой кислотой.

Подробное описание изобретения

Иммунотоксин определяется как любая иммунологическая молекула, такая как антитело, которая была конъюгирована с токсином, предпочтительно цитотоксином.

Настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта с наличием патофизиологического состояния, включающему в себя стадию введения указанному субъекту фармакологически эффективной дозы агента, который повышает экспрессию клеточной мишени. За этим введением следует введение фармакологически эффективной дозы иммунотоксина, действующего против клеточной мишени. Предпочтительно вводимый агент выбирают из группы, состоящей из факторов дифференцировки, цитокинов, интерлейкина-2, фактора некроза опухолей, интерферона-, интерферона- и пептидных гормонов.

В одном воплощении изобретение представляет собой введение фармакологически эффективной дозы ретиноида. Предпочтительно, ретиноид вызывает экспрессию CD38 антигена в клетках. Если это так, вводится фармакологически эффективная доза анти-СD38 иммунотоксина. Характерными патофизиологическими состояниями, которые могут лечиться с помощью методов данного воплощения изобретения, включают RAR-селективный острый миелолейкоз, острый промиелолейкоз, лимфомы и миеломы.

Характерные метаболиты ретиноевой кислоты, которые могут быть использованы в методиках настоящего изобретения, включают all-транс-ретиноевую кислоту (РК); 9-цис ретиноевую кислоту (9-цис РК); (Е)-4-[2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]бензойная кислота (ТТНПБ); (Е)-4-[2-(5,6,7,8-тетрагидро-3,5,5,8,8-пентаметил-2-нафталенил)-1-пропенил]бензойная кислота (3-met ТТНПБ); и другие ретиноиды, которые могут связываться и активировать RAR-рецептор. Предпочтительно, ретиноид вводится в дозе от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг.

Иммунотоксин, используемый в методиках настоящего изобретения, специфически целенаправленно действует на клетки, экспрессирующие СD38-антиген. Предпочтительно, иммунотоксин представляет собой моноклональное антитело, действующее против СD38-антигена, конъюгированного с молекулой токсина. Хотя специалист в данной области техники может использовать любой токсин, предпочтительным токсином, используемым в данных методиках, является гелонин. Хотя специалист в данной области техники может использовать любое моноклональное антитело, специфичное к СD38-антигену, для демонстрации настоящих методик здесь были использованы антитела IB4 или IB6. Предпочтительно, иммунотоксин вводился в дозе от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг.

Последующие примеры предоставлены с целью иллюстрации различных воплощений изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Пример 1

Экспрессия CD38 в нормальных тканях ограничена главным образом тимусом.

Тканевая специфичность CD38 была исследована с помощью меченного радиоактивной меткой зонда нуклеиновой кислоты CD38 против коммерческого тканевого специфического дот-блота мРНК (CLONTECH). Результаты гибридизации представлены на фигуре 1.

Было показано, что CD38 экспрессируется главным образом в тимусе со значительно меньшим уровнем экспрессии в простате.

Пример 2

Ретиноевая кислота (РК) усиливает цитотоксический эффект иммунотоксина путем усиления экспрессии CD38.

Клетки линии HL-60 инкубировали или только с иммунотоксином или в присутствии 5 нМ ретиноевой кислоты (РК). К клеткам, инкубируемым с иммунотоксином и ретиноевой кислотой, добавляли повышающиеся концентрации неконъюгированного моноклонального антитела IB4. Спустя трое суток клетки анализировали на выживаемость с помощью MTS анализа. Кратко, 6,5 мг/мл раствора MTS [(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия] и 0,5 мМ раствора PMS (метосульфата феназина) смешивали в соотношении 20:1. 20 мкл комбинированного раствора MTS/PMS помещали в каждую лунку 96-луночной плашки, содержащей образцы тестируемых клеток. Плашку инкубировали в течение 1-4 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂, после чего количество формазана, произведенного живыми клетками путем клеточного восстановления MTS, измеряли по величине поглощения при 490 нм. Результаты представлены на фигуре 2.

Отдельно иммунотоксин обладал незначительным эффектом на выживаемость клеток (точка С). Однако при инкубации клеток с иммунотоксином в присутствии 5 нМ ретиноевой кислоты наблюдалось значительное снижение выживаемости клеток. Повышающиеся концентрации неконъюгированного моноклонального антитела IB4 блокировали цитотоксический эффект иммунотоксина и ретиноевой кислоты. Тот факт, что неконъюгированные моноклональные антитела IB4 блокировали способность иммунотоксина убивать клетки, показывает, что иммунотоксин специфически взаимодействует с поверхностным маркером CD38 и что эффект ретиноевой кислоты заключается в повышении экспрессии СD38-антигена.

Пример 3

Предварительная обработка all-транс-ретиноевой кислотой (РК) усиливает индуцированную гибель клеток линии HL-60.

Клетки линии HL-60 предварительно инкубировали в течение ночи в присутствии или в отсутствие 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты. Клетки дважды отмыли и инкубировали с повышающимися концентрациями иммунотоксина в присутствии или в отсутствие неконъюгированного анти-СD38 моноклонального антитела IB4. Спустя трое суток клетки анализировали на выживаемость. Результаты представлены на фигуре 3.

После преинкубации с all-транс-ретиноевой кислотой следовала обработка иммунотоксином, которая приводила к гибели большего по сравнению с действием просто иммунотоксина клеток. Присутствие 100-кратного избытка неконъюгированного моноклонального антитела анти-СD38 IB4 блокировало иммунотоксичность иммунотоксина в обоих случаях путем конкуренции с иммунотоксином за связывание с маркером CD38 на клетках. Данные результаты показывают, что all-транс-ретиноевая кислота (РК) обуславливала некоторые изменения в клетках, которые скорее приводили их в более восприимчивое к действию иммунотоксина состояние, чем играли прямую роль в гибели клеток-мишеней.

Пример 4

Для достижения токсического эффекта в отношении клеток-мишеней гелонин должен быть конъюгирован с анти-СD38-антителами.

Клетки линии HL-60 инкубировали в течение 3 суток с повышающимися концентрациями или иммунотоксина или гелонина в присутствии или в отсутствие 5 нМ ретиноевой кислоты. Затем клетки анализировали на выживаемость с помощью MTS-анализа. Как видно на фигуре 4, отдельно гелонин не имел токсического эффекта или в присутствии или в отсутствие 5 нм ретиноевой кислоты. Поэтому токсический эффект гелонина зависит от того, конъюгирован ли он с анти-СD38 моноклональным антителом с целью доставки токсина к клетке.

Пример 5

Даже незначительные количества all-транс-ретиноевой кислоты (РК) приводят к повышенной токсичности иммунотоксина.

Клетки линии HL-60 инкубировали или с иммунотоксином или с неконъюгированным моноклональным антителом IB4 в присутствии повышающихся концентраций моноклонального антитела. На фигуре 5 показано, что даже самые малые количества all-транс-ретиноевой кислоты (РК) (1 нМ) приводили к практически полной гибели клеток-мишеней при действии иммунотоксина. Этот эффект не наблюдался с неконъюгированным моноклональным антителом. Этот результат показывает, что скорее именно гелонин, конъюгированный с моноклональным антителом в иммунотоксине, приводит к повышению уровня гибели клеток, чем какой-либо эффект самого антитела.

Пример 6

Ретиноевая кислота может индуцировать экспрессию маркера CD38 у некоторых клеточных линий.

Клетки линии Daudi, THP-1, K562 и HL60-RAR обрабатывали повышающимися концентрациями иммунотоксина в присутствии или в отсутствие 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК). Спустя трое суток выживаемость клеток исследовали с помощью MTS-анализа, результаты которого представлены на фигуре 6. В линиях клеток THP-1 и HL60-RAR, all-транс-ретиноевая кислота индуцировала гибель клеток, в то время как на клетки, которые выращивали в отсутствие all-транс-ретиноевой кислоты, иммунотоксин практически не подействовал. У линии клеток Daudi, которая характеризуется наличием высокого начального уровня экспрессии CD38, действие иммунотоксина привело к практически полной гибели клеток вне зависимости от присутствия ретиноевой кислоты. С другой стороны, на линию клеток K562, которая является резистентной к индуцированной ретиноевой кислотой экспрессии CD38, иммунотоксин не подействовал вне зависимости от присутствия ретиноевой кислоты.

Пример 7

Иммунотоксин индуцирует гибель клеток линии HL-60, резистентной к адриамицину.

Клон линии клеток HL-60, резистентный к индуцированной адриамицином гибели, выращивали либо с отдельно иммунотоксином, либо в присутствии 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты. Спустя трое суток для оценки выживаемости клеток использовали MTS-анализ. На фигуре 7 представлены полученные результаты. Гибель некоторого количества клеток наблюдалась в присутствии только иммунотоксина и значительно возрастала при добавлении 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты.

Пример 8

Клетки, обладающие высокой начальной экспрессией CD38, погибают при действии иммунотоксина вне зависимости от присутствия или отсутствия all-транс-ретиноевой кислоты (РК).

MZ, линию клеток неходжкинской лимфомы, обладающую высокой начальной экспрессией CD38, обрабатывали повышающимися концентрациями иммунотоксина в присутствии или в отсутствие 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты. Добавление иммунотоксина приводило к высокому уровню гибели клеток вне зависимости от присутствия или отсутствия ретиноевой кислоты (фигура 8). Существует основание полагать, что ретиноевая кислота усиливает токсичность иммунотоксина путем увеличения содержания CD38 на других линиях клеток, которые не обладают высоким уровнем экспрессии CD38.

Пример 9

Ретиноиды усиливают экспрессию CD38 у некоторых линий лимфоидных опухолевых клеток.

В таблице 1 перечислены потенциальные мишени для воздействия связанного с анти-CD38 токсина. Некоторые различные линии лимфоидных опухолевых клеток обрабатывали 5 нМ all-транс-ретиноевой кислоты (РК). После этого экспрессию CD38 у необработанных клеток по сравнению с обработанными клетками измеряли при помощи проточной цитометрии. Значительный рост экспрессии CD38 наблюдался в клетках при остром миелолейкозе (ОМЛ), остром промиелолейкозе (ОПМЛ), лимфомах и миеломах. Рост экспрессии CD38 варьировал от 2,5 до 20 раз. Поэтому ретиноевая кислота может быть использована для всех данных типов опухолей для повышения уязвимости опухолевых клеток к действию иммунотоксина.

Пример 10

Иммунотоксин не действует на клетки, резистентные к действию all-транс-ретиноевой кислоты (РК).

Клетки линии HL-60 с мутировавшим геном RAR, что делает клетки устойчивыми к действию ретиноевой кислоты, обрабатывали иммунотоксином в присутствии или в отсутствие 5 нМ ретиноевой кислоты. У данных клеток добавление ретиноевой кислоты не влияло на токсичность иммунотоксина. Как показано на фигуре 9, не наблюдалось заметной гибели клеток, обработанных all-транс-ретиноевой кислотой (РК) с неконъюгированным IB4 и гелонином или только с гелонином. Это является доказательством того, что иммунотоксин убивает клетки, на которые воздействует ретиноевая кислота, так как ретиноевая кислота индуцирует экспрессию CD38 - мишени для иммунотоксина.

Любые патенты или публикации, упомянутые в данном описании изобретения, свидетельствуют об уровне специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Данные патенты или публикации включены сюда в качестве ссылки в той же самой мере, как если бы каждая отдельная публикация была особо и индивидуально отмечена для включения путем ссылки.

Специалисты в данной области легко поймут, что настоящее изобретение хорошо применимо для осуществления и достижения упомянутых результатов и преимуществ, равно как и сопутствующих. Данные примеры наряду с описанными здесь методами, процедурами, обработками, молекулами и специфическими соединениями являются в настоящее время характерными для предпочтительных воплощений, являются иллюстративными и не призваны ограничить объем притязаний. Специалисты в данной области могут изменить или найти другие применения, которые охвачены областью изобретения, как определено объемом притязаний.