способ получения иммуноглобулинового препарата

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата, включающий экстракцию спиртового осадка Б (111 фракции Кона) дистиллированной водой, очистку экстракта от липопротеидов с помощью хлороформа и хлорида натрия до конечной концентрации 0,9%, центрифугирование, осаждение иммуноглобулинов спиртами, повторное центрифугирование, добавление к осадку стабилизатора, проведение осветляющей и стерилизующей фильтрации целевого продукта и его лиофильное высушивание, отличающийся тем, что экстракцию спиртового осадка Б проводят в двенадцатикратном объеме воды, после добавления хлорида натрия до конечной концентрации 0,9% устанавливают рН от 4,0 до 5,0, затем добавляют хлороформ до 3,0%, выдерживают смесь в течение 14 ч при 0-3°С, после центрифугирования осадок удаляют, проводят осветляющую фильтрацию, для осаждения иммуноглобулинов к фильтрату добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12 или 26% этилового спирта, осадок после центрифугирования растворяют в 0,3 М глицине, доводят до рН 4,6, а после осветляющей и стерилизующей фильтрации осуществляют вирусинактивацию при комнатной температуре в течение 20-25 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству иммуноглобулиновых препаратов, и может быть использовано в медицине для лечения и профилактики тяжелых инфекционных заболеваний и иммунодифицитных состояний.

В настоящее время во многих странах мира для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, сепсиса, иммунодефицитных состояний широко используют иммуноглобулиновые препараты, содержащие комплекс иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM.

Первый отечественный комплексный иммуноглобулиновый препарат для орального применения (КИП) был разработан в конце 70-х годов [1]. Способ предусматривает экстракцию балластного осадка Б (III фракции Кона), обработку экстракта хлороформом и декстрансульфатом с целью удаления липидов, осаждение фракции полиэтиленгликолем. Конечный продукт содержал иммуноглобулины IgG, IgA, IgM, однако чистота препарата, его специфическая активность и выход были недостаточно высокими. Последующие усовершенствования технологии приготовления КИП были направлены на повышение его специфической активности, выхода и чистоты, и в основном касались способов удаления липопротеинов. Однако до настоящего времени общим недостатком всех известных аналогов является использование в высоких концентрациях хлороформа, плохая растворимость, и, как следствие, низкий выход препарата.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных заболеваний [2]. Способ осуществляют путем экстракции спиртового осадка Б в десятикратном объеме дистиллированной воды, а для удаления фракции липопротеинов наряду с хлороформом используют хлорид натрия в конечной концентрации 0,9% по объему. Осаждение из экстракта иммуноглобулиновой фракции проводят в присутствии 12% полиэтиленгликоля. Осадок иммуноглобулинов отделяют путем декантации и центрифугирования, промывают дистиллированной водой, растворяют в 0,9% растворе хлорида натрия до содержания белка 5-8%, рН 7,2. После растворения осадка препарат центрифугируют для удаления нерастворимых примесей, добавляют глюкозу в качестве стабилизатора. Конечный препарат содержит IgG 50%, IgA 25%, IgM 25%. Содержание иммунологически неактивных фракций, определяемых методом бумажного электрофореза, составляет 0-1,0%. Однако эти данные получены при лабораторном способе получения КИП. 15-летний опыт промышленного производства КИП по указанному методу, показал, что содержание белковых примесей в конечном продукте составляет 8,0±1,5% от общего содержания белка. Недостатками способа являются также трудоемкая технология удаления липопротеинов, использование хлороформа в неоправданно высоких концентрациях (10-12%), представляющего опасность для здоровья работающего персонала. Известное техническое решение не позволяет полностью удалить липопротеины, другие балластные белковые фракции и тем самым ухудшает растворимость, стабильность, снижает титры антител и уменьшает выход получаемого продукта.

Настоящим изобретением поставлена задача по повышению иммунофоретической чистоты и выхода комплексного иммуноглобулинового препарата, достижению его высокой растворимости, стабильности и сохранности антител всех классов при упрощении технологии получения.

Для решения поставленной задачи осуществляют экстракцию спиртового осадка Б (III фракция Кона) двенадцатикратным объемом дистиллированной воды, к экстракту добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,9%, устанавливают рН от 4,0 до 5,0, затем добавляют хлороформ до 3,0%, выдерживают смесь в течение 14 часов при 0-3°С, центрифугируют, осадок удаляют, проводят осветляющую фильтрацию, к фильтрату добавляют 50% раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12% или 26% этилового спирта, осадок иммуноглобулинов отделяют центрифугированием, растворяют его в 0,3 М глицине, доводят до рН 4,6, а после осветляющей и стерилизующей фильтрации осуществляют вирусинактивацию при комнатной температуре в течение 20-25 дней и проводят лиофильную сушку.

Подбор условий выделения и стабилизации препарата позволила разработать технологическую схему получения концентрата иммуноглобулинов G, А, М с повышенным содержанием антибактериальных и противовирусных антител, пригодного для перорального применения.

Концентраты иммуноглобулинов после растворения пасты в водно-солевых растворах при нейтральном рН, в том числе с добавлением углеводов и аминокислот, оказались нестабильными при хранении. Уже через несколько дней после растворения в препаратах образовывался осадок. Для повышения стабильности вместо глюкозы был использован 0,3 М глицин. При этом рН растворителя корректировали до слабокислых значений 4,0-5,0. Эти условия позволили ввести в технологический процесс дополнительную стадию вирусной инактивации в течение 20-25 дней. В известных решениях осадок Б растворяют в 0,9% растворе хлорида натрия. При этом растворяются все белки, а затем добавляя к суспензии 10% хлороформа по объему, экстрагируют липопротеиды при рН 6,5-7,5 с последующим центрифугированием для их удаления. В предложенном способе растворение осадка Б производится не физиологическим солевым раствором, а в двенадцатикратном объеме дистиллированной воды, т.е. растворителем очень малой ионной силы, который не растворяет балластные белки, включая липопротеиды. Принципиальным отличием от прототипа является проведение технологического процесса не в нейтральной (рН 7,0-7,5), а в кислой среде (рН 4,0-5,0). Это зона минимальной растворимости балластных белков, т.к. соответствует их изоэлектрическим точкам и она далека от изоэлектрической точки Ig А и Ig M, что уменьшает их потери и повышает конечный выход. Этим же обусловлена высокая стабильность при хранении белкового раствора в течение 20-25 суток для проведения вирусинактивации при комнатной температуре.

Технология получения комплексного иммуноглобулинового препарата согласно изобретению предусматривает экстракцию осадка Б в двенадцатикратном объеме в дистиллированной воде при рН 7,0-7,5 с последующим добавлением натрия хлорида до 0,9%. Далее смесь корригировалась с помощью 0,1 N соляной кислотой до рН 4,0-5,0 и добавлялся хлороформ до 3,0%. Смесь перемешивали, выдерживали в течение 14 часов при температуре 0-3°С и центрифугировали. Затем проводили фильтрацию для удаления следов липидов, агрегированных белков и добавлялся 50% раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12%. Осадок иммуноглобулинов отделялся центрифугированием. При этом достигают полное удаление липопротеинов и увеличение выхода продукта 15-20%. Выход препарата в дозах составляет 185-190 доз из одного кг. исходного сырья, в то время как методика прототипа позволяет получить не более 100 доз из того же количества исходного сырья

Пример:

Способ осуществляют следующим образом.

К 1 кг осадка Б (III фракция Кона) при комнатной температуре и постоянном перемешивании добавляют 12 л дистиллированной воды. После растворения осадка к экстракту добавляют натрия хлорида до 0,9%. Объем экстракта 13 л, рН суспензии 7,0-7,5.

К экстракту осадка Б при постоянном перемешивание тонкой струей добавляют 1 N соляную кислоту до установления рН 4,6 и добавляют до 3,0% хлороформа.

Смесь перемешивают и выдерживают 14 часов при температуре 0-3° и центрифугируют. Осадок удаляют и проводят осветляющую фильтрацию через глубинные фильтры.

Объем фильтрата 10,5-11,5 л

Белок 1,0±0,2%

К 10,5-11,5 л фильтрата для осаждения фракции иммуноглобулинов при постоянном перемешивании добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12% или 26% этилового спирта.

Осадок иммуноглобулинов отделяют центрифугированием.

Объем полученного осадка составляет 130±5 г

Осадок: растворение в 0,3 М глицина; рН 4,6 осветляющая и стерилизующая фильтрация; вирусинактивация в течение 20-25 дней при комнатной температуре; лиофилизация.

Для осветляющей фильтрации центрифугата использовали преимущественно глубинные целлюлозные фильтры, например "Cuno-60", а для стерилизующей фильтрации - как правило, глубинные целлюлозные фильтры, например "Cuno-90".

Таблица 1

Характеристика препаратов КИП рН 7,0-7,5 и рН 4,0-5,0 (п=36, р <0,05)
Показатель	Единица измерения	Содержание		Норма
		известный	предлагаемый
1	2	3	4	5
рН	-	7,0-7.5	4,0-5,0
Стабилизатор	моль	глюкоза 0,2 М	глицин 0,3 М	-
Содержание классов иммуноглобулинов:
IgG	%	61.38	68.15	50-70
IgM		19.22	16.18	15-25
IgA		19.40	15.67	15-25
Белковые примеси	%	8.0±1.5	1.8±0.4	не более 3,0
Содержание антител:
к Shigella flexner	титры	1:80	1:320-1:640	не менее 1:320
к Salmonella	антител	1: 320	1:640	не менее 1:320
Цветность	ОП	0.03±0,02	0.02±0.01	не более 0,15
Прозрачность	ОП	0.15±0.03	0.005±0.002	не более 0,05
Фракционный состав	Дуги преципитации	7-9	3-4	не более 5 дуг преципитации
Растворимость	время в мин	8-27	0.5-2	не более 5 мин

Таким образом, предложен способ существенно совершенствующий технологию получения комплексного иммуноглобулинового препарата.

Способ позволяет повысить экологическую безопасность производственного процесса, экономически эффективно упростить технологию, увеличить выход препарата, полностью свободного от липопротеинов и агрегированных белков, повысить титры антител против Shigella flexner и Salmonella, улучшить органолептические качества, резко повысить иммунофоретическую чистоту, значительно повысить растворимость препарата и заменить стабилизатор, что препятствует агрегации белка.

Список литературы:

1. Патент СССР №836831, МКИ А 61 К 35/14. БИ №15, 1982.

2. Патент РФ №2084229, МПК А 61 К 35/14. Бюл. №20 20.07.97 - прототип.