способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов

Формула изобретения

1. Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов, включающий иммунизацию кроликов для получения сыворотки крови с выделением антител, иммобилизацию последних на полимерном носителе с последующим проведением реакции агломерации объемной, отличающийся тем, что путем поэтапной иммунизации кроликов липазой Pseudomonas sp. получают антилипазные антитела, которые затем иммобилизуют на полимерные микросферы, а затем в реакции агломерации объемной исследуемые гемолитичные штаммы холерных вибрионов обнаруживают свойство продуцировать липазу при взаимодействии с антилипазными антителами, иммобилизованными на полимерном носителе, и дают при этом положительную реакцию, подтверждая атоксигенность исследуемого штамма, причем токсигенные - негемолитичные штаммы такой способностью не обладают и показывают отрицательную реакцию.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препарата, предназначенного для проведения иммунизации кроликов, используют липазу Pseudomonas sp., которую в количестве 100 мкг растворяют в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, который затем подвергают суспендированию в полном адъюванте Фрейнда в соотношении 1:1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что поэтапную иммунизацию кроликов проводят в три этапа, первый заключается в том, что вначале в первый день иммунизации в подушечки лапок вводят 0,1 мл препарата липазы, на 27 день такое же количество вводят подкожно в холку животного, а на 47 день опять 0,1 мл вводят в подушечки лапок, при этом на 60 день проводят обескровливание животного с последующим выделением из сыворотки антилипазных антител.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения реакции агломерации объемной используют 1%-ный раствор нормальной кроличьей сыворотки, которую разливают по 50 мкл в U-лунки планшета с последующим добавлением в них по 50 мкл исследуемой 4-часовой бульонной культуры, проведя ее предварительную подготовку на основе исследуемого штамма, а затем в лунки добавляют 25 мкл суспензии, иммобилизованной на полимерных микросферах антилипазных антител, помешивают покачиванием в течение 1 мин и оставляют при температуре 20°С на 3 ч.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике особо опасных инфекций, а именно для обнаружения атоксигенных - гемолитичных штаммов холерных вибрионов по их способности продуцировать липазу.

В настоящее время как в отечественной, так и в зарубежной практике отсутствуют серологические методы и препараты, дающие возможность провести дифференциальную диагностику штаммов холерных вибрионов. Это связано с трудностями в получении очищенных препаратов холерного токсина и гемолизина в достаточных количествах и высокоспецифичных дифференцирующих сывороток как к холерному токсину, так и к гемолизину. Поиск новых подходов и принципов дифференциации токсигенных и гемолитичных (атоксигенных) вибрионов является одной из основных проблем диагностики возбудителя холеры.

Известен способ определения гемолитической активности холерных вибрионов по Грейгу (см. "Микробиология и лабораторная диагностика холеры", Ростовское книжное издательство, 1975 г., стр.77), заключающийся в том что в суточную бульонную культуру добавляют взвесь эритроцитов барана, трижды отмытых физиологическим раствором, смесь перемешивают встряхиванием и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37°С, причем при положительной реакции наступает лизис эритроцитов (лаковая кровь), культуру считают атоксигенной - гемолитичной, а в случае отрицательного результата происходит осаждение эритроцитов в виде четкого колечка на дне пробирки - культуру считают токсигенной.

Недостатком известного способа тестирования гемолиза по Грейгу является то, что он требует длительного времени проведения, при этом для его выполнения необходима свежая кровь, наличие животного и удовлетворительные условия его содержания.

Кроме того, способ не отличается стандартностью и воспроизводимостью, в виду того что сопровождается трудоемкостью взятия крови у животного.

В экспрессной диагностике сегодня находит широкое использование реакция латексной агглютинации.

Известен способ выявления микробактериальных антигенов (см. пат. RU №2147125, кл. G 01 N 33/50, 33/569, 27.03.2000 г.), включающий постановку реакции агглютинации исследуемого материала с латексом, на котором иммобилизованы кроличьи иммуноглобулины к микобактериям туберкулеза, и с контрольным латексным препаратом, при этом в качестве исследуемого материала используют мокроту, а в качестве контрольного латексного препарата - латекс, с иммобилизованными иммуноглобулинами кролика до его иммунизации микобактериями туберкулеза.

Однако в известном способе исследуемым материалом служит мокрота от больных с поражениями легких на наличие микробактерий антигенов и микобактерий туберкулеза. Что касается исследований с применением реакции агглютинации для выявления атоксигенных (гемолитичных ctx^-) штаммов холерных вибрионов, авторам не известны, так как в практике лабораторных и экспериментальных исследований не использовали антилипазные антитела для выявления антигенов гемолитичных холерных вибрионов.

Техническим результатом заявляемого способа является сокращение сроков проведения и повышение демонстративности результатов при тестировании атоксигенных штаммов в процессе определения эпидемической значимости холерных вибрионов.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов, включающем иммунизацию кроликов для получения сыворотки крови с выделением антител, иммобилизацию последних на полимерном носителе с последующим проведением реакции агломерации объемной, иммунизацию кроликов проводят поэтапно липазой Pseudomonas sp., получая при этом антилипазные антитела, которые затем иммобилизуют на полимерные микросферы, а затем, в реакции агломерации объемной, исследуемые гемолитичные штаммы холерных вибрионов обнаруживают свойство продуцировать липазу при взаимодействии с антилипазными антителами, иммобилизованными на полимерном носителе, и дают при этом положительную реакцию, подтверждая атоксигенность исследуемого штамма, причем токсигенные - негемолитичные штаммы такой способностью не обладают и показывают отрицательную реакцию.

Причем в качестве препарата, предназначенного для проведения иммунизации кроликов используют липазу Pseudomonas sp. в количестве 100 мкг, которую растворяют в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, который затем подвергают суспендированию в полном адъюванте Фрейнда в отношении 1:1.

Кроме того, поэтапную иммунизацию кроликов проводят в три этапа, первый заключается в том, что вначале, в первый день иммунизации, в подушечки лапок вводят 0,1 мл препарата липазы, на 27 день такое же количество вводят подкожно в холку животного, а на 47 день опять 0,1 мл вводят в подушечки лапок, при этом на 60 день проводят обескровливание животного с последующим выделением из сыворотки антилипазных антител.

При этом для проведения реакции агломерации объемной используют 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки, которую разливают по 50 мкл в U-лунки планшета с последующим добавлением в них по 50 мкл исследуемой 4-часовой бульонной культуры, проведя ее предварительную подготовку на основе исследуемого штамма, а затем в лунки добавляют 25 мкл суспензии иммобилизованной на полимерных микросферах антилипазных антител, помешивают покачиванием в течение 1 минуты и оставляют при температуре 20°С на 3 часа.

Способ выполняется следующим образом.

Для получения антител из антилипазной сыворотки первоначально проводили иммунизацию взрослых кроликов массой 2,5-3 кг.

Иммунизацию проводили в три этапа:

I этап - препарат липазы - Pseudomonas sp. (Serva) в количестве 100 мкг растворяют в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, суспендируют в полном адъюванте Фрейнда в отношении 1:1 и вводят по 0,1 мл в подушечки лапок кроликов.

II этап - на 27 день от начала иммунизации липазу в том же количестве и составе вводят подкожно в холку животного.

III этап - на 47 день от начала иммунизации липазу вводят в подушечки лапок. Обескровливание животных проводили на 60 день от начала иммунизации. Титр антител полученной сыворотки составляет 1:1600. Активность сыворотки определяют методом иммуноблотинга, а антилипазные антитела из иммунной сыворотки выделяют методом Dubert.

После этого проводят иммобилизацию антилипазных антител на полимерных микросферах.

Антилипазные антитела ковалентно связывают с полимерными микросферами методом, приведенным в РП №978-00 (регламент производства), срок введения 20.06.2000 г.

В центрифужный стакан помещают 100 мг ПА-носителя (1 мл суспензии микросфер) и дважды отмывают его 0,1 М карбонатным буферным раствором по 10 мл, рН 9,2±0,1, при (3000±100) об/мин в течение (10±2) мин. Затем носитель суспендируют в 1,5 мл 0,1 М карбонатного буферного раствора, содержащего 450 мкг/мл антилипазных иммуноглобулинов и, перемешивая, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре (20±2)°С. После 16-18 часового контакта при температуре (7±2)°С к суспензии добавляют 2 мл 1,0% раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре (20±2)°С. Полученную таким образом суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 минут. Осадок диагностикума повторно суспендируют в 8 мл 0,1%-ного раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия. После чего определяют активность и специфичность суспензии полученного препарата, затем разливают в ампулы и высушивают лиофилизацией. Следующий этап способа заключается в выявлении липазной активности исследуемых штаммов в иммунологической реакции - реакции агломерации объемной (РАО) (приведенной в ФПС №0419284102) с иммобилизованными на микросферах (латексных частицах) антилипазными антителами.

Постановку реакции (РАО) проводят в следующей последовательности.

Вначале проводят подготовку культур исследуемых штаммов. Для этого из 24-часовой агаровой культуры готовят взвесь 1 мл на 0,9% раствора хлорида натрия с 10⁸ микробных клеток/мл холерных вибрионов по стандарту оптической плотности, отбирают 100 мкл и сеют на бульон Мартена, после этого через 4 часа ставят реакцию.

Затем в U-лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС) пипеткой-капельницей от Такачи. В первую лунку ряда вносят по 50 мкл исследуемой 4-часовой бульонной культуры автоматической пипеткой-дозатором и титруют в трех лунках. В каждую лунку добавляют по 25 мкл пипеткой-капельницей суспензии иммобилизованных на полимерных микросферах антилипазных антител. После добавления суспензии содержимое лунок помешивают покачиванием планшета в течение 1 минуты и оставляют при температуре 20°С на 3 часа.

Для контроля диагностикума на спонтанную агломерацию в 2-3 лунки вносят только НКС и диагностикум. Через 3 часа проводят учет результатов реакции.

За положительный результат (+) принимают цветной ярко-розовый агломерат, равномерно выстилающий все дно лунки. Положительный результат (+) указывает на наличие в бульонной культуре липазы, что свидетельствует о гемолитической активности штамма. В случае отрицательного результата частицы выпадают на дно лунки в виде точечного осадка или колечка. При получении отрицательного результата (-) можно предположить, что штамм является токсигенным.

Пример 1.

В 5 лунок вертикального ряда планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1% раствора НКС. В первую лунку вносят 50 мкл 4-часовой бульонной культуры V. cholerae eltor 18251 (Hly⁺, ctx^- ) и титруют методом двукратных разведении в 3 лунках. 4 и 5 лунки - контроль суспензии антилипазных антител. После этого во все пять лунок добавляют по 25 мкл суспензии антилипазных антител, иммобилизованных на полимерных частицах. Содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 мин и оставляют при температуре (20±2)°С на 3 часа. Через 3 часа производят учет реакции. В первых лунках наблюдается цветной ярко-розовый агломерат, равномерно выстилающий дно лунки.

1 -я лунка	2-я лунка	3-я лунка	4-я лунка	5-я лунка
+	+	+	-	-

4 и 5 лунки - "точечный" осадок частиц в центре лунки.

Пример 2.

Отличается от примера 1 тем, что в качестве исследуемой культуры используют V. cholerae eltor 18254 (Hly ⁺, ctx ^-).

При учете результатов реакции наблюдается следующая картина

1-я лунка	2-я лунка	3-я лунка	4-я лунка	5-я лунка
+	+	+	-	-

Положительная реакция в трех лунках указывает на продукцию липазы штаммом V. cholerae eltor 18254 и свидетельствует о гемолитической активности штамма.

Пример 3.

Отличается от примера 1 тем, что в качестве исследуемой культуры используют V. cholerae 569В. Во всех 3 лунках с исследуемой культурой и в контрольных лунках (4 и 5) наблюдается отрицательная реакция в виде четких "колечек", что указывает на отсутствие тестируемой липазы в культуре и позволяет сделать вывод о токсигенности исследуемого штамма.

Способ выявления атоксигенных - гемолитичных штаммов холерных вибрионов апробирован авторами Ростовского-на-Дону противочумного института (РПЧИ) на 50 экспериментах с различными штаммами холерных вибрионов (см. таблицу), все они подтверждают результативность реакции (РАО) и позволяют сделать вывод, что гемолитичные штаммы обладают липазной активностью в отличие от токсигенных в серологической реакции на основе антилипазных антител.

Использование предложенного способа позволяет значительно сократить время проведения тестирования атоксигенных штаммов холерных вибрионов при определении эпидемической значимости. При наличии заранее заготовленного лиофилизированного диагностикума с антилипазными антителами на полимерном носителе, реакция экспрессна, так как результат получаем через 2-3 часа, при этом реакция демонстративна и легко учитываема.

Наименование штамма	Токсигенность методом ПЦР	Гемолиз по Грейгу (Hly +)	Результаты реакции (РАО)
V. cholerae eltor
17900	ctx+	Hly-	-
17901	ctx +	Hly-	-
17903	ctx +	Hly -	-
18210	ctx+	Hly-	-
18228	ctx +	Hly-	-
17447	ctx +	Hly -	-
18327	ctx-	Hly+	+
18117	ctx -	Hly+	+
18249	ctx -	Hly +	+
18251	ctx-	Hly+	+
18254	ctx -	Hly+	+
18305	ctx -	Hly +	+