штамм гриба aspergillus terreus № 44-62 - продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатина и способ лактонизации статинов

Формула изобретения

1. Штамм гриба Aspergillus terreus № 44-62 (депонирован в коллекции фирмы Metkinen Oy, Littoinen, Finland) - продуцент ловастатина.

2. Способ выделения ловастатина, включающий экстракцию его из сырья, полученного культивированием гриба - продуцента ловастатина, концентрирование экстракта, лактонизацию кислотной формы ловастатина и последующие двухстадийную очистку от примесей и кристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что лактонизацию проводят в отсутствии растворителя, а вторую стадию очистки - осветление - осуществляют после промывания органическим растворителем или смесью органических растворителей.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве сырья, полученного культивированием гриба-продуцента ловастатина, используют культуральную жидкость, ее фильтрат или мицелий.

4. Способ по любому из пп.2 и 3, отличающийся тем, что в качестве продуцента ловастатина используют грибы рода Aspergillus.

5. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют грибы, относящиеся к виду Aspergillus terreus, или Aspergillus orysae, или Aspergillus obscurus.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве продуцента ловастатина используют штамм гриба Aspergillus terreus № 44-62 (депонирован в коллекции фирмы Metkinen Oy, Littoinen, Finland).

7. Способ по п.2, отличающийся тем, что экстракцию ловастатина осуществляют органическим растворителем после доведения рН культуральной жидкости до значения в интервале 2-5.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что для доведения рН культуральной жидкости до значения в интервале 2-5 используют минеральную кислоту, выбранную из группы, включающей фосфорную, соляную и серную кислоты.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что экстракцию ловастатина осуществляют органическим растворителем, выбранным из группы, включающей сложные эфиры органических кислот, ароматические и хлорсодержащие углеводороды.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве сложных эфиров органических кислот используют этилацетат, бутилацетат или метилацетат, в качестве ароматического углеводорода - толуол, а в качестве хлорсодержащих углеводородов - хлороформ, хлористый метилен или дихлорэтан.

11. Способ по п.2, отличающийся тем, что экстракцию ловастатина осуществляют щелочью.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве щелочи используют гидроокись аммония.

13. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрирование экстракта ловастатина ведут при пониженном давлении.

14. Способ по п.2, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в интервале температур 60 - 80°С.

15. Способ по любому из пп.2 и 14, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют при пониженном давлении.

16. Способ по любому из пп.2 и 14, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в токе азота.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в токе азота.

18. Способ по любому из пп.2 и 14, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в присутствии дегидратирующего агента.

19. Способ по п.15, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в присутствии дегидратирующего агента.

20. Способ по п.16, отличающийся тем, что лактонизацию осуществляют в присутствии дегидратирующего агента.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

22. Способ по п.19, отличающийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

23. Способ по п.20, отличающийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

24. Способ по любому из пп.21-23, отличающийся тем, что в качестве высокомолекулярного твердого дегидратирующего адсорбента используют силикагель, сефадекс или молекулярное сито.

25. Способ по любому из пп.2 и 14, отличающийся тем, что лактонизацию ловастатина осуществляют в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.

26. Способ по п.15, отличающийся тем, что лактонизацию ловастатина осуществляют в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.

27. Способ по п.2, отличающийся тем, что осветление осуществляют окисью алюминия, или активированным углем, или тем и другим последовательно.

28. Способ по п.2, отличающийся тем, что для промывания в качестве органического растворителя используют толуол или бензол.

29. Способ по п.2, отличающийся тем, что для промывания в качестве смеси органических растворителей используют смесь неполярного и полярного растворителя.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что в качестве неполярного растворителя используют растворитель, выбранный из группы, включающей петролейный эфир, гептан и гексан.

31. Способ по п.29, отличающийся тем, что в качестве полярного растворителя используют растворитель, выбранный из группы, включающей этилацетат, ацетон, бутилацетат, хлороформ, дихлорэтан и хлористый метилен.

32. Способ по п.2, отличающийся тем, что кристаллизацию целевого продукта осуществляют из этанола или его водного раствора.

33. Способ получения лактонной формы статинов формулы I

в которой R представляет собой атом водорода или низший алкил, предусматривающий лактонизацию их кислотной формы формулы II

в которой Х представляет собой атом водорода, катион металла или катион аммония, а R указан выше, характеризующийся тем, что процесс ведут в отсутствии растворителя.

34. Способ по п.33, характеризующийся тем, что соединением формулы I является лактонная форма ловастатина или симвастатина.

35. Способ по п.33, характеризующийся тем, что соединением формулы II является кислотная форма ловастатина или симвастатина, или их аммонийные соли.

36. Способ по п.33, характеризующийся тем, что процесс ведут в интервале температур 60 - 80°С.

37. Способ по любому из пп.33 и 36, характеризующийся тем, что процесс ведут при пониженном давлении.

38. Способ по любому из пп.33 и 36, характеризующийся тем, что процесс ведут в токе азота.

39. Способ по п.37, характеризующийся тем, что процесс ведут в токе азота.

40. Способ по любому из пп.33 и 36, характеризующийся тем, что процесс ведут в присутствии дегидратирующего агента.

41. Способ по п.37, характеризующийся тем, что процесс ведут в присутствии дегидратирующего агента.

42. Способ по п.38, характеризующийся тем, что процесс ведут в присутствии дегидратирующего агента.

43. Способ по п.40, характеризующийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

44. Способ по п.41, характеризующийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

45. Способ по п.42, характеризующийся тем, что в качестве дегидратирующего агента используют агент, выбранный из группы, включающей сульфат магния, сульфат натрия, хлорид кальция и высокомолекулярный твердый дегидратирующий адсорбент и их комбинацию.

46. Способ по любому из пп.43-45, характеризующийся тем, что в качестве высокомолекулярного твердого дегидратирующего адсорбента используют силикагель, сефадекс или молекулярное сито.

47. Способ по любому из пп.33 и 36, характеризующийся тем, что процесс ведут в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.

48. Способ по п.37, характеризующийся тем, что процесс ведут в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относятся изобретения

Изобретения относятся к биотехнологии и органической химии, касаются микробиологического синтеза ловастатина - ингибитора 3-гидрокси 3-метилглутарил-кофермент A (HMG-CoA) редуктазы и представляют собой штамм-продуцент ловастатина, промышленный способ его выделения и отдельную стадию этого процесса, а именно способ лактонизации статинов.

Изобретения могут быть использованы в химико-фармацевтической, парафармацевтической, парфюмерно-косметической промышленностях, медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Уровень техники

Ловастатин наряду с другими статинами находит чрезвычайно широкое применение в качестве активного начала фармацевтических препаратов гипохолестеролемического действия. Препараты этого класса обнаруживают также высокую остеотропную и антитромботическую клиническую эффективность (Meier G.R., Schlienger R.G., Kraenzlin M.E., et al. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures. JAMA. 2000; 283:3205-3210.; Wang P.S., Solomon D.H., Mogan J. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures in elderly patients. JAMA. 2000; 283:3211-3216.; EP 1291017 A3; Grady D., Wenger N.K., Herrington D., et al. Postmenopausal hormone therapy increases risk for venous thromboembolic disease: the Heart and Estrogen/progestin Replacement Study. Ann Intern Med. 2000; 132: 689-696).

Поскольку атеросклероз является главной причиной смертности в экономически развитых странах, а переломы костей, связанные в том числе с остеопорозом, и венозный тромбоз являются основными причинами инвалидизации населения, потребность в вышеуказанных препаратах постоянно возрастает.

Кроме того, ловастатин и его химические аналоги являются исходной субстанцией для получения их производных того же биологического действия, а также других известных статинов, в частности симвастатина и правастатина, путем химической и биологической трансформации (JP 2003012607; EP 1284264 A1; US 6.472.542; JP 2001286293).

В связи с вышеизложенным особое значение приобретают получение высокопродуктивных промышленных штаммов - продуцентов ловастатина и разработка экономичных, технологичных и экологически безопасных способов его выделения, а также отдельных операций этого процесса, обеспечивающих получение коммерческого продукта фармакопейной чистоты с максимальным выходом и низкой себестоимостью.

Известны штаммы грибов-продуцентов ловастатина из рода Aspergillus: Asp. terreus AD 43, DS 28373, CBS 456.95 (Cenrraal Bureau voor Schimmelcultures, Delfr, The Netherlands; EP 0877089 Al); Asp. terreus CCM 8236 (WO 99/19458; WO 00/63411); Asp. terreus ATCC 20541 (US 4.231.938); Asp. terreus ATCC 20542 (EP 0022478); Asp. oryzae ATCC 74135 (RU 2114912; US 5.362.638); Asp. obscurus - MV-1 holotype strain (NCAIM (P) F 001189; WO 94/10328).

Однако продуктивность известных штаммов не превышает 3 г/л культуральной жидкости, что обусловливает недостаточную рентабельность производства ловастатина.

Известны способы выделения ловастатина в лактонной форме из сырья, полученного культивированием грибов-продуцентов из рода Aspergillus: (RU 2114912; WO 00/63411; ЕР 0877742 B1; WO 94/10328; ЕР 0 877 089 A1; WO 97/20834; WO 00/17182; WO 98/50572; ЕР 0 556 699; US 5.362.638).

Недостатками известных способов являются:

- недостаточная чистота целевого продукта вследствие загрязненности его, в частности, такими трудноотделяемыми примесями, как димеры и кислотная форма ловастатина;

- недостаточный выход целевого продукта, в ряде случаев не превышающий 50-60%;

- низкая производственная и экологическая безопасность вследствие использования в процессе больших объемов токсичных органических растворителей, кислот, катализаторов и т.п.;

- высокая энергоемкость по причине отгонки в процессе высококипящих органических растворителей;

- низкие экономичность и технологичность вследствие сложности и многостадийности ряда процессов, а также использования специального дорогостоящего оборудования.

Ближайшим аналогом заявленного способа выделения ловастатина является способ выделения его из культуральной жидкости, полученной культивированием гриба-продуцента вида Aspergillus terreus, включающий подкисление культуральной жидкости соляной кислотой, экстракцию ловастатина этилацетатом, концентрирование полученного экстракта перегонкой в вакууме, лактонизацию кислотной формы ловастатина путем кипячения концентрата в толуоле при 106°С в течение двух часов, двухстадийную очистку лактонной формы ловастатина от примесей посредством хроматографии на силикагеле и осветления активированным углем и, наконец, кристаллизацию целевого продукта (ЕР 0033536 В1; Compound III a, pp.3-4; steps B1-B3).

Известный способ имеет ряд существенных недостатков:

- целевой продукт не обладает фармокопейной чистотой вследствие загрязненности его димерами, образующимися при высокотемпературной лактонизации в присутствии растворителя;

- низкая производственная и экологическая безопасность процесса вследствие использования в нем больших объемов токсичных органических растворителей (толуола, метиленхлорида и т.д.);

- высокая энергоемкость процесса по причине длительности и высокотемпературного режима стадии лактонизации;

- низкие экономичность и технологичность процесса в связи с необходимостью утилизации и/или регенерации больших объемов силикагеля и органических растворителей, а также использованием специального дорогостоящего оборудования.

Несмотря на то обстоятельство, что физиологически активной является кислотная форма статинов, последние, как правило, получают в лактонной форме, являющейся коммерческим продуктом, так как лактон легко кристаллизуется, хорошо очищается от примесей и подлежит длительному хранению и сертификации.

Поэтому ключевой стадией выделения ловастатина, а также получения других статинов является процесс лактонизации их кислотной формы.

Известны различные способы лактонизации кислотной формы статинов, заключающиеся в проведении процесса в толуоле при температуре 106-110°С в течение двух-шести часов (ЕР 0033536 B1; WO 98/50572; US 5.362.638); осуществлении лактонизации одновременно с концентрированном в бутилацетате при пониженном давлении и температуре 55-60°С (RU 2114912, US 5.712.130); кипячении в хлороформе и других галогенсодержащих растворителях (WO 97/20834); нагревании в водной среде до температуры 50-60°С в присутствии больших количеств минеральной кислоты в качестве катализатора в течение 24 ч (WO 02/0065); вакуумной перегонке в органическом растворителе при температуре 60°С в присутствии 0,1-1,0%-ной уксусной кислоты (WO 00/63411); нагревании аммонийной соли ловастатина или симвастатина в уксусной кислоте до температуры 35-40°С в атмосфере азота (ЕР 0955297 А1); нагревании аммонийной соли ловастатина или симвастатина до температуры 100-110°С в толуоле в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов в течение 3 ч (ЕР 1288212 A1); проведении лактонизации в органическом растворителе в атмосфере азота при комнатной температуре в присутствии агентов лактонизации, связывающих в нерастворимый комплекс образующуюся в процессе реакции воду (US 6.562.984 В2).

Недостатками известных способов являются:

- образование побочных продуктов, в частности димеров, при проведени лактонизации в режиме высоких температур и присутствии растворителей и/или использовании в качестве катализаторов сильных минеральных кислот, что препятствует получению целевых продуктов фармакопейной чистоты и приводит к необходимости их дополнительной очистки (US 20020002288; US 6.521.762);

- неполная лактонизация (кислотная форма трансформируется в лактон лишь на 50-90%) и нежелательная длительности процесса (до 24 ч) при умеренных температурах и использовании кислот в качестве катализаторов;

- необходимость отделения и/или выделения целевого продукта из реакционной смеси;

- высокая энергоемкость и недостаточная технологическая и экологическая безопасность процесса при использовании высококипящих токсичных растворителей (толуол, галогенсодержащие растворители и т.п.);

- необходимость утилизации и/или регенерации используемых в процессе, как правило, больших объемов растворителей, осадителей, катализаторов и т.п.;

- необходимость предварительного выделения ловастатина или симвастатина в виде аммонийных солей.

Процесс лактонизации в отсутствии растворителя в литературе не описан.

Краткое описание фигур

В дальнейшем изобретения поясняются фигурами, при этом

Фиг.1 - иллюстрирует ¹H ЯМР - спектр выделенного заявленным способом вещества - ловастатина в растворе CDCl₃ относительно тетраметилсилана;

Фиг.2 - иллюстрирует ИК-спектр выделенного заявленным способом вещества - ловастатина в KBr.

Сущность изобретений

В основу изобретений положена задача получения нового высокопродуктивного штамма Aspergillus terreus - продуцента ловастатина и разработки высокотехнологичных, экономичных и экологически безопасных способа его выделения, а также отдельной операции этого способа, а именно процесса лактонизации статинов.

Задача изобретений в части штамма решена тем, что получен новый штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия) - продуцент ловастатина. Техническими результатами заявленного изобретения являются:

- высокая продуктивность (6-8 г/л культуральной жидкости);

- генетическая устойчивость;

- стабильность в условиях производства (заявленный штамм не теряет начальную продуктивность в течение 4-5 циклов культивирования).

Заявленный штамм получен путем многостадийного комбинированного метода индуцированного мутагенеза исходного штамма Asp. terreus, хранящегося в Американской Коллекции Типированных Культур под номером АТСС 20542.

Штамм депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия под номером 44-62.

Штамм характеризуется следующими признаками:

- культурально-морфологическими

На агаризованной среде 12-суточная колония имеет округлую неправильную форму с нерегулярно изрезанными краями, вулканическим профилем. Возможен кратер в центре. Диаметр колонии 20-30 мм; окраска колонии коричневато-красная. Мицелий плотный, компактный, без воздушного пушистого слоя. Гифы короткие, разветвленные, состоящие из расширенных клеток нерегулярной формы, диаметром от 5 до 30 мкм. Субстратный мицелий прорастает глубоко в питательную среду, образуя воздушные полости на дне чашки.

В жидкой питательной среде растет в виде открытой мицелиальной и компактной шарообразной формы. Гифы в основном короткие, силько разветвленные, закручивающиеся, состоящие из нерегулярных расширенных коротких клеток.

- физиологическими

Штамм является строгим аэробом, при ферментации необходима интенсивная аэрация. Растет на многих органических субстратах, таких как овсяная, рисовая, кукурузная мука. Рост на пительной среде и ферментация могут происходить при температуре 20-37°С, при этом температурный оптимум составляет 25-27°С, оптимальное значение рН среды - 5,5-6,5.

- биохимическими

Штамм в питательных средах усваивает в качестве источника углеводов глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу и глицерин; в качестве источника азота использует пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина; из неорганических солей предпочтительно использует хлорид натрия, сульфат магния и фосфат калия.

- биотехнологическими

Максимальная продуктивность штамма составляет 6-8 г/л культуральной жидкости в течение 200-240 часов при температуре 26°С и следующем составе среды для ферментации (г/л):

пептон 10 г; соевая мука 40 г; солодовый экстракт 5 г; сахароза 200 г; КН₂PO₄ 0,5 г; NaCl 2 г; MgSO₄·7H₂O 0,5 г; дистиллированная вода до 1 л; до стерилизации рН составляет 6,0.

При этом заявленный штамм не теряет вышеуказанную продуктивность в течение 4-5 циклов культивирования.

- патогенность штамма

Экспериментально исследованы патогенные свойства микроорганизма, влияние его на интегральные показатели состояния организма экспериментальных животных и микрофлору кишечника, иммунотоксические свойства и возможность диссеминации его во внутренние органы с целью установления лимитирующего критерия вредного действия (ЛКВД) и обоснования ПДК_р.з и ПДК_а.в.

При внутрибрюшинном введении высоких доз микромицета не выявлено вирулентных и токсигенных свойств изучаемого штамма плесневого гриба. Он не обладает способностью к диссеминации в кровь и внутренние органы животных при однократном внутрибрюшинном введении больших доз штамма-продуцента. Раздражающее действие суспензии гриба при однократном нанесении на слизистые оболочки глаз кролика также отсутствует.

Обследование подопытных животных в хроническом эксперименте показало, что воздействие штамма-продуцента в двух концентрациях (3.5·10³ и 3.5·10⁴ кл/м³) в течение 1 месяца не приводило к изменению интегральных показателей состояния организма экспериментальных животных, которое оценивалось по динамике массы тела в течение эксперимента и в восстановительном периоде. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии общего токсического действия штамма-продуцента на организм крыс при хронической экспозиции его в изученных концентрациях.

В результате проведенных исследований по изучению иммунотоксических свойств микроорганизма установлено, что коэффициенты массы тимуса и селезенки экспериментальных животных при воздействии большей концентрации не отличались от таковых у животных контрольной группы.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия) не обладает патогенными свойствами для теплокровных животных.

Техническими результатами заявленных изобретений в части способа выделения ловастатина являются:

- получение целевого продукта фармакопейной чистоты без примеси димеров и кислотной формы ловастатина при одновременном увеличении его выхода (более 70%);

- повышение производственной и экологической безопасности процесса вследствие исключения из него использования больших объемов токсичных органических растворителей (толуола, метиленхлорида) при высокотемпературных режимах;

- снижение энергоемкости процесса;

- повышение экономичности и технологичности процесса вследствие его простоты, отсутствия специального дорогостоящего оборудования и возможности использования замкнутого производственного цикла (применения одного растворителя, в частности этилацетата, в течение всего производства).

Способ выделения ловастатина согласно изобретению включает следующие стадии:

a) экстракцию его из сырья, полученного культивированием гриба-продуцента ловастатина;

b) концентрирование экстракта;

c) лактонизацию в отсутствии растворителя;

d) двухстадийную очистку от примесей, а именно промывание органическим растворителем или смесью органических растворителей и осветление;

e) кристаллизацию целевого продукта.

В частных случаях реализации заявленного способа в качестве гриба-продуцента могут использоваться штаммы Aspergillus terreus, Aspergillus orysae или Aspergillus obscurus, предпочтительно Asp. terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия); при этом сырьем, полученным культивированием гриба-продуцента, может служить культуральная жидкость, ее фильтрат или мицелий.

Экстракцию ловастатина целесообразно осуществлять органическим растворителем после доведения рН культуральной жидкости до значения в интервале 2-5 с помощью соляной, фосфорной или серной кислоты или щелочью. В качестве органического растворителя предпочтительно использовать этилацетат или бутиацетат, а в качестве щелочи - гидроокись аммония. Концентрирование экстракта ловастатина желательно проводить при пониженном давлении.

Лактонизацию кислотной формы ловастатина предпочтительно осуществлять в интервале температур 70-75°С при пониженном давлении в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.

Однако указанный процесс можно проводить и в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов - солей или высокомолекулярных твердых дегидратирующих адсорбентов.

На первой стадии очистки от примесей - промывании в качестве органического растворителя возможно использование бензола или толуола, а в качестве смеси органических растворителей - смесь неполярного и полярного растворителя. Предпочтительно применение для данной процедуры смеси гексан - этилацетат (3:1), петролейный эфир - этилацетат (4:1), гептан - этилацетат (2:1), гексан - бутилацетат (3:1), петролейный эфир - бутилацетат (4:1), гептан - бутилацетат (2:1) и др.

На второй стадии очистки от примесей - осветлении целесообразно использовать в качестве адсорбента окись алюминия или активированный уголь или тот и другой адсорбент последовательно.

Кристаллизацию целевого продукта можно осуществлять из этанола или его водного раствора.

Техническими результатами заявленных изобретений в части способа лактонизации кислотной формы статинов являются:

- практически полное отсутствие в продукте лактонизации примесей в виде димеров, поскольку большая вязкость реакционной среды и кристаллизация из нее лактонов по мере их образования препятствует межмолекулярным взаимодействиям, приводящим к образованию димеров (минимальное содержание димеров в продукте лактонизации составляет 0.13-0.17 мас.% для ловастатина или симвастатина, ЕР 1288212 A1 и 0.06-0.1 мас.% для симвастатина, US 6.562.984 В2);

- протекание реакции практически до конца, что обеспечивает 100%-ный выход лактонной формы статинов вследствие последовательного смещения равновесия в сторону образования лактона по мере его кристаллизации;

- получение лактонной формы статинов по окончании процесса непосредственно в виде кристаллов, вследствие чего исключается необходимость отделения и/или выделения целевого продукта из реакционной смеси;

- снижение себестоимости продукта лактонизации вследствие исключения расходов на растворители, катализаторы, осадители, дегидратирующие агенты и т.п. и на последующую их утилизацию и/или регенерацию;

- производственная и экологическая безопасность процесса вследствие исключения из него органических растворителей, кислот, осадителей и т.п., а также высокотемпературных режимов.

Лактонизацию кислотной формы статинов согласно изобретению проводят в отсутствии растворителя.

Процесс лактонизации статинов предпочтительно осуществлять в интервале температур 60-80°С при пониженном давлении в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде. Однако заявленный способ лактонизации можно проводить и в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов - солей или высокомолекулярных твердых дегидратирующих адсорбентов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретений

ПРИМЕР 1

В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм³ с 4,5 дм ³ реакционной среды, содержащей углеводы, источники азота (соевую, овсяную муку, пептоны) и неорганические соли. Параметры процесса культивирования: температура 28°С, перемешивание 3,6-13,3 сек^-1, аэрация 0,13-0,90 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 30%. В процессе ферментации при повышении вязкости культуральной жидкости проводили добавки раствором сахарозы и дистиллированной воды. Длительность процесса составляет 180-240 ч, Культуральная жидкость по окончании процесса ферментации содержит 8,7 г/дм³ ловастатина (сумма кислотной и лактонной форм).

5 дм³ культуральной жидкости, содержащей 43,5 г ловастатина, подкисляют разбавленной ортофосфорной кислотой до рН 3,5 и выдерживают 30 мин. Биомассу отфильтровывают, промывают подкисленной водой и отжимают. Ловастатин дважды экстрагируют из сырой биомассы этилацетатом. Объединенные этилацетатные экстракты концентрируют упариванием при пониженном давлении. Растворитель отгоняют полностью, остаток прогревают при пониженном давлении и/или в токе азота в течение 3 ч при 70-75°С для полной лактонизации кислотной формы ловастатина. Реакционную массу промывают 80 см³ смеси гексан - этилацетат в соотношении 3:1 для удаления липидов и неполярных примесей. Осадок отфильтровывают и промывают 20 см³ этой же смеси. Полученный технический ловастатин (34,4 г 96% чистоты) растворяют в этилацетате и раствор осветляют, пропуская через слой нейтральной окиси алюминия (150 г) или активированного угля (50 г) или того и другого последовательно. Окись алюминия и/или активированный уголь промывают этилацетатом и объединенные этилацетатные растворы упаривают досуха. Отработанный этилацетат регенерируют и вновь используют для экстракции ловастатина.

Получают 33 г ловастатина 98% чистоты. Целевой продукт перекристаллизовывают из водного этанола и сушат. Выход ловастатина составляет 70% (30,4 г), содержание основного вещества (HPLC) - 99,5%. Димеры отсутствуют. Хроматографическая подвижность соединения на пластинах Силуфола (Чехия) в системе хлороформ - ацетон (3:1) R_f ˜0,45. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена ЯМР-спектроскопией (фиг.1) и ИК-спектроскопией (фиг.2).

В ультрафиолетовой области спектра для раствора выделенного вещества в метаноле максимумы поглощения наблюдаются при 246,0; 237,5 и 230,0 nm. Для максимума 237,5 nm A₁% в метаноле составляет 594.

ПРИМЕР 2

Для биосинтеза ловастатина использовали штамм Aspergillus terreus №43-16 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культуральную жидкость, содержащую ловастатин, получали в биореакторе объемом 10 дм³ с 6 дм³ среды, идентичной среде в примере 1. Процесс ферментации проводили при следующих параметрах: температура 28°С, перемешивание 5,0-14,0 сек^-1 , аэрация 0,16-10,8 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 10%. В процессе ферментации добавляли раствор сахарозы в количестве 20% от объема среды. Длительность процесса составляет 192 ч. Культуральная жидкость по окончании процесса ферментации содержит 8,5 г/дм³ ловастатина (сумма лактонной и кислотной форм).

5,5 дм³ культуральной жидкости, содержащей 46,75 г ловастатина, подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 4,0. Мицелий отфильтровывают, промывают и отжимают. Ловастатин из мицелия экстрагируют хлороформом. Хлороформенный раствор концентрируют на роторном испарителе. Хлороформ отгоняют полностью, а к остатку добавляют дегидратирующий агент - сульфат магния (7,5 г) или хлорид кальция (6 г) и полученную смесь перемешивают, после чего прогревают при 70-75°С для полной лактонизации кислотной формы ловастатина. Масло с кристаллов сливают, а остаток промывают смесью петролейный эфир - этилацетат в соотношении 4:1. Технический продукт растворяют в хлороформе, фильтруют и фильтрат осветляют, пропуская через слой окиси алюминия или активированного угля. Окись алюминия или активированный уголь промывают хлороформом до полного вымывания ловастатина. Хлороформенные растворы объединяют, растворитель отгоняют. Остаток промывают небольшим количеством гексана, перекристаллизовывают из этанола и сушат. Выход ловастатина составляет 55% (25,7 г) с содержанием основного вещества 99% (HPLC). Содержание димеров не превышает 0,01%. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.

ПРИМЕР 3

В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 250 дм³ с 120 дм³ среды, по составу идентичной среде примера 1. Параметры процесса ферментации: температура 28°С, перемешивание 1,6-7,5 сек^-1, аэрация 0,08-1,2 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 50%. По ходу процесса ферментации проводили добавки раствором сахарозы и дистиллированной воды, общий объем добавок составил 60 дм ³. Длительность процесса составляет 216 ч. Культуральная жидкость по окончании процесса содержит 5,1 г/дм³ ловастатина.

8 дм³ культуральной жидкости подкисляют разбавленной серной кислотой до рН 2-3 и выдерживают 1 ч. Биомассу отфильтровывают и промывают на фильтре подкисленной водой. Получают 2 кг сырой биомассы, содержащей 40 г ловастатина. Ловастатин дважды экстрагируют из биомассы этилацетатом. Экстракт концентрируют на роторном испарителе до полной отгонки этилацетата. Остаток прогревают при 70-75°С в течение 3 ч. Кристаллы промывают смесью гептан - этилацетат в соотношении 2:1. Технический ловастатин растворяют в этилацетате и полученный раствор осветляют, перемешивая 30 мин со 100 г окиси алюминия и фильтруя через слой окиси алюминия. Осветленный раствор упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из водного спирта. Получают 25,2 г ловастатина, что составляет 63%. Чистота вещества 99% (HPLC). Димеры отсутствуют. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.

ПРИМЕР 4

В примере использовали штамм Aspergillus oryzae ATCC 74135.

Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм³ с 6 дм³ среды, идентичной среде в примере 1, в условиях, приведенных в примере 2.

Полученную культуральную жидкость (5 л), содержащую 1,3 г/дм³ ловастатина (сумма кислотной и лактонной форм) в фильтрате и 0,12 г/дм³ в мицелии, фильтруют. Мицелий удаляют, а к фильтрату добавляют 2 л бутилацетата и экстрагируют ловастатин в течение 1 ч. Экстракт охлаждают, затем на роторном испарителе растворитель отгоняют полностью при пониженном давлении. Остаток прогревают в течение 3 ч в токе азота при 75°С. Жидкость сливают и оставшиеся кристаллы промывают смесью циклогексана и бензола (10:1). Далее промытые кристаллы перерабатывают, как описано в примере 1.

Выход ловастатина в лактонной форме составляет 3,2 г (49%) с чистотой 98,7% (HPLC). Димеры отсутствуют. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.

ПРИМЕР 5

В примере использовали лабораторный штамм Aspergillus obscums VJ-1.

Процесс биосинтеза ловастатина проводили, как описано в примере 1. 5 дм³ культуральной жидкости, содержащей 6,5 г ловастатина, подкисляют Н₃PO₄ до рН 3-5, выдерживают 30 мин и осуществляют двухкратную экстракцию ловастатина толуолом из сырой отжатой биомассы.

Далее растворитель от экстракта отгоняют полностью и остаток прогревают в течение 6 ч при 60°С при пониженном давлении.

От остатка отделяют жидкую фазу и кристаллы промывают смесью толуол-петролейный эфир (1:10).

Промытые кристаллы перерабатывают, как это описано в примере 1.

Выход ловастатина составил 5 г (77%) с чистотой 98% (HPLC). Содержание димеров не превышает 0,01%.

Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.

ПРИМЕР 6

В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм³ с 6 дм ³ среды, идентичной среде в примере 1 в условиях, приведенных в примере 2.

Культуральная жидкость содержала 8,5 г/дм ³ ловастатина (сумма лактонной и кислотной форм).

К 5,5 дм³ культуральной жидкости, содержащей 46,75 г ловастатина, добавляют 0,5 дм³ 10%-ного водного раствора NH₃ и экстрагируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем биомассу отфильтровывают, промывают 0,5%-ным водным раствором NH₃ и отжимают.

Экстракт и промывку объединяют и концентрируют упариванием при пониженном давлении до полного удаления воды.

Остаток прогревают при пониженном давлении при 70-80°С в течение 3-4 ч для полной лактонизации ловастатина.

Жидкость с кристаллов сливают, а кристаллический остаток перерабатывают, как это описано в примере 1.

Выход ловастатина составляет 80% (37,4 г) с содержанием основного вещества 98,5% (HPLC). Димеры отсутствуют.

Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.

ПРИМЕР 7

Хлороформенный раствор, содержащий ловастатин или симвастатин в кислотной форме, концентрируют в вакууме при 30-40°С. Растворитель отгоняют полностью.

Остаток прогревают при пониженном давлении или в токе азота при 70-75°С в течение 2,5 ч. За это время кислота полностью переходит в лактон (контроль методом ТСХ на пластинах силикагеля в системе хлороформ - ацетон 3:1; R_f лактона 0,45-0,50; R_f кислоты 0,15-0,20). Образование димера не более 0,01% (HPLC).

Лактоны статинов по окончании процесса получают в кристаллическом виде.

ПРИМЕР 8

Этилацетатный раствор, содержащий ловастатин или симвастатин в кислотной форме, концентрируют в вакууме при 40-45°С. Растворитель отгоняют полностью, а остаток прогревают при пониженном давлении и/или в токе азота при 65-70°С в течение 3 ч. Кислота полностью трансформируется в лактон (контроль методом ТСХ, как указано в примере 7). Образование димеров не наблюдается (HPLC). Лактоны статинов по окончании процесса получают в кристаллическом виде.

ПРИМЕР 9

2 г аммонийной соли ловастатина или симвастатина (99% чистоты, HPLC) нагревают при пониженном давлении и/или в токе азота при 70-80°С в течение 3-4 ч.

По окончании процесса получают 1,82 г ловастатина или 1,83 г симвастатина в лактонной форме в кристаллическом виде с чистотой 99% (HPLC).

Примеси кислотной формы статинов, а также димеров отсутствуют (контроль методом ТСХ, как указано в примере 7; HPLC).

ПРИМЕР 10

2 г аммонийной соли ловастатина или симвастатина (95% чистоты, HPLC) нагревают при 70-80°С в течение 3-4 ч в присутствии дегидратирующего агента - сульфата магния (0,4 г) или сульфата натрия (0,4 г) или хлорида кальция (0,3 г).

Реакционную массу перекристаллизовывают из этанола. Получают 1,38 г ловастатина или 1,40 г симвастатина в лактонной форме с чистотой 99,9% (HPLC).

Образование димеров не наблюдается (HPLC), кислотная форма отсутствует (контроль методом ТСХ).