способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических соединений

Формула изобретения

1. Способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации фосфорорганических соединений, характеризующийся тем, что нерастворимый пористый материал помещают в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ так, что конечные концентрации компонентов в биокатализаторе составляют, мас.%:

Белок	До 2,5
Аминополисахарид	12,0-40,0
Нерастворимый носитель	28,0-60,0
Глутаровый альдегид	0,01-0,10
Антимикробные вещества	До 3,0
Вода	Остальное до 100%

2. Биокатализатор на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации фосфорорганических соединений, характеризующийся тем, что он получен по способу по п.1, содержит до 25,0 мг иммобилизованного белка/г биокатализатора и обладает каталитической активностью до 950 ед./г биокатализатора.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов, может быть использовано для удаления фосфорорганических соединений (ФОС) с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты.

Фосфорорганические соединения представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновых кислот и их производных, которые широко применяются в качестве боевых отравляющих веществ (БОВ) нервно-паралитического действия, в качестве пестицидов в сельском хозяйстве, а также в качестве бытовых инсектицидов [М.A.Gallo, N.J.Lawryk, Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA 1991; Somani, S.M., Solana, R.P., Dube, S.N., Chemical warfare agents. San Diego: Academic Press, 1992, p.67-123; Вредные вещества в промышленности. Справочник; Изд. 7-е. В трех томах. Т.III. Неорганические и элементоорганические соединения. Под ред. Н.В.Лазарева, И.Д.Гадаскиной: Л.: Химия, 1977, 608 с.]. Ежегодное применение ФОС в больших количествах (десятки и сотни тысяч тонн в год - в зависимости от страны мира) для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС приводят к накоплению этих веществ в почвах, грунтовых и речных водах, в различных сельскохозяйственных продуктах, продуктах переработки сельскохозяйственного сырья, индустриальных отходах и домашней пыли [Fukushima М., Yamaguchi Y., Evalution of the status of industrial chemical pollution (triesters of organophosphorous compounds).// Biochemistry, 1994, V. 23, p.74-76]. Токсичное воздействие ФОС на живые организмы может быть острым или кумулятивным, проявляющимся в различного рода расстройствах нервной системы, вплоть до появления нервно-паралитического эффекта [Gallo M.A., Lawryk N.J., Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA, 1991]. ФОС также являются сильными мутагенами, вызывающими появление множественных хромосомных аберраций [Краснюк Е.П., Лубянова И.П., Профессиональные заболевания работников сельского хозяйства.// Ред. Кундиев Ю.И., Краснюк Е.П.. Киев: Здоровье, 1989, с.38-50]. При проведении мероприятий, связанных с хранением, транспортировкой и уничтожением ФОС, являющихся БОВ, требуются соответствующие средства защиты персонала. В случае аварийной ситуации в качестве средств детоксикации ФОС используются химические составы (например, состав на основе гипохлорита, а также состав DS2, представляющий собой смесь диэтилентриамина, этиленгликоля и натриевой щелочи, и др.), являющиеся коррозионными для оборудования и токсичными для человека и окружающей среды. Безопасные средства и неагрессивные для человека, технических устройств, окружающей среды способы элиминирования угрозы любых контактов с ФОС представляют собой большой практический интерес.

Органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, параоксоназа, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) - фермент, катализирующий гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты. Фермент в разной степени способен катализировать гидролиз Р-O, P-F и P-S связей в триэфирах фосфорной кислоты [Ефременко Е.Н., Сергеева B.C. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов.// Известия АН Сер. Хим., 2001, с.1743-1749]. Скорости ферментативного гидролиза ряда ФОС на 1-2 порядка выше, чем химического. Большой интерес к ферментативному способу гидролиза ФОС в "мягких" условиях и возможности создания на его основе новых препаратов для детоксикации ФОС очевиден.

Растворимая форма ОРН подвержена влиянию многих факторов, приводящих к необратимой инактивации фермента, и вследствие этого является нестабильной. Для получения стабильной формы ОРН, способной осуществлять гидролиз ФОС, проводят ее иммобилизацию различными способами.

Одной из главных характеристик любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованного фермента является максимальное количество белка, которое может быть иммобилизовано на единице носителя (на 1 г, мл, см² , см³).

Основной характеристикой любого биокатализатора, полученного на основе иммобилизованного фермента, является каталитическая активность, локализованная на единице носителя (на 1 г, мл, см², см³).

За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25°С и рН 9,0. Сравнение ферментативной активности разных биокатализаторов проводится по параоксону как самому широко распространенному субстрату.

Каталитическая эффективность действия фермента, представляющая собой отношение максимальной скорости ферментативной реакции (V_max) к константе Михаэлиса (Km), отражающей степень сродства субстрата к ферменту, используется для сравнения каталитических свойств иммобилизованной и нативной форм фермента. Изменение величины каталитической эффективности действия фермента отражает влияние способа получения иммобилизованного фермента на его каталитические свойства.

Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.

Известен ряд способов получения биокатализаторов на основе высокоочищенной ОРН, ковалентно иммобилизованной на частицах силикагеля, предназначенных для использования в качестве составной части биосенсорных систем [Simonian A.L., diSioudi B.D., Wild J.R., An enzyme based biosensor for the direct determination of diisopropyl fluorophosphates. //Analytica Chimica Acta, 1999, V.389, p.189-196; Singh A.K., Flounders A.W, Volponi J.V., Ashley C.S, Wally K., Schoeniger J.S, Development of sensors for direct detection of organophosphates. Part I: immobilization, characterization and stabilization of acetylcholinesterase and organophosphate hydrolase on silica supports. Biosensors & Bioelectronics, 1999, 14, 703-713]. Согласно этим способам первоначально проводят химическую активацию носителя сшивающим агентом (10%-ным глутаровым альдегидом в течение 1-2 ч), далее для иммобилизации фермента носитель приводят в контакт с раствором белка (в течение 12 ч). Полученные гранулы с иммобилизованным ферментом промывают 100 мМ глициновым буфером (в течение 0,5 ч) для блокирования не прореагировавших альдегидных остатков, а затем фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твина-20 и 0,5 М хлорид натрия, для удаления белка, не специфически сорбировавшегося на носителе (в течение 0,5 ч). Общее время получения биокатализатора составляет 14-15 ч. В соответствии с данными, представленными авторами, максимальная активность частиц биокатализатора составляет не более 9,0 ед/г силикагеля, а общее количество нанесенного белка составляет не более 30 мг белка/г биокатализатора.

Большая продолжительность процесса иммобилизации, низкая активность биокатализаторов и механическая прочность легко разрушаемого носителя являются существенными недостатками способа получения биокатализаторов и самих биокатализаторов, применение которых возможно только в биосенсорных системах для гидролиза ФОС в жидкой среде.

Согласно другому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН поверхность гранул (70-400 мкм в диаметре) пористого стекла этерефицируют (в течение 2-3 ч) с последующей обработкой гидразином и азотистой кислотой (в течение 1-1,5 ч) с целью получения азидных групп на поверхности стекла, далее проводят иммобилизацию белка (в течение 0,5 ч). [Munnecke D., Properties of an immobilized pesticide-hydrolasing enzyme. //Appl. Environ. Microbiol., 1977, p.503-507]. Общее время получения биокатализатора составляет 3,5-5 ч. Способ позволяет вводить до 190 мкг белка на 1 г носителя, при этом активность гранул составляет 0,035-0,15 ед/г стекла.

Основным недостатком способа является крайне низкое количество иммобилизованного белка и, как следствие, очень низкая активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Способ получения биокатализатора на основе высокоочищенной ОРН, иммобилизованной на поверхности гранул (0,8-1,0 мм в диаметре) криогеля поливинилового спирта (ПВС) [Efremenko E., Lozinsky V., Sergeeva V., Kazankov G., Gladilin A., Addition of Polybrene improves stability of organophosphate hydrolase immobilized in poly(vinyl alcohol) cryogel carrier. //J.Biochem. Biophys. Methods, 2002, V.51, p.195-201], также предполагает модификацию поверхности носителя 7%-ным раствором глутарового альдегида (в течение 1 ч) с последующей экспозицией носителя с раствором фермента (в течение 5 ч) в присутствии полиэлектролита (полибрена), взятого в соотношении 20:1 по отношению к ферменту (масс.). Далее проводят удаление свободных альдегидных групп на носителе, выдерживая его в течение 2 ч в 100 мМ Трис-буфере. Общее время получения биокатализатора составляет 8 ч. Способ позволяет вводить до 8,8 мг белка на 1 г влажного геля. Каталитическая эффективность действия фермента снижается на 50-66% в результате иммобилизации.

Существенными недостатками способа получения биокатализатора являются: необходимость использования больших количеств дорогостоящего полиэлектролита (полибрена) для получения активного биокатализатора с иммобилизованным ферментом, стабилизированным полиэлектролитным комплексом, и достаточно низкие концентрации белка, вводимые в носитель и определяющие конечную активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Известен способ получения биокатализатора на основе нейлона, содержащего иммобилизованную ОРН [Caldwell, S.R., Raushel, F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.ll Appl. Biochem. Blotechnol., 1991, V.37, p.59-72]. Способ позволяет получать биокатализатор в форме трубки, мембраны или в виде мелкодисперсного порошка с поверхностью, содержащей иммобилизованный белок. Для иммобилизации частично очищенного фермента проводят активацию поверхности носителя, которую обрабатывают 12,5% раствором глутарового альдегида при 4°С в течение 2 ч, далее носитель выдерживают в контакте с раствором фермента при 4°С в течение 2 ч и промывают 0,1 М раствором бората натрия. Биокатализатор, выполненный в виде трубки, мембраны и порошка, имеет активность соответственно 72 ед/см³, 12,6 ед/см² и 360 ед/г носителя. Общее время получения биокатализатора составляет 4 ч. Каталитическая эффективность действия фермента снижается в 160 раз в результате иммобилизации по сравнению с растворимой формой.

Необходимость проведения всего процесса иммобилизации фермента при низкотемпературных условиях и значительные потери активности ферментом в результате его иммобилизации являются явными недостатками способа получения биокатализатора и самого биокатализатора.

Известен способ получения биокатализатора на основе очищенной ОРН методом физической адсорбции на тритил-агарозе, содержащей до 65 мкмоль тритиловых групп на 1 мг агарозы [Caldwell S.R., Raushel F.M., Detoxification of Organophosphate Pesticides Using an Immobilized Phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.// Biotechnol. Bioeng., 1991, V.37, p.103-109]. Для иммобилизации раствор фермента смешивают с тритил-агарозой и оставляют в контакте при постоянном перемешивании в течение 10 мин. Далее биокатализатор отмывают 125 мМ раствором CHES буфера от белка, не сорбировавшегося на носителе. Общее время получения биокатализатора составляет 10-20 мин. Получаемый биокатализатор содержит не более 1,84 мг белка на 1 мл агарозы и имеет активность от 140 до 4600 ед/мл тритил-агарозы.

Одним из недостатков данного биокатализатора является краткосрочность его возможного использования, а именно не более 2 ч в проточной системе при скорости протока до 45 мл/ч, способ предполагает проведение повторной иммобилизации новой порции фермента на том же носителе. Высокий расход фермента для регенерации и получения активного биокатализатора, а также достаточно высокая стоимость тритил-агарозы являются экономическими ограничениями этого способа получения биокатализатора. Большим недостатком биокатализаторов является высокое сродство ФОС (параоксон, малатион, диизопропилфторфосфат и кумафос), являющихся субстратами для фермента, к матрице носителя, что приводит к активной их сорбции на самом носителе, вместо ферментативного гидролиза. Способ получения биокатализатора также не позволяет получить в достаточной степени стабилизированный фермент, о чем свидетельствует его быстрая инактивация под действием различных факторов, в частности, в присутствии 1% органического растворителя. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Известен способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН, предполагающий применение пенополиуретановой пены или губки в качестве носителя [Patent US 6642037, 2003; Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds, C 12 N 11/04, C 12 N 11/08, C 12 S 9/00, C 12 S 13/00]. Готовый биокатализатор может содержать набор иммобилизованных ферментов, таких как ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, органофосфатгидролаза и др. и предназначен для детоксикации ФОС. Способ получения биокатализатора заключается в приготовлении смеси (при весовом соотношении 1:1) двух фаз: водной фазы, состоящей из 1-2% раствора поверхностно-активного вещества (плюроник Р-65, Р-85 или L-62), приготовленного на основе 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), и раствора высокоочищенного фермента, смешанных между собой в соотношении 10:1 по объему, и гидрофобной фазы, представляющей собой полиуретановый преполимер Hypol TDI 3000 или Hypol Plus FHP-5000 (толил-диизоцианат). Образующуюся двухфазную систему интенсивно перемешивают (2500 об/мин), взбивая в пену в течение 0,5-1 мин, и оставляют для формирования ферментсодержащей полимерной композиции (биокатализатора) в течение 10 мин. Полученный материал тщательно промывают 50 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), высушивают (в течение 6 ч) и хранят в запаянном виде при 4°С. Общее время получения биокатализатора без учета периода сушки составляет 20-25 мин.

Авторы способа приводят в тексте патента только свойства биокатализатора, приготовленного на основе ацетил- и бутирилхолинэстеразы, данные по биокатализатору на основе ОРН в патенте отсутствуют. Анализ ряда статей тех же авторов, частично раскрывающих способ получения и свойства биокатализатора с иммобилизованной ОРН [LeJeune K.E., Mesiano A.J., Bower S.B., Grimsley J.K., Wild J.R., Russell A.J., Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agents degradation. //Biotechnol. Bioeng., 1997.V. 54, p.105-114; LeJeune, K.E., Wild, J.R., Russel, A.J., Nerve agents degraded by enzymatic foams. // Nature, 1998, V. 392, p.27-28; Havens P.L., Rase H.F., Reusable Immobilized Enzyme/Polyurethane Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. //Ind. Eng.Chem. Res., 1993, V.32, №10, p.2254-2258], свидетельствует о том, что в состав биокатализатора можно вводить до 5 мг белка на 1 г преполимера, при этом 1 г иммобилизованного фермента может гидролизовать 112 моль параоксона в течение 1 ч, а это значит, что активность биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН максимально может составлять 9,34 ед на 1 г преполимера.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения биокатализатора на основе ОРН, иммобилизованной в составе полимерной композиции, и по предназначению получаемого биокатализатора, принято за прототип.

Известное техническое решение имеет ряд существенных недостатков, главным из которых является получение биокатализатора с низкой концентрацией иммобилизованного белка и с низкой каталитической активностью.

Задачей предлагаемого изобретения является получение на основе иммобилизованной ОРН эффективного биокатализатора, предназначенного для удаления ФОС с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации.

Поставленная задача решается тем, что нерастворимый пористый материал вносят в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ.

Использование тканых и нетканых материалов на основе хлопка (бязь, марля, войлок и др.) в качестве нерастворимого пористого материала обусловлено тем, что они, во-первых, материалы на основе хлопка, в отличие от синтетических, обладают высокой сорбционной емкостью и могут легко удерживать большие объемы гидрофильных жидкостей. Во-вторых, эти материалы производятся в больших объемах текстильной промышленностью и, следовательно, потенциальное производство биокатализатора на основе таких носителей может легко масштабироваться с использованием оборудования текстильных предприятий.

Использование аминополисахаридов при получении биокатализатора обусловлено их способностью при химическом взаимодействии с бифункциональными сшивающими агентами образовывать прочные пористые гели, обладающие биосовместимостью, высокой прочностью, пластичностью, большой гигроскопичностью и биодеградируемостью [Г.А.Вихорева, И.А.Шаблыкова, Н.Р.Кильдеева Модификация хитозановых пленок глутаровым альдегидом с целью регулирования их растворимости и набухания.// Химические волокна, №3, 2001. с.42-45; Е.А.Меркович, М.-Л.Карруэт, В.Г.Бабвк, Г.А.Вихорева, Л.С.Гальбрайх, В.Е.Ким. Вискозиметрическое исследование кинетики начальной стадии гелеобразования в растворах хитозана в присутствии глутарового альдегида.// Коллоидный журнал, 2001, №3, с.383-388; Г.А.Вихорева, Н.Р.Кильдеева, М.Ю.Устинов, Ю.Н.Ночевкина. Получение хитозановых пленок и исследование их деградируемости. //Химические волокна, 2002, №6, с.29-33]. Регулярная пористая структура образующихся гелей не создает диффузионных затруднений для процессов, катализируемых ферментом.

Использование нерастворимых пористых материалов, покрытых аминополисахаридными сшитыми гелями, существенно увеличивает их сорбционную емкость, и, таким образом, повышается эффективность удаления ФОС с различных поверхностей и удержания их, а также продуктов их детоксикации, в объеме биокатализатора.

Отжим формирующейся ферментсодержащей композиции применяется для удаления непрореагировавших компонентов реакционной системы.

Раствор боргидрида натрия применяется для восстановления образовавшихся азометиновых связей, что способствует химической стабильности и инертности структуры биокатализатора и, таким образом, устраняется риск какого-либо негативного воздействия биокатализатора на обрабатываемые поверхности.

Введение в состав биокатализатора с высокой влажностью (выше 50%) антимикробных веществ, применение которых допустимо, в том числе и в детской косметологии, создает благоприятные условия для длительного хранения биокатализатора в герметичном виде при отсутствии порчи готовой продукции и в состоянии полной готовности к применению, способствует предотвращению какой-либо угрозы возникновения у потребителей заболеваний кожи, связанных с микробным заражением, вызванным, например, культурами Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris и др., а также делает потенциально безопасным применение биокатализатора потребителем без каких-либо возрастных ограничений.

Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН осуществляется следующим образом: нерастворимый пористый носитель помещают в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ, так, что конечные концентрации компонентов в биокатализаторе составляют, мас.%: белок - до 2,5; аминополисахарид - 12,0-40,0; нерастворимый пористый носитель - 28,0-60,0; глутаровый альдегид - 0,01-0,10; антимикробные вещества - до 3,0; вода - остальное до 100%.

Общее время получения биокатализатора составляет не более 20 мин, способ позволяет получать биокатализатор, содержащий до 25,2 мг белка на 1 г биокатализатора.

Вторым объектом изобретения является биокатализатор на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации ФОС, полученный по этому способу, который имеет активность до 950 ед/г биокатализатора.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является высокая концентрация иммобилизованного белка в расчете на 1 г биокатализатора и высокая каталитическая активность биокатализатора. Непродолжительность процесса получения биокатализатора обеспечивает минимальное инактивирующее воздействие условий иммобилизации на каталитическую активность фермента. Способ получения биокатализатора значительно стабилизирует фермент и позволяет хранить препарат иммобилизованного фермента при 23°С в течение, как минимум, двух месяцев.

Биокатализатор имеет макропористую структуру, обеспечивающую высокую влагоемкость, а именно присутствие аминополисахаридных гелей в структуре биокатализатора дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному высокому (8-10-кратному) уровню влагоудержания натуральных волокнистых материалов, также используемых при получении биокатализатора. Иммобилизованный фермент сохраняет все свои каталитические характеристики, известные для нативного аналога.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (бязи) в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана как аминополисахарида и пропилпарабена как антимикробного вещества.

Тканый целлюлозный материал (бязь) (52 г) помещают в 8%-ный раствор сульфата хитозана (191 г) с одновременным внесением в тот же раствор 280 мл раствора ОРН (8 мг/мл, 250 ед/мг) и 280 мл 10%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 5,26 г пропилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 1,84, сульфат хитозана - 12,61, нерастворимый пористый носитель - 47,95, глутаровый альдегид - 0,023, антимикробное вещество - 3,0, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 18,4 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 905 ед/г биокатализатора.

Пример 2. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (марли) в качестве нерастворимого носителя и хитозана как аминополисахарида.

Тканый целлюлозный материал (марлю) (30,5 г) помещают в 2%-ный раствор хитозана (376 г) с одновременным внесением в тот же раствор 80 мл раствора ОРН (20 мг/мл, 190 ед/мг) и 160 мл 20%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее обработку раствором боргидрида натрия так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,36, хитозан - 13,52, нерастворимый носитель - 60,04, глутаровый альдегид - 0,051, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 23,6 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 650 ед/г биокатализатора.

Пример 3. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании войлока в качестве нерастворимого носителя, карбоксиметил хитозана как аминополисахарида и катона CG как антимикробного вещества.

Войлок (16 г) помещают в 3%-ный раствор карбоксиметил хитозана (275 г) с одновременным внесением в тот же раствор 25 мл раствора ОРН (4 мг/мл, 400 ед/мг) и 85 мл 5%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку раствором боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 2,5 г катона CG, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 0,17, карбоксиметил хитозан - 20,7, нерастворимый носитель - 44,78, глутаровый альдегид - 0,011, антимикробное вещество - 2,24, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 17 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 475 ед/г биокатализатора.

Пример 4. Получение биокатализатора при использовании для иммобилизации ОРН нетканого целлюлозного материала в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и хлорида бензетония в качестве антимикробного вещества.

Нетканый целлюлозный материал (15,5 г) помещают в 5%-ный раствор сульфата хитозана (480 г) с одновременным внесением в тот же раствор 50 мл раствора ОРН (32 мг/мл, 200 ед/мг) и 160 мл 50%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 3,0 г хлорида бензетония, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,52, сульфат хитозана - 40,36, нерастворимый пористый носитель - 27,88, глутаровый альдегид - 0,108, антимикробное вещество - 1,08, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 25,2 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 880 ед/г биокатализатора.

Пример 5. Получение биокатализатора при использовании льна в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и метилпарабена в качестве антимикробного вещества.

Тканый целлюлозный материал (лен) (25 г) помещают в 9%-ный раствор сульфата хитозана (185 г) с одновременным внесением в тот же раствор 45 мл раствора гексагистидиновой ОРН (26 мг/мл, 180 ед/мг) и 165 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 1,3 г метилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,25, сульфат хитозана - 26,36, нерастворимый пористый носитель - 48,18, глутаровый альдегид - 0,053, антимикробное вещество - 1,35, вода - остальное до 100%. Общее время получения составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 22,5 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 950 ед/г биокатализатора.

Пример 6. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.

Биокатализатор, полученный, как описано в Примере 1, имеет активность, равную 905 ед/г, и каталитические характеристики (константу Михаэлиса, V_max, каталитическую эффективность действия фермента), представленные в таблице (таблица приведена в конце описания).

На Фиг.1 представлены рН-зависимости каталитической активности биокатализатора и растворимого фермента. Снижение каталитической эффективности действия иммобилизованного фермента по отношению к растворимому не более чем в 3 раза свидетельствует о том, что биокатализатор способен осуществлять, как и растворимый фермент, высокоэффективный гидролиз различных ФОС.

На Фиг.2 и 3 показана стабильность при хранении при 4°С и 23°С соответственно биокатализаторов, полученных с введением в их состав антимикробных веществ, как описано в Примерах 1, 2, 4 и 5.

На Фиг.4 и 5 приведены электронные микрофотографии биокатализаторов, полученных, как описано в Примерах 1 и 4 соответственно. На Фиг.6-8 приведены электронные микрофотографии аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов, согласно Примерам 1, 4 и 5 соответственно, которые подтверждают наличие у них макропористой структуры, не создающей диффузионных затруднений для процессов, катализируемых иммобилизованным ферментом.

На Фиг.9 приведены данные по способности аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов согласно Примерам 1 и 4, сорбировать влагу. Наличие в составе биокатализатора аминополисахаридного геля дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному (8-10-кратному) уровню сорбционной способности натуральных волокнистых материалов, используемых при получении предлагаемого биокатализатора с его исходной 50-60% влажностью.

Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом обладает рядом преимуществ:

- Способ получения биокатализатора позволяет увеличить удельную концентрацию иммобилизованного белка на единице носителя (мг/г) в 3,4-5 раз (Примеры 1, 2, 4, 5);

- Биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, имеет каталитическую активность в 36,5-73 раза выше по сравнению с прототипом (Примеры 1-5);

- Применение разнообразных тканых и нетканых материалов (бязь, марля, войлок и др.) (Примеры 1-5) в качестве нерастворимого пористого носителя позволяет варьировать геометрические размеры и формы биокатализатора и, таким образом, существенно расширяет возможность применения биокатализатора;

- Введение антимикробных веществ в состав биоктализатора позволяет длительно хранить его во влажном состоянии (Пример 6), не подвергая биокатализатор высушиванию, которое требуется для прототипа. Таким образом, для получения готовой формы биокатализатора не требуется проведения дополнительной достаточно длительной и дорогостоящей технологической стадии, как сушка;

- Биокатализатор, полученный на основе натуральных волокон и аминополисахаридных гелей, потенциально обладает более высокой гигроскопичностью по сравнению с синтетическим носителем (Пример 6);

- Способ получения биокатализатора в отличие от прототипа не предполагает использование ацетил- и бутирилхолинэстераз в комбинации с ОРН, что исключает необходимость проведения регенерации холинэстераз, инактивированных при взаимодействии с ФОС, после каждого рабочего цикла биокатализатора.