синтетический антиген на основе сополимеров n-винилпирролидона, кротоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола, содержащий ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена

Формула изобретения

Синтетический антиген на основе сополимеров N-винилпирролидона, кретоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола, содержащий ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена, общей формулы

где m=88,5 мол.%, n=6,8÷10,3 мол.%, l=1,2÷4,7 мол.%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунохимии высокомолекулярных соединений, обладающих антигенными характеристиками.

Изобретение может найти широкое использование при иммунологическом определении в биологических жидкостях 2-нафтиламин-белковых аддуктов, являющихся специфическими маркерами профессионального онкологического риска, образующимися у лиц, имеющих контакт с 2-нафтиламином или с веществами, содержащими его в структуре молекулы, например, с анилиновыми красителями.

Известно, что 2-нафтиламин, широко используемый на различных производствах, является сильньм органотропным канцерогеном, вызывающим у людей и собак рак мочевого пузыря, а у мышей - гепатомы (Темкин И.С. Опухоли мочевого пузыря, вызванные канцерогенными аминосоединениями. - М.: Медицина, 1957 - с.36-47). К наиболее характерным для ранних стадий химического канцерогенеза иммунометаболическим нарушениям относится образование в сыворотке крови и в ткани-мишени животных канцероген-белковых антигенов (КБА) (Коростелева Т.А. Об изменениях тканевых антигенов в процессе экспериментального канцерогенеза. - Л.: Медицина, 1966, с.247). КБА обнаруживаются на ранних стадиях канцерогенеза при действии на животных канцерогенов-орто-амино-азотолуола, бензидина, 2-нафтиламина, 3-метилдиметиламиноазобензола, 3-оксиантраниловой кислоты. КБА обнаруживаются также при онкологическом риске у лиц, контактирующих с канцерогенами (Коростелева Т.А., Белохвостова А.Т. Возможности использования иммунологических маркеров для выявления групп онкологического риска в производственных контингентах (Сборник научных трудов. - Практические и научные основы профилактики канцерогенных воздействий. - Ленинград, 1984. - c.159).

Исходный сополимер N-винилпирролидона (ВП) с кротоновой кислотой (КК), используемый для получения тройного сополимера ВП-КК-n-кротоноиламинофенол и заявленного соединения на его основе описан в литературе: С.Н.Ушаков, В.А.Кропачев, Л.Б.Трухманова, Р.И.Груз, Т.М.Маркелова, «О сополимеризации кротоновой кислоты с винилпирролидоном»//Высокомолекулярные соединения, т. IX (А), №8, с.1807-1813, 1967.

Эти факторы послужили основой для разработки иммунологического метода регистрации 2-нафтиламина как гаптена в биологических материалах в качестве маркера онкологического риска.

Описан антиген, содержащий ковалентно присоединенный к белковому носителю 2-нафтиламин в качестве гаптена (Скачков А.П. Изучение тканевых антигенов и антител на ранних стадиях канцерогенеза при действии 2-нафтиламина. Автореферат канд. дисс., Л., 1970). Этот антиген является прототипом заявляемого изобретения. Автор использовал антитела против 2-нафтиламин-антигена как реактивы для выявления 2-нафтиламина, входящего в антигенные комплексы, образующиеся в организме животных при введении им этого канцерогена. Поиски КБА приводились при помощи реакции преципитации в геле.

Недостатком известного комплексного решения, направленного на получение синтетического антигена, содержащего ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена, является необходимость использования в качестве макромолекулярных носителей белков сыворотки крови различных животных, имеющих общевидовые антигены. Иммунизация антигенами, содержащими остаток 2-нафтиламина, присоединенный к белку, неизбежно приводит к образованию побочных антител к общевидовым антигенам, что затрудняет качественную и количественную интерпретацию конечных результатов определения 2-нафтиламин-белковых антигенов, образующихся в организме. В связи с этим автор прототипа был вынужден ставить дополнительные реакции истощения общевидовых антигенов.

Техническим результатом изобретения является повышение специфичности антител против 2-нафтиламина как гаптена.

Это достигается использованием для выработки антител против 2-нафтиламина синтетического антигена, представляющего собой азопроизводные 2-нафтиламина на основе сополимера N-винилпирролидона с кротоновой кислотой и кротоноиламинофенолом общей формулы I:

где m=88,5 мол.%; n=6,8÷10,3 мол.%; l=1,2÷4,7 мол.%.

Способ получения этого антигена реализуется следующим образом:

1. Аминогруппу 2-нафтиламина диазотируют с получением хлористого 2-нафтиламиндиазония. Проводят азосочетание сополимеров N-винилпирролидона с кротоновой кислотой и n-кротоноиламинофенолом II с хлористым 2-нафтиламиндиазонием III в водном растворе при 0÷5°С сначала в кислой (рН 4,2÷4,6), а затем в щелочной (рН 9,0÷9,4) среде.

2. При этом молярные количества терполимера (в расчете на одно звено n-кротоноиламинофенола) хлористого 2-нафтиламиндиазония составляют 1:2÷2,2. Схему синтеза антигена 1 можно представить следующим образом:

Анализ известного уровня науки и техники показал отсутствие информации о тройных сополимерах общей формулы 1.

Строение терполимера 1 подтверждено методом ПМР-спектроскопии. В ПМР-спектре терполимера 1, снятого в дейтерированном диметилформамиде, в области 0,5÷5,0 м.д. сохраняются сигналы исходного тройного сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и с n-кротоноиламинофенолом (n-КАФ). В отличие от ПМР-спектра терполимера II в ПМР-спектре продукта азосочетания I обнаруживается интенсивный сигнал в области 7,9-8,5 м.д., относящийся к протонам бензольного ядра звена п-КАФ, находящихся в орто- и в мета-положениях к азогруппе. Отсутствие сигнала при 6,8-7,3 м.д. позволяет утверждать, что замещение протонов на остаток азо-2-нафтиламина произошло в двух местах бензольного кольца звена n-КАФ. Сравнение площадей пиков в области 7,4-7,8 м.д. и в области 7,9-8,5 м.д. в ПМР-спектре коньюгата I позволило определить места замещения протонов бензольного ядра звена n-КАФ на остаток азо-2-нафтиламина. Наблюдаемым в спектре пикам равной площади соответствует только замещение в положениях 2 и 6 бензольного кольца звена n-КАФ.

Для определения содержания остатков 2-нафтиламина в продукте азосочетания снимали его УФ спектр в этаноле в референции с раствором исходного сополимера II. Использовали калибровку Д₂₈₀ - С (мкг/мл), ранее установленную для 2-нафтиламина, в УФ спектре которого имеется интенсивная полоса поглощения (lg=4,2) с максимумом при 280 нм.

Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приводим примеры его конкретного выполнения.

А. Приготовление водного раствора хлористого 2-нафтиламиндиазония.

К суспензии 0,001 кг 2-нафтиламина в смеси 0,01 л дистиллированной воды и 0,003 л концентрированной соляной кислоты, охлажденной до 0°С, по каплям при перемешивании добавляют охлажденный раствор 0,58·10^-3 кг нитрита натрия в 0,01 л воды. Полученный прозрачный раствор темно-желтого цвета перемешивают при 0°С в течение 30 мин.

Б. Примеры 1-6 по синтезу антигена I.

Пример 1.

К охлажденному до 5°С раствору терполимера II (m=88,5 мол.%, n=10,3 мол.%, 1=1,2 мол.% с молекулярной массой 11.000) в 0,01 л. воды по каплям приливают при перемешивании 1,5·10^-3 л полученного раствора хлористого 2-нафтиламиндиазония, содержащего 0,06·10 ^-6 кг соли диазония, и добавлением сухого бикарбоната натрия доводят рН раствора до 4,3. Смесь перемешивают в течение 30 мин и доводят рН реакционного раствора до 9,2 с помощью 5% раствора NaOH. Азосочетание проводят при этом значении рН в течение 1 часа при 5°С и еще в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем проводят диализ полученного раствора против воды в течение 3 суток. Продукт реакции выделяют путем лиофильной сушки. Получают 1,23·10^-3 кг (79,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=10,3 мол.%, l=1,2 мол.%), содержащего 3,3 мас.% связанного 2-нафтиламина.

Проводят иммунизацию беспородных кроликов разводки Рапполовского питомника весом 1,5-2 кг 5% водным раствором полученного антигена по следующей схеме:

1. Один раз в неделю внутрикожно в 10 точек вдоль спинного хребта на расстоянии 1,5-2 см от него в обе стороны (по 5 точек с каждой стороны) вводят 1,0·10^-3 л водного раствора антигена I.

2. Через неделю повторяют внутрикожное введение антигена I в той же дозе также в 10 точек спины.

3. Через 2 недели вводят раствор антигена I под обе лопатки подкожно и внутрибрюшинно в общей дозе 1,5·10^-3 л.

4. Через 1,5 месяца вводят раствор антигена I по 0,5·10^-3 л внутривенно через день три раза в неделю. Кровь берут на 9-й день после последней инъекции. В дальнейшем кроликов реиммунизируют через 3-4 месяца, используя только внутривенное введение антигена.

На следующий день после взятия крови сыворотку отделяют от сгустка центрифугированием в течение 10 мин при 400g. Сыворотку концентрируют в 2 раза в целлофановых трубках под вентиляторами, консервируют борной кислотой и используют для постановки реакции встречной иммунодиффузии в агаре и реакции связывания комплемента (РСК).

Для постановки реакции преципитации в агаре используют 1% водный раствор агара Дифко. Для постановки РСК используют готовую гемолитическую сыворотку против эритроцитов барана и сухой комплемент. В качестве антигенов применяют водные растворы антигена I и гетерологичных азопротеинов, содержащих 2-нафтиламин, присоединенный к белкам человеческой сыворотки крови. Титрование антигенов проводят перед постановкой каждого опыта. Связывание комплемента осуществляют при объеме 0,5·10^-5 л в платах. РСК ставят на холоду при +4°С (18 часов).

Результаты испытаний иммунсыворотки приведены в таблице. В графе А указаны содержания в мол.% антигена I в последних разведениях, дающих видимую реакцию преципитации в агаре с сыворотками крови интактных (контроль) и иммунизированных антигеном I кроликов. В графе Б указаны титры антител против 2-нафтиламинга в РСК.

Пример 2.

В условиях примера I из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=9,0 мол.%, 1=2,5 мол.%) и 0,081·10^-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,74·10^-3 кг (69,2%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=9,0 мол.%, l=2,5 мол.%), содержащего 6,6 мас.% 2-нафтиламина.

По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против 2-нафтиламина приведены в таблице.

Пример 3.

В условиях примера 1 из 0,7·10^-3 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=7,6 мол.%, l=3,9 мол.%) и 0,093·10^-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,58·10^-3 кг (75,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=7,6 мол.%, l=3,9 мол.%), содержащего 9,8 мас.% 2-нафтиламина.

По схеме, описанной в примере 2, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки приведены в таблице.

Пример 4.

В условиях примера 1 из 0,8·10^-3 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=6,8 мол.%, 1=4,7 мол.%) и 0,127·10^-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,67·10^-3 кг (74,2%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=6,8 мол.%, l=4,7 мол.%), содержащего 11,5 мас.% 2-нафтиламина.

По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки приведены в таблице.

Пример 5 (контрольный).

В условиях примера 1 из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=5,7 мол.%, l=5,8 мол.%) и 0,19·10^-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,82·10 ^-3 кг (70,7%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=5,7 мол.%, 1=5,8 мол.%), содержащего 13,7 мас.% 2-нафтиламина.

Полученный антиген в воде не растворяется, поэтому иммунизацию кроликов этим антигеном не проводили.

Пример 6 (контрольный).

В условиях примера 1 из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=10,6 мол.%, l=0,5 мол.%) и 0,016·10^-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,65·10^-3 кг (64,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=10,6 мол.%, l=0,5 мол.%), содержащего 1,4 мас.% 2-нафтиламина.

По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытания полученной иммунсыворотки показали, что в ней отсутствуют антитела против 2-нафтиламина.

Как видно из данных таблицы, результаты испытаний иммунсывороток как в реакции встречной иммунодиффузии в агаре, так и в РСК, свидетельствуют о том, что при иммунизации животных антигеном I, полученным по примерам 1-4, может быть получена иммунсыворотка, содержащая антитела против 2-нафтиламина как гаптена. Наиболее высокий титр антител обнаружен в иммунсыворотке, полученной при иммунизации кроликов антигеном I по примеру 3. Для подтверждении специфичности присутствующих в ней антител против 2-нафтиламина как гаптена используют реакцию частичной идентичности путем исследования иммунсыворотки с антигеном I и гетерологичным антигеном, содержащим тот же гаптен-2-нафтиламин, но другой носитель - альбумины лошадиной сыворотки.

	Таблица
	Результаты испытаний иммунсывороток, полученных при иммунизации кроликов антигеном I.
№ примера по заявке	Антиген I
	mI, мол. %	nI, мол. %	1I мол.%	Содержание 2-нафтиламина мас.%	Результаты испытаний иммунсывороток
					При помощи метода иммунодиффузии в агаре	При помощи РСК
1	88,5	10,3	1,2	3,3	-	-
2	88,5	9,0	2,5	6,6	9,3·10-5	1:256
3	88,5	7,6	3,9	9,8	1,2·10-8	1:8192
4	88,5	6,8	4,7	11,5	11,2·10-5	1:128
5 контрольный	88,5	5,7	5,8	13,7	Не определено, так как антиген не растворим в воде
6 контрольный	88,5	10,6	0,5	1,4	Нет антител против 2-нафтиламина	Нет антител против 2-нафтиламина

На фото показаны результаты реакции частичной идентичности при взаимодействии иммунсыворотки кролика, иммунизированного антигеном I по примеру 3, содержащим 2-нафтиламин (1), с этим антигеном (2) и с гетерологичным антигеном, содержащим тот же гаптен-2-нафтиламин, но другой носитель - альбумины лошадиной сыворотки (3). Образование "шпоры", видной на фото, свидетельствует о присутствии антител против 2-нафтиламина в исследуемой иммунсыворотке кролика, дающих реакцию частичной идентичности при взаимодействии их с антигенами, содержащими один и тот же гаптен-2-нафтиламин, но различные макромолекулярные носители. Как видно на фото, взаимодействия этой иммунсыворотки с белковым носителем - альбуминами лошадиной сыворотки (4), не наблюдалось.

Иммунсыворотка, содержащая антитела против 2-нафтиламина как гаптена, полученная путем иммунизации кролика 2-нафтиламин-полимерным антигеном по примеру 3, была использована как тест-система при определении 2-нафтиламина в сыворотке крови рабочих ЛПО "Красный треугольник", у которых возможна экспозиция 2-нафтиламином. При помощи этой иммунсыворотки 2-нафтиламин-антиген был обнаружен у 5 из 43 обследованных рабочих, что составляет 11,6%. При помощи иммунсыворотки кролика, полученной путем иммунизации 2-нафтиламин-антигеном, содержащим белковый носитель (альбумины лошадиной сыворотки), 2-нафтиламин-антиген был обнаружен у 3 из 50 рабочих, что составляет 6,0%. Эти данные свидетельствуют о достижении положительного эффекта путем повышения точности определения 2-нафтиламина как гаптена в крови рабочих по сравнению с прототипом при использовании в качестве тест-системы иммунсыворотки, полученной путем иммунизации кроликов 2-нафтиламин-полимерным антигеном.

Анализ таблицы позволяет подтвердить критериальные значения заявляемых составов антигенов I:

А. Заявлено содержание звеньев n-кротоноиламинофенола в исходном терполимере II, равное 1,2÷4,7 мол.%. Снижение содержания этого звена до 0,5 мол.% (пример 6) приводит к потере положительного эффекта.

Б. Молярное соотношение n-кротоноиламинофенольных звеньев и хлористого 2-нафтиламиндиазония составляет 1:2÷2,2, что обеспечивает введение двух молекул 2-нафтиламина в бензольное кольцо указанного звена.