способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах

Формула изобретения

Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, характеризующийся тем, что осуществляют высев образцов смешанных культур на жидкие селективные питательные среды, определяют биолюминесцентным методом численность клеток, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, математически обрабатывают кинетические данные роста индивидуальных бактерий и устанавливают исходную концентрацию бактерий, относящихся к разным таксономическим группам.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, предполагающих использование селективных питательных сред роста, биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.

Естественный кругооборот углерода, азота, кислорода и многих других химических элементов требуют активного участия разных типов микроорганизмов, поэтому столь широко распространение смешанных популяций микроорганизмов в природе - они встречаются в воздухе, почве, водоемах, являются естественной микрофлорой высших организмов. Смешанные культуры находят широкое применение в пищевой промышленности (в молочной - производство кисломолочных продуктов, сыроделие и др.; в мясной - производство колбасных заквасок, а также в виноделии и пивоварении). Смешанные культуры применяются во многих природоохранных и биотехнологичсеких процессах (биологическая очистка сточных вод, биоремедиация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, получение метана из отходов сельского хозяйства и др.).

Дифференцированное определение микроорганизмов в смешанных культурах необходимо для изучения биологической активности данной биосистемы в целом и вклада каждого вида бактерий в общий процесс функционирования смешанных культур. Информация, полученная при дифференцированном анализе проб смешанных культур, может быть использована не только для изучения и повышения эффективности биотехнологических процессов, но и для детекции и предотвращения развития нежелательных процессов с участием смешанных культур, в частности различных заболеваний и процессов порчи готовой продукции (биокоррозии, гниения и др.).

Существует ряд методов, основанных на дифференцированной количественной идентификации одного вида клеток, присутствующих в популяции смешанных культур. Большинство этих методов предполагает применение классического микробиологического способа определения численности клеток, согласно которому производят посев анализируемых проб в жидкую или твердую агаризованную питательную среду и инкубируют в течение длительного времени [Под ред. Звягинцева Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во. Моск. ун-та, 1991, с.59-63]. Далее в жидкой питательной среде количество выросших клеток микроорганизмов оценивают спектрофотометрически по поглощению клеточной суспензии при длине волны 520-560 нм или нефелометрически по мутности клеточной суспензии, используя калибровочные графики. На твердой питательной среде определяют количество колониеобразующих единиц. При этом для дифференцированного определения целевой культуры используются селективные среды роста.

Так, известен способ выделения и количественного определения бифидобактерий из смешанных культур [Пат. РФ №2154105 (2000) C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов]. Способ предусматривает посев исследуемых проб в питательную селективную среду для выделения бифидобактерий. Посевы культивируют в термостате и производят подсчет числа колоний бифидобактерий в исследуемом биоматериале. В качестве селективных компонентов (агентов) питательной среды используют азид натрия и литий пропионовокислый, которые одновременно вносят в среду в количестве, соответственно, 120-150 мг и 20-30 мл на 1 л питательной среды.

Также известен способ определения концентрации сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в пробах, взятых из биокоррозионных объектов [V.P.Kholodenko, S.K.Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines. //Appl. Biochem. Microbiol, 2000, V.36, p.685-693]. Для определения концентрации СРБ используют модифицированную среду Постгейта. Стерильные среды разливают в пробирки по 9 мл и засевают по общепринятому методу предельных разведений. Культивирование проводят в течение 7-10 суток при 28°С. О присутствии жизнеспособных СРБ судят по образованию черного осадка сульфида железа. Определяя номер разведения, в котором уже не наблюдается сульфатредукция, дают количественную оценку концентрации СРБ в исходном образце.

Микробиологические способы определения численности клеток методом посева предельных разведении и комбинированные с ними методы достаточно универсальны, могут быть использованы при работе с разнообразными типами клеток, но имеют ряд существенных недостатков:

а) Методы требуют больших затрат времени, длительность инкубации определяется тем уровнем концентраций клеток, который допустим для данного объекта. Если допустимый порог концентраций составляет, например, 10⁴-10⁵ клеток/мл, то инкубация продолжается 24-72 ч. Если же предстоит анализ образца с очень низким содержанием клеток (около 1-10 клеток на 100 мл), то инкубация может продолжаться до 14-21 суток.

б) Успех проведения анализа во многом определяется квалификацией персонала, занятого подготовкой образцов и интерпретацией результатов анализа. Результаты анализа, полученные разными людьми, часто существенно отличаются друг от друга. Статистическая ошибка самого метода определения составляет 10%.

в) Прямой подсчет количества клеток микроорганизмов мало применим для непрозрачных образцов, содержащих малорастворимые химические соединения, что тоже ограничивает практическое применение метода и требует проведения предварительной пробоподготовки аналогичных образцов.

г) Микробиологические методы отличаются достаточно большой погрешностью и требуют постановки ряда параллельных экспериментов, которые делают метод еще более трудоемким и повышают стоимость анализа.

д) Так как определение концентрации клеток в образце основывается на прямом подсчете колониеобразующих единиц, выросших на агаризованных средах, то оно может быть ошибочным ввиду того, что не все жизнеспособные микробные клетки в принципе могут образовывать колонии на твердой питательной среде, а также отсутствие роста может быть результатом их определенного физиологического и метаболического состояния [Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. Москва, 2001, с.71-74].

Другая группа дифференцированных методов определения численности клеток предполагает идентификацию специфической ферментативной активности, характерной для определенного типа бактерий.

Способ количественного определения и дифференциации колиформных бактерий и клеток E.coli [US Pat. 5393662 (1995), C 12 Q 1/10, C 12 Q 1/04, Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria] позволяет количественно определять все колиформные клетки, имеющие бета-галактозидазную активность, но не имеющие бета-глюкуронидазную активности, а затем проводить определение клеток E.coli, дополнительно имеющих бета-глюкуронидазную активность. Для этого используются хромогенные субстраты, которые образуют нерастворимый осадок одного цвета, взаимодействуя с бета-галактозидазой, и осадок другого цвета, контрастирующий с первым, взаимодействуя с бета-глюкуронидазой.

Основным недостатком этого метода является то, что он не является полностью количественным, так как клетки с бета-галактозидазной активностью определяют косвенным путем, вычитая из общего числа всех колиформ те, что имеют бета-глюкуронидазную активность, а также применим только для одного типа бактерий. К тому же концентрация фермента, как и его активность в клетках, может варьироваться в зависимости от разных факторов, что также может сильно влиять на адекватное определение численности клеток по ферментативной активности.

Существует также дифференцированный метод определения численности клеток бактерий, основанный на особенностях строения бактериальной клеточной стенки. Этот метод позволяет осуществить дифференциацию грамположительных и грамотрицательных клеток.

Так, известен способ дифференцированного определения грамположительных и грамотрицательных бактерий в жидких средах, содержащих смешанные культуры, с помощью устойчивого окрашивания клеток специфическим составом [US Pat. 5081017 (1992), C 12 Q 1/24, С 12 М 1/34, Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria]. Способ предполагает нанесение образца, содержащего клетки, на отрицательно заряженный фильтр. Далее клетки обрабатывают реактивом с кислым значением рН, изменяющим электростатический заряд клеток и обеспечивающий, таким образом, их адсорбцию на целлюлозном фильтре, затем клетки окрашивают специальным составом при рН 8-12 (карбонатно-боратный буфер) и смывают несвязавшийся краситель. Интенсивность окраски поверхности фильтра в центре коррелирует с численностью клеток. Для определения точного количества бактериальных клеток используются пять окрашенных фильтров с известной концентрацией бактерий в качестве стандартных цветовых индикаторов, предполагающих следующие цвета: белый (нулевой контроль), светло-розовый (5×10 ⁴ клеток/мл), розовый (10⁵ клеток/мл), красный (10⁶ клеток/мл) и темно-красный (10⁷ клеток/мл).

Несмотря на эффективность и экспрессность, этот метод, очевидно, имеет ряд недостатков, главным из которых является его большая неточность (возможная минимальная концентрация клеток для определения - 5·10⁴ клеток/мл), основанная на визуальной оценке полученных результатов, и возможность определения всего пяти концентраций бактериальных клеток.

Методы, основанные на особенностях строения клеточной стенки, позволяют дифференцировать бактерии, принадлежащие двум большим группам, но не определять их более подробную таксономическую принадлежность.

Известен высокочувствительный универсальный способ дифференцированного определения микроорганизмов в смешанных культурах, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ предусматривает экстракцию ДНК из клеток с последующим проведением ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Процедура ПЦР состоит в следующем [Б.Глик, Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология - принципы и применения. М.: Мир, 2002, с.94-103]. Денатурируют экстрагированную ДНК, отжигают одноцепочечные молекулы с праймерами, добавленными в избытке, и осуществляют синтез ДНК in vitro. Затем опять проводят денатурацию, отжиг с праймерами и синтез и т.д. до, примерно, 30-го раунда. К этому времени в реакционной смеси преобладают фрагменты, на одном конце которых находится одна праймерная последовательность, а на другом - последовательность комплементарная второму праймеру. Все реакции проводят в пробирках, помещенных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл обычно длится 3-5 мин.

Существуют различные модифицированные варианты данного метода для разных бактерий, в частности бактерий, окисляющих ароматические полициклические углеводороды нефти [Р.Padmanabhan, R.Shanker and P.Khanna, A method for extraction of DNA and PCR-based detection of polycyclic hydrocarbon-degrading bacteria in soil contaminated with oil and grease. //World J.Microbiol. & Biotech., 1998, V.14, 925-926], бактерий Lactobacillus brevis [T.Guameri, L.Rosetti and G.Giraffa, Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.33, p.377-381], сульфатредуцирующих бактерий [Y.Tanaka, M.Sogabe, K.Okumura and R.Kurane, A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. //Lett. Appl. Microbiol., 2002, V.35, p.242-246] и стрептококков [Т.Igarashi, Y.Yano, A.Yamamoto, R. Sasa, Identification of Streptococcus salivaris by PCR and DNA probe. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.32, p.394-397]. Варианты метода, предназначенные для различных бактерий, отличаются, соответственно, объектом экстракции ДНК, применяемыми регентами для экстракции ДНК и используемыми праймерами в ПЦР.

Способ определения бактерий экстракцией ДНК, с последующим проведением ПЦР реакции, высокочувствительный, дифференцированный и универсальный, но имеет ряд недостатков:

а) Способ слишком трудоемкий, требует несколько стадий для экстракции и очистки ДНК.

б) Способ длительный и требует высокой подготовки персонала. В зависимости от объекта исследования бактерий процесс пробоподготовки для ПЦР может длиться до 6 ч, а общее время эксперимента составляет 9-11 ч.

в) Способ используется для дифференцированного определения бактерий, но не является количественным.

г) Реагенты, используемые в экстракции ДНК, и компоненты, составляющие объект экстракции, могут сильно ингибировать ПЦР амплификации, что требует проведение ряда повторных ПЦР амплификаций.

д) Использование различных реагентов, высокоэффективных приборов и праймеров для ПЦР, повышает стоимость анализа.

е) ПЦР является высокочувствительным методом, поэтому при наличии ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.

Существуют способы дифференцированного определения бактерий с помощью иммунологических методов, в частности применения антител, высокоспецифичных по отношению к бактериям определенного типа. Так, известен способ селективного определения общего количества анаэробных бактериальных клеток B.vulgatus и B.distasonis, присутствующих в фекальной системе человека [G.Corthier, M.C.Muller, R.L'Haridon, Selective enumeration of Bacteroides vulgatus and B.distasonis organisms in the predominant human fecal flora by using monoclonal antibodies.// Appl. Environ. Microbiol, 1996, V.62, p.735-738]. Способ основан на использовании моноклональных антител к этим клеткам, которые не реагируют с другими клетками рода Bacteroides. Согласно способу, пробы фекальной системы инкубируют в питательной среде (мясопептонный агар) в течение 3 суток при 37°С, далее клетки приводят в контакт с моноклональными антителами. Клетки, реагирующие с антителами, окрашиваются в голубой цвет, что позволяет селективно вести их подсчет на отпечатках, снятых с поверхности чашек Петри с помощью специальных фильтров. Метод позволяет определять клетки, присутствующие в образце в концентрации 10³ -10⁹ кл/г фекалий. Общая длительность анализа составляет 4-5 суток.

Способы дифференцированного определения численности клеток с помощью иммунологических методов, в том числе и рассмотренный, имеют несколько существенных недостатков, главным из которых является неуниверсальность этих способов и необходимость предварительного получения высоко специфичных моноклональных антител для каждого определяемого типа бактерий, что делает сами методы очень дорогими, а область их возможного применения очень узкой.

Известен метод дифференцированного определения численности микробных клеток в септической крови в присутствии соматических клеток, основанный на определении АТФ биолюминесцентным методом [В.Г.Фрунджян, Л.Ю.Бровко, М.А.Карабасова, Н.Н.Угарова, Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувствительности микробных клеток в септической крови. // Прикл. Биохим. Микробиол., 1997, Т.33, №4, с.455-460]. Согласно методу, дифференцируют бактериальный и немикробный (свободный и соматический) АТФ путем обработки образцов 0,1 М раствором перийодата натрия в 5% Тритоне Х-100, в результате которой свободный и находящийся в соматичеких клетках АТФ разрушается. АТФ из бактериальных клеток экстрагируют диметилсульфоксидом (ДМСО). Обе операции проводят последовательно со строгим соблюдением временного регламента.

Согласно методу, первоначально из образца крови, содержащего клетки бактерий E.coli, удаляют немикробный АТФ. С этой целью проводят гемолиз, а именно кровь разбавляют в 25 раз водой и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем восстанавливают осмомолярность, добавляя в равный объем среды удвоенную концентрацию компонентов LB-среды (Serva, Германия). Далее проводят культивирование пробы на качалке при 37°С в течение 5 часов, отбирают аликвоту (0,1 мл), добавляют к ней 0,01 мл 10 мМ раствора NaIO₄ в 0,5%-ном Тритоне Х-100, встряхивают в течение 1 мин, затем вносят 0,9 мл ДМСО. В полученном экстракте биолюминесцентным методом определяют концентрацию АТФ. По калибровочным зависимостям определяют концентрацию клеток в среде de facto. Общее время эксперимента составляет 6-7 часов.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого подхода к дифференцированному количественному определению численности клеток в образце, содержащем бактериальные клетки, принято в качестве прототипа.

Несмотря на высокую точность метода, прототип не позволяет дифференцировать разные виды бактерий, присутствующие в смеси, а только определять общую численность бактерий в присутствии соматических клеток. При этом численность бактерий, определяемая, согласно прототипу, в среде для подращивания клеток, отражает количество клеток, фактически выросших в среде, и позволяет весьма условно судить об исходной концентрации клеток в образце, а не количественно определять ее.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа дифференцированного определения численности бактерий разных таксономических групп в смешанных культурах.

Поставленная задача решается тем, что применяется определенная последовательность действий, предусматривающая высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды, определение численности клеток биолюминесцентным методом, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, с последующей математической обработкой кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.

Предлагаемый способ сочетает в себе микробиологические приемы работы с клетками при использовании селективных сред роста, биолюминесцентный метод анализа АТФ, позволяющий достоверно оценить численность клеток в образцах, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.

Применение селективных сред, предназначенных для роста клеток одной определенной таксономической группы, позволяет осуществлять культивирование и дифференциацию целевых видов бактерий.

Применение биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ для определения численности клеток обеспечивает экспрессность и высокую точность определения, что существенно сокращает время дифференцированного количественного анализа.

Экспериментальные данные биолюминесцентного исследования линеаризуются математическими методами с целью определения начальной концентрации отдельных видов клеток в смешанной культуре.

Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах включает следующие стадии.

- Высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды.

Это проводится известными приемами, а именно готовят стерильные селективные питательные среды роста определенного состава, необходимого для роста бактерий, численность которых необходимо определить в смешанных культурах. Далее в каждую емкость со средой инокулируют аликвоту жидкого образца исследуемой смешанной культуры.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом.

Это осуществляется путем проведения культивирования клеток в условиях (например, температура, аэрация среды, наличие анаэробных условий и др.), которые зависят от специфических характеристик роста клеток, принадлежащих к определяемой группе бактерий, и являются оптимальными. В процессе роста клеток производят отбор проб культуральной жидкости, начиная с момента инокуляции анализируемых проб. Культивирование клеток осуществляют до достижения ими конца логарифмической фазы роста. Для экстракции внутриклеточного АТФ из клеток, присутствующих в пробах, используется экстрагирующий агент. Определение концентрации АТФ проводят с применением препарата иммобилизованной люциферазы светляков.

- Математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.

По данным биолюминесцентного анализа строят кинетические кривые роста клеток бактерий, дифференцированных при их культивировании в разных селективных средах. Для определения начальной концентрации каждого вида в смешанной культуре проводят линеаризацию кинетических кривых роста математическими методами анализа [Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология - кинетические основы микробиологических процессов. - М.: Изд-во "Выс. школа", 1990, стр.52-78]. Полученные линеаризованные кинетические кривые роста экстраполируют до начального момента клеточного роста и далее рассчитывают концентрацию бактерий каждой таксономической группы в исследуемой смешанной культуре.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание последовательно выполняемых действий и применяемых методов анализа (а именно микробиологического, биолюминесцентного и математического, т.е. культивирование аликвот смешанной культуры в селективных средах, количественный биолюминесцентный анализ концентраций внутриклеточного АТФ, построение кинетических кривых роста и последующая математическая обработка данных) для дифференцированного количественного определения бактерий разных таксономических групп, присутствующих исходно в одном образце в смеси, которое ранее не было известно.

Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемый способ.

Пример 1. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

В составе сточных вод нефтедобывающей промышленности присутствуют бактерии - представители разных таксономических групп, в частности гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [V.P. Kholodenko, S.K. Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines.// Appl. Biochem.Microbiol, 2000, V.36, p.685-693].

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем суспендирования в физиологическом растворе клеток Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans, являющихся представителями указанных выше групп бактерий, так, чтобы их конечные концентрации в смеси были (1,6±0,6)×10 ⁶, 10⁶ и 10⁴ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл) следующего состава:

Среда №1 (г/л): пептон - 10,0; глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 11,0; Nacl - 5,0; агар - 15,0; рН 6,8-7,0.

Среда №2 (г/л): лактат - 4,0; дрожжевой экстракт - 1,0; аскорбиновая кислота - 0,1; MgSO₄×7H ₂О - 0,2; К₂НРО₄ - 0,01; Fe(SO ₄)₂(NH₄)₂×6H ₂О - 0,2; NaCl - 10,0; рН 6,8-7,0.

Среда №3 (г/л): KCl - 0,1; К₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ ×7H₂O - 0,5; Са(NO₃)₂ - 0,01; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ ×6H₂O - 63,0; H₂SO₄ (10 M) - 1 мл, рН 2,7-3,5.

Для роста клеток Ps.putida и Ac. ferrooxidans инокулированные Среды №1 и №3, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.

Через 11 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 12 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают в жидкие питательные Среды №2, 3 и 4 (по 4, 5 мл). Среда №4 имеет тот же состав, что и Среда №1, но без агара. Культивирование образцов на Средах №3 и 4 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 86 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток одного типа бактерий, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом.

В процессе культивирования образцов на разных селективных средах периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для определения в них общей концентрации АТФ. Для этого к взятой пробе добавляют 0,9 мл ДМСО, затем в полученный раствор (50 мкл) добавляют люциферин-люциферазный реагент (50 мкл), содержащий иммобилизованную люциферазу светляков, D-люциферин, соли магния, стабилизаторы и компоненты буферного раствора, и измеряют интенсивность биолюминесценции с помощью биолюминометра. Время анализа составляет 1 мин. Определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят при использовании известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке. Данный параметр является постоянным на протяжении всего жизненного цикла клетки и имеет строго определенную величину, характерную для каждого типа клеток. Например, для клеток Ps. putida, D. vulgaris и Ac.ferrooxidans величина удельной концентрации АТФ составляет, соответственно, (1,0±0,1)×10^-16 , (5,2±0,3)×10^-18 и (2,7±0,4)×10 ^-16 моль/кл.

- Математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.

По данным, полученным в результате измерения общей концентрации АТФ в образцах и пересчитанным на концентрацию клеток, соответствующую определенному времени культивирования, строят кинетическую кривую роста клеток. Далее проводят линеаризацию экспоненциальных фаз кривых роста смешанных клеток на селективных средах, рассчитывая натуральный логарифм полученных концентраций клеток. Точка пересечения прямой, проведенной через полученные точки на графике в полулогарифмических координатах, определяет исходную концентрацию клеток строго определенного типа бактерий, исходно присутствовавших в смеси. Далее учитывают все разведения исходной пробы и получают исходную концентрацию каждой индивидуальной культуры в смеси. Фиг.1 (а, б, с) иллюстрирует типичные результаты линеаризации экспоненциальных фаз роста клеток на селективных средах. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.

Пример 2. Дифференцированное определение, численности бактерий в модельной смешанной культуре.

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток (Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans), что и в Примере 1. Их конечные концентрации в смеси составляют (4,3±0,6)×10 ⁶, 10⁵ и 10³ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в смесях определяют микробиологическим методом так же, как в Примере 1. Общее время анализа составляет 12 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу проводят так же, как и в Примере 1.

Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.

Пример 3. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток что и в Примере 1, а именно Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris, но вместо Acidithiobacillus ferrooxidans вводят клетки Rhodococcus erythropolis, широко распрастраненные в почве и способные осуществлять высокоэффективную биодеградацию углеводородов нефти [Т.В.Коронелли, Е.Д.Нестерова, Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат.// Микробиол., 1990, Т.59, с.993-997]. Их конечные концентрации в смеси составляют (1,3±0,6)×10², 10 ⁴ и 10³ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средой №2 (по 9 мл).

Состав Сред №1 и 2 такой же, как в Примере 1.

Среда №5 имеет следующий состав (г/л): нефть - 5,0; агар - 15,0; NaCl - 5,0; KH₂ PO₄ - 3,0; Na₂CO₃ - 0,1; К ₂НРО₄ - 6,0; NH₄Cl - 2,0; MgSO ₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂×6Н ₂О - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7Н₂O - 0,01; рН 6,7-7,2.

Для роста клеток Ps.putida и Rh.erythropolis инокулированные Среды №1 и №5, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.

Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательную Среду №2 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 15 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные среды №2, 4 и 6 (по 4, 5 мл).

Среда №6 имеет тот же состав, что и Среда №5, но без агара. Культивирование образцов на средах №4 и 6 проводили при 28°С в аэробных условиях, а на среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток Pseudomonas putida и Desulfovibrio vulgaris биолюминесцентным методом проводят так же, как в Примере 1.

Для определения численности клеток Rh. erythropolis в процессе культивирования на Среде №6 периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для проведения биолюминесцентного анализа содержащейся в них общей концентрации АТФ. К взятой пробе добавляют 0,5 мл хлороформа, далее интенсивно перемешивают в течение 3 мин, добавляют 0,5 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера, смесь вновь интенсивно встряхивают и после расслоения фаз 50 мкл водной фазы вносят в кювету люминометра, содержащую 50 мкл люциферазного реагента. Время анализа составляет 1 мин. Далее определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток Rh. erythropolis составляет (2,2±0,1)×10 ^-17 моль/кл.

Математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят, как в Примере 1. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.

Пример 4. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, содержащейся в реальных сточных водах нефтяного месторождения.

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Берут аликвоту (1 мл) образца сточной воды на нефтяном месторождении, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.

Культивирование клеток в селективных Средах №1, 3 и 5 проводят при 28°С в аэробных условиях, а культивирование клеток в Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.

Через 15 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 16 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28 С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3 с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.

Пример 5. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, присутствующей в составе коррозионных биопленок.

Биопленки, образующиеся на поверхности металлических конструкций, вызывают развитие биокоррозии на местах их формирования. Биопленки представляют собой адгезированные на твердой поверхности смешанные культуры, в состав которых входят гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [С.М.Santegoeds, T.G.Ferdelman, G.Muyzer, Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms.// Appl. Environ. Microbiol., 1998, V.64, p.3731-3739].

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см². Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоту полученной суспензии (1 мл), готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.

Культивирование клеток в селективных Средах №1, 3 и 5 проводят при 28°С в аэробных условиях, а культивирование клеток в Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.

Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации клеток отдельных видов бактерий получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для бактерий родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 15 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см². Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоты суспензии (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3, с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.

Пример 6. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для разложения фосфорорганических пестицидов.

Бактериальные консорциумы, разрабатываемые для биологической очистки воды и состоящие из разных микроорганизмов, участвующих в последовательных стадиях разложения фосфорорганических пестицидов (ФП) типа малатион, паратион, кумафос и др., обнаруживаемых в сельскохозяйственных и промышленных сточных водах, в водах рек, как правило, состоят из бактерий Escherihia coli, являющихся генно-инженерным продуцентом ферментов, гидролизующих триэфиры ортофосфорной кислоты, и бактерий рода Pseudomonas, способных метаболизировать продукты ферментативного гидролиза ФП [E.S.Gilbert, A.W.Walker, J.D.Keasling, A constructed microbial consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion.//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, V.61, p.77-81].

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем ресуспендирования в физиологическом растворе клеток E.coli, Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens так, чтобы их конечные концентрации в смеси составили (3,3±0,7)×10³ и (4,4±0,8)×10 ⁶ кл/мл, соответственно, для клеток E.coli и суммарно для клеток рода Pseudomonas. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и 7.

Среда №7 имеет следующий состав (г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0; ФП (паратион) - 0,002 г; ампициллин - 50 мкг; рН 6,8-7,0.

Инокулированные Среды №1 и 7 инкубируют при 28°С в аэробных условиях. Через 5 дней отмечают последнее разведение, давшее рост колониеобразующих единиц, число которых подсчитывают и используют для окончательного расчета исходных концентраций клеток E.coli и суммарной концентрации клеток рода Pseudomonas. При этом учитывают все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 6 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Берут аликвоты смешанной культуры (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №4 и 8 (по 4, 5 мл).

Среда №8 имеет тот же состав, что и Среда №7, но без агара. Культивирование образцов на Средах №4 и 8 проводят при 28°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 20 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток бактерий одного таксономического типа, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводится, как описано в Примере 1, с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток E.coli составляет (5,0±0,7)×10^-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.

Пример 7. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для получения молочно-кислых продуктов.

Для получения различных молочно-кислых продуктов пробиотического назначения широко используются разные смешанные культуры, основу которых составляют бактерии Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus lactis [M.E.Sanders, J.H.Veld, Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues.//Antome van Leeeuwenhoek, 1999, V.76, p.293-315].

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).

Образец кисло-молочного продукта (1 мл), содержащий, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus, суспендируют в физиологическом растворе, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №9, 10. В случае использования Среды №11 пробу (0,1 мл) предварительно вносят в чашку Петри и сверху заливают средой.

Используемые среды имеют следующий состав.

Среда №9 (селективная среда для клеток Lactobacillus acidophilus, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; MnSO₄ - 0,5; MgSO ₄×7Н₂O - 0,2; К₂НРО ₄ - 2,0; фенол - 0,005; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.

Среда №10 (селективная среда для клеток Bifidobacterium sp, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; сульфат неомицина - 3,0; MnSO₄ - 0,5; MgSO₄×7Н₂О - 0,2; К₂HPO₄ - 2,0; хлорид лития - 0,01; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.

Среда №11 (селективная среда для клеток Streptococcus thermophilus, г/л): гидролизованное обезжиренное молоко - 10,0; сахароза - 20,0; агар - 20,0; рН 4,3-4,8.

Культивирование клеток бактерий на селективных Средах №9, 10 и 11 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Через 7 дней подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц на Средах №9, 10 и 11. Исходные концентрации клеток бактерий определенного вида получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток и считая, что для Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus являются селективными, соответственно, Среды №9, 10 и 11. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 8 суток.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.

Аликвоты кисло-молочного продукта (по 0,5 мл), содержащего, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus вносят в жидкие питательные Среды №12, 13 и 14 (по 4, 5 мл).

Среды №12, 13 и 14 имеют тот же состав, что и Среды №9, 10 и 11, но без агара. Культивирование клеток на селективных Средах №12, 13 и 14 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 24 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1, учитывая известные средние величины удельной концентрации АТФ, характерные для клеток Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. u Streptococcus thermophilus, которые составляют, соответственно, (1,5±0,1)×10^-17, (4,2±0,6)×10 ^-17 и (2,7±0,8)×10^-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены концентрации клеток, определенные, согласно заявляемому методу, в исходном образце. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.

Таким образом, заявляемый способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, по сравнению с аналогами и прототипом, обладает рядом существенных преимуществ:

- способ позволяет параллельно количественно идентифицировать бактериальные клетки разных таксономических групп, одновременно присутствующие в смешанных культурах, вместо одной отдельно взятой, как в прототипе;

- способ позволяет существенно (до 9 раз) повысить точность дифференцированного определения численности клеток, особенно для бактерий, рост которых возможен только на жидких питательных средах, и поэтому подсчет колониеобразующих единиц для них традиционным методом на твердых питательных средах принципиально не возможен (Примеры 1-5);

- способ позволяет расширить концентрационный диапазон определения численности бактерий и снизить предел дифференцированного обнаружения до 1-10 кл/мл (Примеры 4 и 5);

- способ позволяет существенно (в 3-4 раза) сократить общее время анализа, особенно для клеток бактерий с низкими скоростями роста и при исходно низких концентрациях клеток в анализируемых образцах (Примеры 1-7);

- способ может быть применен для дифференцированного количественного определения широкого спектра бактерий, представляющих собой природные или генно-инженерные клетки и характеризующихся разными структурами клеточной стенки, ферментативными активностями, анаэробным или аэробным метаболизмом, а также обитающих в различных биосистемах или используемых в разных биотехнологических процессах (Примеры 1-7).