способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок
Классы МПК: | G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) |
Автор(ы): | Беспалова Т.А. (RU), Приступа О.А. (RU), Хитрова Д.А. (RU), Пацула Ю.И. (RU), Архипов И.В. (RU), Хитрова Е.А. (RU), Варбанский В.И. (RU), Варбанский Д.И. (RU) |
Патентообладатель(и): | Институт ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2003-04-30 публикация патента:
27.10.2005 |
Изобретение относится к ветеринарии. Способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок, включает выделение лимфоцитов путем центрифугирования из периферической крови, приготовление эритроцитарных маркеров, постановку реакции розеткообразования, инкубацию компонентов реакции и учет результатов реакции, и, дополнительно, выделение лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов, причем центрифугирование проводят в течение 40-45 минут, приготовление эритроцитарных маркеров осуществляют с использованием специфического антигена алеутской болезни норок в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка и инкубацию компонентов реакции осуществляют при температуре 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут, а для определения Т-лимфоцитов дополнительно осуществляют инкубацию при температуре 10°С в течение 1500-2100 минут.
Способ обеспечивает повышение эффективности оценки иммунного статуса норок на 25-27% и может использоваться в качестве дополнительного теста для диагностики алеутской болезни норок. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.
Формула изобретения
1. Способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок, включающий выделение лимфоцитов путем центрифугирования из периферической крови, приготовление эритроцитарных маркеров, постановку реакции розеткообразования, инкубацию компонентов реакции и учет результатов реакции, отличающийся тем, что дополнительно выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов, центрифугирование проводят в течение 40-45 мин, приготовление эритроцитарных маркеров осуществляют с использованием специфического антигена алеутской болезни норок в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов быка и инкубацию компонентов реакции осуществляют при температуре 37,5-40,0°С в течение 60-120 мин.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения Т-лимфоцитов дополнительно осуществляют инкубацию при температуре 10°С в течение 1500-2100 мин.
Описание изобретения к патенту
Способ относится к иммунологическим методам исследования и используется для оценки иммунного статуса животных, а также в качестве дополнительного теста при диагностике инфекционных болезней. В основе метода заложено определение количества лимфоцитов, способных взаимодействовать с эритроцитарными маркерами в виде "розеток".
Известен способ определения количества Т-лимфоцитов в реакции образования спонтанных розеток (Фримель X. Иммунологические методы. М.,- 1979.-С.501-508.). Способ основан на обнаружении в поле зрения микроскопа комплекса Т-лимфоцитов с эритроцитарными маркерами в виде "розеток". Однако данный способ не позволяет комплексно оценивать иммунный статус животного с учетом количества В-лимфоцитов.
Также известен способ определения количества В-лимфоцитов, основанный на использовании эритроцитов быка, сенсибилизированных антителами и комплементом, содержащемся в сыворотке крови белой мыши. Данный способ ограничивает оценку иммунного статуса животного в пределах определения количества В-лимфоцитов (Методические рекомендации по определению Т-, В-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов в крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота/Сост.: Б.И.Кондауров, М.П.Неустроев, Ю.И.Пацула, А.А.Васильев.- Омск, 1981.-С.13-14).
Ближайшим аналогом выбран способ определения количества розеткообразующих Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов, описанный Бажиным М.А. с соавторами (Методы оценки Т- и В-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе: Метод. рекомендации/Сост.: М.А.Бажин, В.А.Мироненко, С.К.Переходова и др.- Омск, 1989.- С.16-22).
Перед постановкой реакции розеткообразования лимфоциты из периферической крови выделяют дифференциальным центрифугированием форменных элементов в градиенте плотности 17% раствора верографина в объеме 2 мл, на который наслаивают 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена. Центрифугирование проводят в течение 20-30 минут при 1600 об/мин. Лимфоциты, сконцентрировавшиеся в верхних слоях верографина, собирают шприцом и трижды отмывают от примесей центрифугированием.
Для определения розеткообразующих лимфоцитов готовят эритроцитарные маркеры. Для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов крови крупного рогатого скота Бажин М.А. с соавторами предлагают использовать в качестве маркера эритроциты быка, на поверхности которых адсорбирован соответствующий антиген туберкулеза или брецеллеза.
Для постановки реакции розеткообразования соединяют равные объемы лимфоцитов крови и соответствующих эритроцитарных маркеров.
Для взаимодействия с соответствующими эритроцитарными маркерами В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов компоненты реакции инкубируют при 37°С в течение 10 минут. Для взаимодействия с эритроцитарными маркерами Т-лимфоцитов компоненты реакции инкубируют сначала при 30°С в течение 30 минут, а затем при 10°С в течение 1080-1200 минут. По окончании инкубирования из суспензии клеток, фиксированных глютаровым альдегидом, делают мазки и окрашивают по Романовскому-Гимза.
Известный метод оценки иммунного статуса не обладает достаточной чувствительностью для определения количества лимфоцитов крови и лимфоидных органов норок.
Задачей предлагаемого способа является повышение эффективности оценки иммунного статуса норок путем повышения чувствительности реакции розеткообразования. Способ осуществляется следующим образом: выделяют лимфоциты из минимального объема периферической крови, 0,5-1 мл, в режиме центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут; исследуют иммунокомпетентные клетки не только в периферической крови, но и в селезенке и лимфоузлах; используют стандартный специфический антиген алеутской болезни (АБ, вирусный плазмоцитоз) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка; инкубируют компоненты реакции для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут; инкубацию компонентов реакции для определения количества Т-лимфоцитов осуществляют вначале при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут, затем при 10°С в течение 1500-2100 минут; учет результатов реакции проводят не только в мазках, но и в камере Горяева.
Совокупность всех признаков предлагаемого способа позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27%.
Отличительными признаками предложенного способа являются:
- исследование иммунокомпетентных клеток не только периферической крови, но и селезенки и лимфатических узлов;
- центрифугирование в течение 40-45 минут;
- использование стандартного антигена вируса АБ штамма "П-1" (ФНПВЗЦ "ВЕТЗВЕРОЦЕНТР", Москва) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка;
- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов в течение 60-120 минут при 37,5-40,0°С;
- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения количества Т-лимфоцитов в течение 1500-2100 минут при 10°С.
Пример 1.
Для достижения поставленной цели отбирали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов от 40 норок половозрелого возраста темно-коричневого окраса (стандарт). По результатам диагностического исследования крови норок на вирусный плазмоцитоз с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на нитроцеллюлозных стрипах с антигеном АБ всех животных разделили на две группы. 20 норок первой группы на основании отрицательного результата ИФА считали здоровыми, 20 норок второй группы с положительными результатами ИФА считали инфицированными вирусным плазмоцитозом.
При выделении лимфоцитов из периферической крови норок с помощью дифференциального центрифугирования форменных элементов в градиенте плотности 17% верографина при 1600 об/мин в течение 20-30 минут отмечали недостаточный выход лимфоцитов и наличие в полученной суспензии большого числа неотделившихся форменных элементов крови. Поэтому для большего выхода лимфоцитов и отделения их от форменных элементов крови подбирали необходимую продолжительность дифференциального центрифугирования (Таблица 1).
Из таблицы видно, что более высокий выход лимфоцитов из периферической крови норок и максимально возможное отделение от форменных элементов получали в режиме дифференциального центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут.
Следующим подготовительным этапом реакции розеткообразования являлось приготовление эритроцитарных маркеров. Особенностью приготовления эритроцитарного маркера для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов норок являлось использование стандартного диагностического антигена АБ штамма "П-1". Его применение позволило оценивать иммунный статус норок в норме и при вирусном плазмоцитозе. Полученные критерии оценки иммунного статуса использовались в качестве дополнительного теста при диагностике данной инфекции. Экспериментальным путем была подобрана эффективная доза стандартного диагностического антигена АБ (Таблица 2).
Таблица 1 | |||
Зависимость выхода лимфоцитов из периферической крови от продолжительности ее центрифугирования в градиенте плотности | |||
Скорость центрифугирования, (об/мин) | Время центрифугирования, (минуты) | Выход лимфоцитов, (%) | Концентрация форменных элементов крови в выделенной суспензии лимфоцитов, (тыс/мкл) |
1600 | 20 | 55,3±0,81 | 20,2±0,81 |
25 | 61,8±0,83 | 15,3±0,75 | |
30 | 66,2±0,53 | 10,5±0,88 | |
35 | 70,9±0,42 | 5,8±0,72 | |
40 | 75,3±0,34 | 3,2±0,57 | |
45 | 77,4±0,21 | 2,3±0,78 | |
50 | Лимфоциты вместе с эритроцитами оседают на дно пробирки | - | |
55 | - | ||
- | |||
- | |||
- | |||
- |
Таблица 2 | ||||||
Количество выявленных антигенсвязывающих лимфоцитов норок в зависимости от дозы антигена в эритроцитарном маркере | ||||||
Доза антигена АБ (мл, в 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка) | Количество антигенсвязывающих лимфоцитов, (%) | |||||
Кровь | Селезенка | Лимфоузлы | ||||
Норки здоровые | Норки больные плазмоцитозом | Норки здоровые | Норки больные плазмоцитозом | Норки здоровые | Норки больные плазмоцитозом | |
0,005 | 1,2+0,23 | 5,3±0,34 | 1,3±0,21 | 8,3±0,22 | 1,1±0,31 | 7,3±0,12 |
0,010 | 2,3+0,16 | 10,5+0,16 | 3,8±0,16 | 10,4±0,24 | 2,8±0,22 | 10,8±0,25 |
0,020 | 3,9±0,26 | 17,8±0,24 | 4,4+0,14 | 13,3±0,10 | 4,4+0,09 | 13,5±0,22 |
0,030 | 5,0+0,28 | 20,8±0,90 | 5,7±0,30 | 15,5±0,84 | 5,4±0,51 | 15,4±0,24 |
0,040 | 4,5±0,16 | 18,4±0,14 | 4,1+0,15 | 14,2±0,12 | 4,3±0,25 | 13,5±0,21 |
0,050 | 3,5±0,18 | 15,1±0,13 | 3,4±0,07 | 11,8±0,14 | 3,8+0,14 | 11,8±0,05 |
0,070 | 2,8±0,11 | 10,3±0,22 | 2,6±0,22 | 9,5±0,15 | 3,4±0,21 | 7,5±0,05 |
0,100 | 1,1±0,22 | 5,4±0,21 | 1,8±0,16 | 7,4±0,09 | 2,5±0,13 | 5,1±0,13 |
1,4±0,14 | 2,3±0,23 | 1,2+0,22 | 3,4±0,05 | 1,5±0,03 | 2,4±0,02 | |
0,150 | ||||||
элементы | Гемолиза | |||||
0,200 |
По данным таблицы использование антигена АБ в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка позволило выявить более высокий процент антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок.
Пример 2.
Для постановки реакции розеткообразования В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов использовали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов животных опытных и контрольных групп согласно описанию в примере 1.
Соединяли равные объемы лимфоцитов и эритроцитарных маркеров с последующим инкубированием. Для достижения поставленной задачи был проведен подбор различных временных интервалов инкубации компонентов реакции при температуре, равной температуре тела исследуемого животного (у плотоядных в пределах 37,5-40,0°С).
Из данных таблицы видно, что более высокий процент розеткообразующих В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок выявили при инкубации компонентов реакции длительностью 60-120 минут.
Пример 3.
Для определения количества Т-лимфоцитов в периферической крови, селезенки и лимфоузлах норок использовали группы животных согласно описанию в примере 1.
Для выявления более высокого процента Т-лимфоцитов подбирали различные временные интервалы инкубации компонентов реакции (Таблица 4). По данным таблицы более высокий процент розеткообразующих Т-лимфоцитов выявляли при инкубации компонентов реакции длительностью 1500-2100 минут.
Использование предлагаемого способа исследования иммунокомпетентных клеток периферической крови здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок выявляет более высокий процент всех популяций розеткообразующих лимфоцитов в сравнении с известным методом, описанным Бажиным М.А., что свидетельствует об эффективности предлагаемого способа (Р<0,001). В группе здоровых норок при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным процент выявляемости в периферической крови Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов выше на 18%, 30%, 24%, 35%, соответственно, в группе животных, больных вирусным плазмоцитозом - на 23%, 28%, 25%, 32%, соответственно.
Исследование иммунного статуса больных норок предлагаемым способом выявило в периферической крови достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров и антигенсвязывающих лимфоцитов в сравнении с количественными показателями соответствующих популяций лимфоцитов у здоровых животных (Р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют об иммунологической перестройке организма при АБ норок. Увеличение в крови антигенсвязывающих лимфоцитов служит критерием оценки иммунного статуса зверей, являясь дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.
Анализ количественных показателей иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о достоверно большем проценте розеткообразующих лимфоцитов, полученном при использовании рекомендуемого нами способа в сравнении с известным (Р<0,001). В группе здоровых норок процент выявляемости Т-лимфоцитов селезенки выше на 26% при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным, В-лимфоцитов - на 27%, лимфоцитов-киллеров - на 30%, антигенсвязывающих лимфоцитов - на 30%, в группе норок больных вирусным плазмоцитозом эти показатели составили 27%, 34%, 29%, 32% соответственно.
Сопоставление количественных величин иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок, исследованных предлагаемым способом, показывает достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) при данной инфекции, что свидетельствует об изменении иммунного статуса животного. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в селезенке норок больных вирусным плазмоцитозом, вследствии сенсибилизации организма данным возбудителем, служит дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.
Изучение количественных показателей Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов лимфатических узлах норок показало достоверно больший процент выявляемости розеткообразующих клеток (Р<0,001). При использовании предлагаемого способа постановки реакции розеткообразования, в сравнении с известным, в группе здоровых животных на 28%, 26%, 29%, 32%, соответственно, в группе норок, больных плазмоцитозом - на 14%, 31%, 28%, 34%, соответственно.
В группе норок, больных вирусным плазмоцитозом, иммунологическое исследование лимфоузлов предлагаемым способом показало уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001), увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) в сравнении со здоровыми животными. Изменение количества иммунокомпетентных клеток в лимфатических узлах инфицированных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о развитии иммунного ответа на антиген АБ. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в лимфатических узлах служит критерием оценки иммунного ответа норок и является дополнительным тестом при диагностике вирусного плазмоцитоза.
Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27% и может использоваться в качестве дополнительного теста для диагностики алеутской болезни.
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)