способ оценки спермы быков-производителей на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Формула изобретения

1. Способ оценки спермы быков-производителей на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, включающий отбор серий спермы, объединение серий спермы, полученных от быка-производителя в течение одного месяца, и исследование их как одной пробы, отличающийся тем, что исследования проб проводят методом молекулярной гибридизации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для оценки спермы выбракованных быков-производителей отбирают серии спермы, полученные за весь период их эксплуатации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам оценки спермы инфицированных быков-производителей на контаминацию возбудителями инфекционных заболеваний.

До настоящего времени основным методом оценки спермы на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является длительная процедура, основанная на выделении вируса в чувствительной культуре клеток (Фарботко Г.Э., Кондрахина Н.Н. Обнаружение вирусов в сперме быков // Ветеринария. - 1992. - №5.- С.47-48).

Авторы предлагают отбирать все серии спермы, полученные за 2 недели, после чего хранить в холодильнике на племпредприятии и два раза в месяц доставлять в лабораторию для исследования путем выделения вируса в чувствительной культуре клеток.

Однако данный способ разработан с использованием метода культуры клеток. Однако этот метод очень трудоемкий, длительный и обладает низкой чувствительностью. К тому же данный способ не предусматривает исследование серий спермы в динамике по годам (за весь период эксплуатации быков).

Наиболее близким решением, принятым за прототип, и наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является следующий способ выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в сперме быков-производителей. (Van Oirschot J.T., Straver P.J., Van Lieshout J.A. et al. A subclinical infection of bulls with bovine herpesvirus type 1 at an artificial insemenation centre // Vet. Rec. - 1993 - Vol.132 - P.32-35).

Серии спермы (соломинки), полученные от одного быка за 3 удачные садки, объединяют и исследуют как одну пробу (пул). Если эта объединенная проба оказывается положительной, то исследуют отдельно каждую пробу, входящую в объединенную.

Пробы спермы доставляют в лабораторию и хранят при -70°С до исследования. Исследования проводят следующим образом. Соломинки оттаивают при комнатной температуре и содержимое каждой (0,2 мл разведенной спермы) разводят в 2 мл сыворотки серонегативной к вирусу крупного рогатого скота, полученной из свободного от специфических патогенов стада крупного рогатого скота, и антибиотики. Разведенную пробу спермы инкубируют при комнатной температуре 30 минут, затем 1 мл вносят в монослой субкультуры почки эмбриона коровы, выращенной в 25 см² матрасах. После адсорбции в течение 1 часа при 37°С клетки отмывают раствором Хенкса с 2% свободной от специфических патогенов сыворотки КРС и в качестве поддерживающей среды вносят среду Игла MEM, содержащую 2% свободной от специфических патогенов сыворотки крови крупного рогатого скота, 250 ед пенициллина, 250 мг стрептомицина, 75 ед нистатина и 75 мг канамицина/мл. Культуру клеток просматривают ежедневно в течение 7 дней на наличие цитопатического действия вируса. Для идентификации вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота применяют метод прямой иммунофлуоресценции с использованием моноспецифической антисыворотки к данному вирусу, конъюгированной с флуоресцеина изотиоционатом.

Недостатком этого способа является также использование дорогостоящей, длительной и трудоемкой процедуры заражения субкультуры почки эмбриона коровы, требующей ежедневного наблюдения в течение 7 дней для обнаружения цитопатического действия вируса.

К недостаткам этого способа относится также необходимость идентификации выделенного в культуре клеток вируса при помощи метода прямой иммунофлуоресценции с использованием моноспецифической анти-BHV-1 сыворотки, конъюгированной с флуоресцеина изотиоционатом.

Технической задачей изобретения является усовершенствование способов оценки спермы быков-производителей на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита путем замены трудоемких и длительных вирусологических исследований с использованием культур клеток на более простой, быстрый и экономичный метод молекулярной гибридизации.

Сущность изобретения заключается в том, что известный способ оценки спермы быков-производителей на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, включающий отбор серий спермы, объединение серий спермы, полученных от быка-производителя в течение одного месяца и исследования их как одной пробы, отличается тем, что исследования проб проводят методом молекулярной гибридизации.

Сущность изобретения заключается также в том, что для оценки спермы выбракованных быков-производителей отбирают серии спермы, полученные за весь период их эксплуатации.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример 1. Оценка спермы быков-производителей, находящихся в эксплуатации, на контаминацию вирусом ИРТ КРС.

Отобранную сперму оценивают по зоотехническим показателям, разводят, фасуют и хранят в жидком азоте до получения результатов лабораторных исследований.

Отбор проб спермы для исследования на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота производят следующим образом. Все серии спермы, полученные от быка-производителя в течение всего срока его эксплуатации, который обычно составляет несколько лет, делят по месяцам. Исходя из того, что количество серий спермы, полученных за один месяц от одного быка, после удачных садок составляет обычно 4-5, из каждой отбирают по 2 гранулы объемом 0,2 мл и объединяют их вместе. Количество объединенных проб спермы, полученных в течение года, составляет, таким образом, 12. Пробы помещают в отдельные пробирки, нумеруют и доставляют для исследования в лабораторию в замороженном виде.

В лаборатории их оттаивают при комнатной температуре, затем пробы, отобранные из каждой серии спермы, полученной за один месяц, исследуют как одну. При этом из каждой объединенной пробы спермы для исследования отбирают 0,2 мл (200 мкл).

В случае положительного результата исследования все серии спермы, полученные от быка за месяц уничтожают, а при отрицательном результате - используют для осеменения без ограничений.

Пример 2. Оценка спермы, полученной от выбракованных в различные годы быков и хранящейся на племпредприятиях в условиях глубокой заморозки.

Отбирают и исследуют на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота все серии спермы, полученные от быков, в течение всего срока их эксплуатации. При отборе исходят из остатка запасов спермы на момент исследования.

Отбор проб производят согласно примеру 1.

Пример 3. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС пробах спермы методом молекулярной гибридизации.

Из каждой пробы спермы отбирают образец объемом 200 мкл, переносят в чистую пробирку и добавляют 800 мкл физиологического раствора, полученную суспензию осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Для выделения ДНК используют по 400 мкл осветленного супернатанта.

К 400 мкл осветленного супернатанта добавляют 4,5 мкл буфера П (1М ТРИС-HCL, рН 8, 0,1М ЕДТА), 40 мкл 10%-ного SDS, 4 мкл протеиназы К (конц. 10 мг/мл). Инкубируют в термостате при 37°С в течение 2-4 часов. Затем добавляют 500 мкл насыщенного фенола (рН8), перемешивают и осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 2 мин. Отбирают супернатант в чистую пробирку, приливают по 300-400 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1 по объему), повторяют центрифугирование. К отобранному супернатанту добавляют 800 мкл 96%-ного этанола и 300 мкл 3М ацетата натрия и выдерживают при -20°С в течение 12 часов. После этого содержимое пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин, сливают супернатант, а осадок промывают 2 раза 96%-ным этанолом и высушивают.

К осадку ДНК добавляют 10 мкл 2×SSC и перемешивают. Пробирки прогревают на водяной бане при 100°С в течение 5 минут и помещают в лед. Скопившийся конденсат сбрасывают вниз центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 секунд. На фильтры наносят по 2 мкл полученной пробы.

Фильтры с нанесенными пробами подсушивают и облучают под ультрафиолетовой лампой в течение 1 минуты. После этого фильтр помещают в гибридизационный раствор (6×SSC, 5× Денхардт, 0,5% SDS, денатурированная ДНК лосося в концентрации 0,1 мг/мл) и инкубируют в термостате при 65°С в течение 1 часа. Затем фильтр переносят в гибридизационную смесь, состоящую из 5 мл гибридизационного раствора и 10 мкл биотинилированного ДНК-зонда, и инкубируют в термостате при 65°С в течение 16 часов. Фильтр последовательно выдерживают в течение 15 минут в растворе 1×SSC, 0,1% SDS при температуре 18°С и 60°С, 15 минут в растворе 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°С, 30 минут в блокирующем буфере (0,1М ТРИС-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 3 мМ MgCl₂ , 0,5% твин-20) при 18°С и 5 минут в реакционном буфере (буфере (0,1М ТРИС-HCl рН 7,5, 0,1М NaCl, 3 мМ MgCl₂ , 0,05% твин-20). Подсушивают фильтр при помощи фильтровальной бумаги, переносят на чистый лист лавсана, наносят конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой, разбавленной 1:1000 реакционным буфером, накрывают сверху листом лавсана и оставляют при 18°С на 20 минут. Затем последовательно промывают путем периодического покачивания 3 раза по 5 минут в блокирующем буфере и один раз в АР-буфере (0,1М ТРИС-HCl рН 9,5, 0,1М NaCl, 5 мМ MgCl₂ ). Для окрашивания фильтр помещают в раствор красителей (2,5 мг 5-бром-3-индолфосфата в 50 мкл диметилформамида, 4 мг нитратетразолевого синего в 50 мкл диметилформамида, 15 мл АР-буфера) и оставляют на 1-2 часа при 37°С в темноте, промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе.

Пример 4. Определение чувствительности метода молекулярной гибридизации в сравнении с методом выделения вируса в культуре клеток.

Результаты приведены в таблице.

Таблица Сравнительная эффективность методов молекулярной гибридизации и выделения в культуре клеток при выявлении вируса ИРТ КРС в искусственно контаминированной сперме быка-производителя.
Разведение вируса	Чувствительность метода
	Выделение в культуре клеток	Молекулярная гибридизация
6 lg ТЦД50/мл.	+	+
5 lg ТЦД 50/мл.	+	+
4 lg ТЦД50/мл.	-	+
3 lg ТЦД50/мл.	-	-
Примечание: "+" - положительный результат; "-" - отрицательный результат.

Приведенные в таблице данные показывают, что чувствительность метода молекулярной гибридизации составляет 4 lg ТЦД_50/мл , что на 1 lg выше, чем чувствительность метода выделения в культуре клеток.

Таким образом, метод молекулярной гибридизации выявляет значительно больше инфицированных проб спермы, чем метод выделения вируса в культуре клеток. Время исследования 100 проб спермы составляет 36-72 часа, чувствительность 4-5 log ТЦД ₅₀/мл.

По срокам постановки диагноза метод молекулярной гибридизации превосходит метод выделения вируса в культуре клеток в 36, а ретроспективный серологический диагноз в 16,8 раз.