перцихиннин, способ его получения и его применение в качестве фармацевтического средства

Формула изобретения

1. Перцихиннин, соединение формулы

и его фармацевтически приемлемые соли.

2. Перцихиннин, соединение формулы С₁₂Н₁₆О₃, которое может быть получено путем культивирования грибов ST 001837 (DSM 13303), принадлежащих к классу Базидиомицетов Stereum complicatum, в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим его выделением и очисткой стандартным способом, и его фармацевтически приемлемые соли.

3. Способ получения перцихиннина или его соли по п.1 или 2, предусматривающий культивирование базидиомицетов вида ST 001837 (DSM 13303), принадлежащих к классу Базидиомицетов Stereum complicatum, в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота с последующим его выделением и очисткой стандартным способом.

4. Базидиомицеты Stereum complicatum, вида ST 001837 ( депонированный 11 февраля 2000 года в немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур DSMZ под номером доступа DSM 13303).

5. Перцихиннин или его фармацевтически приемлемая соль по п.1 или 2 для применения в качестве фармацевтического средства.

6. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать липазу, содержащая эффективное количество перцихиннина или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Перцихиннин или его фармацевтически приемлемая соль по п.1 или 2 для применения в качестве ингибитора липазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к соединению, названному перцихиннином, которое может быть получено путем культивирования базидиомицета Stereum complicatum, ST 001837 (DSM 13303), и к его фармацевтически приемлемым солям и производным. Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования перцихиннина, к грибам ST 001837 (DSM 13303), к применению перцихиннина и его фармацевтически приемлемых солей и производных в качестве фармацевтических средств, а в частности к их применению в качестве ингибиторов липазы, и к фармацевтическим композициям, содержащим перцихиннин или его фармацевтически приемлемую соль или производное.

Метаболизм липидов обычно поддерживает тонкий баланс между синтезом и деградацией. При нарушении этого баланса может возникать гиперлипидемия, которая, в свою очередь, может вызывать атеросклероз, гипертензию, диабет и т.п. Ожидается, что для регуляции этих расстройств могут быть использованы модуляторы метаболизма липидов.

Предполагается, что ингибирование липолиза при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД) приводит к снижению гипергликемии. Начальным событием в утилизации жира как источника энергии является гидролиз триацилглицерина липазами, например, гормоночувствительной липазой и моноацилглицерин-липазой. Гидролиз триацилглицеринов приводит к увеличению уровней глицерина и жирных кислот в крови. Предполагается, что ингибиторы липазы снижают уровни жирных кислот в плазме и гипергликемии и имеют незначительные побочные эффекты.

Ожирение и гиперхолестеринемия до некоторой степени связаны с чрезмерным употреблением пищевого жира. Ключевым ферментом, регулирующим всасывание пищевого триглицерида, является панкреатическая липаза. Ингибирование панкреатической липазы может приводить к ингибированию всасывания жира.

Было обнаружено, что новое соединение, названное перцихиннином, ингибирует липолиз. Таким образом, настоящее изобретение относится к перцихиннину, соединению формулы:

и к его фармацевтически приемлемым солям и производным, таким как сложные эфиры, простые эфиры и очевидные химические эквиваленты, включая все стереоизомерные и все таутомерные формы.

Перцихиннин имеет молекулярную формулу C₁₂H ₁₆O₃ (208 Да) и может быть охарактеризован по любому одному или нескольким его физико-химическим и спектральным свойствам, приведенным ниже, таким как спектроскопические данные ¹Н-ЯМР и спектроскопические данные ¹³С-ЯМР, представленные в таблицах 1 и 2.

Перцихиннин может быть описан как новый -лактон с аннелированным пятичленным кольцом, несущим гидроксиметильную часть и 2,3-изопентинильную боковую цепь в -положении данного лактона. Перцихиннин имеет новую структуру, которая до настоящего времени не была описана. Поиски по химическим реферативным журналам подтвердили, что перцихиннин является новым соединением. Никакое другое соединение не имеет структурных признаков перцихиннина.

Перцихиннин может быть получен путем культивирования микроорганизма, называемого культурой ST 001837 (далее обозначаемой ST 001837). Этот гриб, использованный для продуцирования перцихиннина, собирали в Percy Quinn, Mississippi State Park in Pike County, USA. Гриб ST 001837 принадлежит к классу Базидиомицетов Stereum complicatum и был депонирован 11-го февраля 2000 года в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zeilkulturen GmbH), Braunschweig, Germany, под номером доступа DSM №13303.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу продуцирования нового соединения, названного перцихиннином, из базидиомицетов вида ST 001837, его модификаций и вариантов, в аэробных условиях в питательной среде, содержащей один или несколько источников углерода и один или несколько источников азота, и, необязательно, пищевые неорганические соли и/или микроэлементы с последующим выделением указанного соединения и его очисткой стандартным способом.

Питательная среда, предпочтительно, содержит источники углерода, азота и питательные неорганические соли. Углеродными источниками являются, например, крахмал, глюкоза, сахароза, декстрин, фруктоза, моласса, глицерин, лактоза или галактоза, предпочтительно, глюкоза. Источниками азота являются, например, соевая мука, арахисовая мука, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, пептон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, желатин или казаминокислоты, предпочтительно, солодовый экстракт и дрожжевой экстракт. Питательными неорганическими солями являются, например, бифосфат натрия, бифосфат калия, бифосфат аммония, хлорид натрия, хлорид кальция, карбонат кальция, нитрат калия, сульфат аммония или сульфат магния, предпочтительно, бифосфат аммония.

Культивирование ST 001837 может быть осуществлено при температуре от 20°С до 35°С при рН от 3,0 до 8,0. Предпочтительно, ST 001837 культивируют при 25°С (±1°С), и при рН от 3 до 5.

Для получения оптимального выхода ингибитора липазы, перцихиннина настоящего изобретения, культивирование ST 001837, предпочтительно, осуществляют в течение 96-300 часов. Особенно предпочтительно проводить культивирование путем ферментации в течение 216-264 часов в глубинных условиях, например, в колбах-шейкерах, а также в лабораторных ферментерах. Прохождение ферментации и образование перцихиннина может быть детектировано жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) и посредством измерения биологической активности культурального бульона. В полученном культуральном бульоне, перцихиннин присутствует в отфильтрованной культуре, а также в мицелии, предпочтительно, в мицелии.

Перцихиннин может быть выделен с использованием известных методик разделения. Так, например, он может быть выделен из отфильтрованной культуры посредством экстракции не смешивающимся с водой растворителем, таким как этилацетат, дихлорметан, хлороформ или бутанол, при рН 5-8 или посредством гидрофобной хроматографии с использованием полимерных смол, таких как Diaion HP-20^®(или MCl ^® Gel СНР-20Р» (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), Amberlite XAD^®» (Rohm & Hass Industries USA), на активированном угле, или посредством ионообменной хроматографии при рН 5-8. Предпочтительным методом является хроматография на MCl® Gel CHP-20P. Активный материал может быть также выделен из мицелия посредством экстракции смешивающимся с водой растворителем, таким как метанол, ацетон, ацетонитрил, н-пропанол или изопропанол, или не смешивающимся с водой растворителем, таким как этилацетат, дихлорметан, хлороформ или бутанол при рН 5-8, предпочтительным методом является экстракция метанолом. После концентрирования и лиофилизации этих экстрактов получают активный неочищенный материал.

Ингибитор перцихиннин настоящего изобретения может быть, например, выделен из неочищенного материала следующим способом.

Для этого осуществляют фракционирование с применением любых нижеследующих методик: хроматографии в нормальной фазе (с использованием окиси алюминия или силикагеля в качестве стационарной фазы, и элюентов, таких как петролейный эфир, этилацетат, метиленхлорид, ацетон, хлороформ, метанол или их комбинации, и с добавлением аминов, таких как NEt₃), обращенно-фазовой хроматографии (с использованием обращенно-фазового силикагеля, такого как диметилоктадецилсилил-силикагель, также называемый RP-18, или диметилоктилсилил-силикагель, также называемый RP-8, в качестве стационарной фазы и элюентов, таких как вода, буферы, а именно, фосфат, ацетат, цитрат (рН 2-8) и органических растворителей, таких как метанол, ацетонитрил, ацетон, тетрагидрофуран или комбинации этих растворителей), гель-проникающей хроматографии с использованием смол, таких как Sephadex® LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel ^® Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) в растворителях, таких как метанол, хлороформ, ацетон, этилацетат или их комбинации или Sephadex^® G-10 и G-25 в воде; или противоточной хроматографии с использованием двухфазной системы элюентов, изготовленной из двух или нескольких растворителей, таких как вода, метанол, этанол, изопропанол, н-пропанол, тетрагидрофуран, ацетон, ацетонитрил, метиленхлорид, хлороформ, этилацетат, петролейный эфир, бензол и толуол. Эти методики могут быть использованы повторно или в комбинации с другими методиками. Предпочтительной методикой является хроматография на обращенно-фазовом силикагеле (RP-18).

Соединение перцихиннин может быть превращено в фармацевтически приемлемые соли и производные, такие как сложные эфиры и простые эфиры и другие очевидные химические эквиваленты, которые входят в объем настоящего изобретения. Указанные соли и производные могут быть получены стандартными методами, известными специалистам. Соли, такие как соли натрия и калия, могут быть, например, получены путем обработки перцихининна подходящими натриевыми или калиевыми основаниями.

Сложные эфиры и простые эфиры могут быть получены методами, описанными в литературе, например, в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J.March, John Wiley & Sons., 1992. Сложные эфиры могут быть получены посредством взаимодействия с карбоновыми кислотами или, например, с аминокислотами, такими как лейцин, глицин или аланин. После этерификации защита аминогруппы указанной аминокислоты может быть снята, или эта аминогруппа может быть защищена, например, формильной группой. Этерификация может быть осуществлена в присутствии дегидратирующего агента, например дициклогексилкарбодиимида (DCC) как описано в литературе (Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 6204; Arrieta et al. Synth. Commun. 1983, 13, 471).

Двойные связи могут быть восстановлены методами, описанными в литературе, например, в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J.March, John Wiley & Sons., 1992, p.771-775 или R.Bloch et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 4603-4605. Они могут быть гидрогалогенированы методами, описанными Н.О. House "Modern Synthetic Reactions", W.A. Benjymin, Inc., New York (1972), pp 446-452. Гидроксилированные производные могут быть получены посредством взаимодействия двойных связей с реагентами, такими как OsO₄, как описано в литературе, например, в Chem. Rev. 1980, 80, 187.

Производные могут быть также получены путем превращения двойных связей в эпоксиды посредством окисления, например, МСРВА, как описано в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J.March, John Wiley & Sons., 1992., p.826 или A.J. Pearson et al., J. Org. Chem. 1986, 51, 2505-2511.

Производные могут быть также получены путем озонолиза двойной связи изопентениловой боковой цепи. В зависимости от процедуры обработки это может приводить к образованию альдегида (например, с использованием Zn/HOAc или диметилсульфида/метанола), карбоновой кислоты (например, с использованием Н₂О₂) или спирта (например, с использованием LiAlH4 или NaBH₄) в качестве функциональной группы [W.Curruthers, "Some Modern Methods of Organic Synthesis", Cambridge University Press (1971), Chpt. 6; White, King & O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591 (1971); Bailey, P.S. "Ozonisation in Organic Chemistry", Vol.1 and Vol.2, New York, Academic Press (1978, 1982)]. Посредством реакции взаимодействия полученных таким образом альдегидов с фосфоранами, известной в литературе как реакция Виттига, могут быть введены боковые цепи с 4-10 атомами углерода. Нововведенные цепи могут содержать, например, OR ¹ (R¹=H или алкил с 1-4 атомами углерода), NR ²R³ (R²R²=H или алкильный остаток с 1-4 атомами углерода), F, Cl, Br или I в качестве функциональных групп, как описано в работе Н.J.Bestmann et al., "Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products", Topics in Current Chemistry 109, 85 (1983).

Перцихиннин обнаруживает ингибирование липазы при IC₅₀=2 мкМ (NBD-анализ, см. пример 6).

Настоящее изобретение также относится к применению перцихиннина в форме его рацематов, рацемических смесей и чистых энантиомеров и его диастереомерам и их смесям.

Для применения в качестве лекарственного средства особенно подходящими являются фармацевтически приемлемые соли из-за их более высокой растворимости в воде по сравнению с исходными соединениями, из которых они были получены. Эти соли должны иметь фармацевтически приемлемый анион или катион. Подходящими фармацевтически приемлемыми кислотно-аддитивными солями перцихиннина являются соли неорганических кислот, таких как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, метафосфорная кислота, азотная и серная кислоты; и органических кислот, таких как например, уксусная кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, гликолевая кислота, изэтионовая кислота, молочная кислота, лактобионовая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, янтарная кислота, п-толуолсульфоновая, винная кислота и трифторуксусная кислота. В медицинских целях, особенно предпочтительно использовать хлорид. Подходящими фармацевтически приемлемыми основными солями являются аммониевые соли, соли щелочных металлов (такие как соли натрия и калия) и соли щелочноземельных металлов (такие как соли магния и кальция).

В объем настоящего изобретения также входят соли, образованные с фармацевтически неприемлемым анионом, которые могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения или очистки фармацевтически приемлемых солей и/или которые могут быть использованы в не-терапевтических целях, например в in vitro-методах.

Используемый здесь термин "физиологически функциональное производное" означает любое физиологически толерантное производное настоящего изобретения, например, сложный эфир, который может быть введен млекопитающему, например человеку, для образования (прямо или опосредованно) указанного соединения или его активного метаболита.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению перцихиннина в форме пролекарств. Такие пролекарства могут подвергаться метаболизму in vivo с образованием перцихиннина. Эти пролекарства, сами по себе, могут быть активными или неактивными.

Перцихиннин может также присутствовать в различных полиморфных формах, например в аморфной и кристаллической полиморфной формах. Все полиморфные формы перцихиннина входят в объем настоящего изобретения и являются дополнительным аспектом настоящего изобретения.

Все последующие упоминания перцихиннина относятся к вышеописанному перцихиннину и к его солям, сольватам и физиологически функциональным производным, описанным в настоящей заявке.

Количество перцихиннина, необходимое для достижения нужного биологического эффекта, зависит от ряда факторов, например от выбора конкретного соединения, его предназначения, способа введения и клинического состояния пациента. Суточная доза обычно составляет в пределах от 0,3 мг до 100 мг (обычно от 3 мг до 50 мг) в день на килограмм массы тела, например 3-10 мг/кг в день. Внутривенная доза может, например, составлять в пределах от 0,3 мг до 1,0 мг на кг и может быть соответствующим образом введена в виде вливания от 10 нг до 100 нг на килограмм массы тела в минуту. Подходящие для этой цели растворы для вливания могут содержать дозу, например, от 0,1 нг до 10 мг, обычно от 1 мг до 10 мг на миллилитр. Разовые дозы могут содержать, например, от 1 мг до 10 г активного ингредиента. Так, ампулы для инъекций могут содержать, например, от 1 мг до 100 мг, а композиции в виде разовых доз, которые могут быть введены перорально, например, в виде таблеток или капсул, могут содержать, например, от 1,0 до 1000 мг, обычно, от 10 до 600 мг активного ингредиента. В случае фармацевтически приемлемых солей вышеуказанные массовые величины даны в расчете на массу иона аминотриазола, происходящего от этой соли. Для профилактики или терапии вышеупомянутых состояний перцихиннин может быть использован как отдельное соединение, но предпочтительно, чтобы он был использован в форме фармацевтической композиции в сочетании с совместимым носителем. Этот носитель должен быть, разумеется, совместимым с другими ингредиентами данной композиции и не должен оказывать неблагоприятного воздействия на здоровье пациента. Указанный носитель может быть твердым или жидким, либо и тем и другим, предпочтительно, он может составлять композицию с данным соединением в форме одноразовой дозы, например в форме таблетки, которая может содержать от 0,05 до 95 мас.% активного ингредиента. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть изготовлены известными фармацевтическими методами, которые, в основном, предусматривают смешивание указанных ингредиентов с фармакологически приемлемыми носителями и/или наполнителями.

Фармацевтическими композициями настоящего изобретения являются композиции, подходящие для перорального, ректального, местного перорального (например, под язык) и парентерального (например, подкожного, внутримышечного, чрезкожного или внутривенного) введения, хотя, в каждом конкретном случае, наиболее подходящий способ введения зависит от природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, и от типа используемого перцихиннина. В объем настоящего изобретения также входят композиции с покрытиями и композиции пролонгированного высвобождения с покрытием. Предпочтительными являются композиции, устойчивые к кислоте и к желудочному соку. Подходящие покрытия, устойчивые к желудочному соку, содержат ацетат-фталат целлюлозы, поливинилацетат-фталат, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и анионные полимеры метакриловой кислоты и метилметакрилата.

Подходящие фармацевтические соединения для перорального введения могут быть изготовлены в виде отдельных форм, таких как, например, капсулы, облатки, пастилки или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество перцихиннина; в виде порошков или гранул; в виде растворов или суспензий в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсий типа "масло в воде" или "вода в масле". Эти композиции, как уже упоминалось, могут быть получены любым подходящим фармацевтическим методом, включающим стадию, в которой активный ингредиент и носитель (который может состоять из одного или нескольких дополнительных ингредиентов) подвергают контакту друг с другом. В основном, указанные композиции изготавливают путем смешивания активного ингредиента с жидкостью и/или с тонкодисперсным носителем с получением однородной и гомогенной смеси, после чего этот продукт подвергают формованию, если это необходимо. Так, например, таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования порошка или гранул указанного соединения с одним или несколькими дополнительными ингредиентами, если это необходимо. Спрессованные таблетки могут быть изготовлены путем таблетирования данного соединения в свободнотекучей форме, такой как, например, порошок или гранулы, и если это необходимо, путем смешивания со связующим агентом, замасливателем, инертным разбавителем и/или одним (или несколькими) поверхностно-активными веществами/дисперигирующими агентами в подходящем устройстве. Сформованные таблетки могут быть изготовлены путем формования, в соответствующем устройстве, в котором данное соединение присутствует в порошкообразной форме и смачивается инертным жидким разбавителем.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального (подъязычного) введения представляют собой таблетки для рассасывания, которые содержат перцихиннин с отдушкой, обычно сахарозой, и аравийскую камедь или трагакант, и пастилки, которые содержат соединения, включенные в инертную основу, такую как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.

Подходящие фармацевтические композиции для парентерального введения представляют собой предпочтительно стерильные водные препараты перцихиннина, которые являются предпочтительно изотоническими по отношению к крови конкретного реципиента. Эти препараты предпочтительно вводят внутривенно, хотя они могут быть также введены посредством подкожной, внутримышечной или внутрикожной инъекции. Предпочтительно, эти препараты могут быть изготовлены путем смешивания данного соединения с водой, стерилизации полученного раствора и придания полученному раствору изотоничности с кровью пациента. Инъецируемые композиции настоящего изобретения обычно содержат от 0,1 до 5 мас.% активного соединения.

Подходящие фармацевтические композиции для ректального введения предпочтительно изготавливают в форме одноразовых суппозиториев. Они могут быть получены смешиванием перцихиннина с одним или несколькими стандартными твердыми носителями, например маслом какао, и формованием полученной смеси.

Подходящие фармацевтические композиции для наружного нанесения на кожу предпочтительно изготавливают в виде мази, крема, лосьона, пасты, спрея, аэрозоля или масла. В качестве носителей могут быть использованы вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты и комбинации из двух или нескольких указанных веществ. Активный ингредиент обычно присутствует в концентрации от 0,1 до 15 мас.%, например, от 0,5 до 2 мас.% от массы данной композиции.

Возможно также чрезкожное введение. Подходящие фармацевтические композиции для чрезкожного введения могут быть изготовлены в виде одноразовых пластырей, которые являются подходящими для продолжительного непосредственного контакта с эпидермисом пациента. Пластыри такого типа обычно содержат активный ингредиент в водном растворе, который является забуференным, если это необходимо, растворенным и/или диспергированным в адгезиве или диспергированным в полимере. Подходящая концентрация активного ингредиента составляет примерно 1%-35%, предпочтительно, примерно 3%-15%. В качестве конкретной альтернативы, активный ингредиент может высвобождаться посредством электротранспорта или ионофореза, как описано, например, в Pharmaceutical Research, 2(6):318 (1986).

Нижеследующие примеры приводятся в иллюстративных целях и не ограничивают объема настоящего изобретения.

Пример 1.

Поддерживание культуры ST 001837

а) Состав поддерживающей среды

После тщательного растворения ингредиентов путем нагревания, полученный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 минут и распределяли по чашкам Петри (15 мл/чашку). После отверждения чашки инокулировали исходной культурой и инкубировали при 25°С до тех пор, пока не наблюдался хороший рост. Эти хорошо растущие культуры были использованы для следующих стадий консервации.

Поддерживающая среда	%
Солодовый экстракт	2,00
Дрожжевой экстракт	1,00
Глюкоза	1,00
(NH4) 2HPO4	0,05
Агар-агар	2,00

b) Консервация при - 135°С:

1,5 мл стерильного 10% раствора ДМСО выливали в криососуды емкостью 2 мл. Кусок агара 2 см², взятый из чашки с поддерживающим агаром, добавляли к раствору ДМСО, проводили стадию замораживания (1°С в минуту) и хранили при - 135°С.

c) Консервация в жидком азоте:

1,5 мл стерильного 50% глицеринового раствора выливали в криососуды емкостью 2 мл. Кусок агара 2 см² , взятый из чашки с поддерживающим агаром, добавляли к глицериновому раствору, проводили стадию замораживания (1°С в минуту) при температуре вплоть до -80°С и хранили в жидком азоте.

Пример 2.

Ферментация культуры №ST 001837 в колбах-шейкерах

Получение посевной культуры в колбах-шейкерах

Посевную среду (см. ниже) распределяли в количествах 100 мл по колбам-шейкерам емкостью 300 мл и помещали на 20 минут в автоклав при 121°С. Эти колбы охлаждали до комнатной температуры и инокулировали куском агара в 2 см², взятом из 6-дневных агаровых культур, или содержимым одного сосуда для консервации (-135°С или жидкий азот).

Инкубирование осуществляли в течение 96 часов на роторном шейкере при 140 об/мин и при 25°С.

Посевная среда	%
Жидкий кукурузный экстракт	0,50
Томатная паста	4,00
Овсяная крупа	1,00
Глюкоза	1,00
Микроэлементы	1,00 мл
рН 6,8
Раствор микроэлементов	%
FeSO 4×7Н2O	0,1000
MnSO4×1Н 2O	0,1000
CuCl2×2Н 2O	0,0025
CaCl2×2Н2O	0,0100
Н 3ВО3	0,0056
(NH4) 6Мо7O24×4H 2O	0,0019
ZnSO4×7Н 2O	0,0200

Условия продуцирования

Среду для продуцирования (см. ниже) распределяли в количестве 100 мл по колбам-шейкерам емкостью 300 мл и помещали в автоклав на 20 минут при 121°С. Колбы охлаждали до комнатной температуры и инокулировали 2 мл 4-дневной посевной культуры. Инкубирование осуществляли в течение 240 часов на роторном шейкере при 140 об/мин и при 25°С. Продуцирование ингибитора перцихиннина анализировали путем тестирования на биологическую активность в отношении ингибирования липазы, как описано в примере 6, и с помощью ВЭЖХ-анализа.

Среда для продуцирования	%
Солодовый экстракт	2,00
Дрожжевой экстракт	0,20
Глюкоза	1,00
(NH4) 2HPO4	0,05

ПРИМЕР 3.

Культивирование культуры № ST 001837 в ферментерах (12 л)

Получение посевной культуры в колбах-шейкерах

Посевную среду в количестве 500 мл распределяли в колбах Эрленмейера емкостью 2 л и помещали в автоклав на 30 минут при 121°С. Посевную культуру культивировали в указанных колбах как описано в Примере 2.

Крупномасштабная ферментация

Состав продукционной среды:

8 л продукционной среды в 12-литровом ферментере (в двух ферментерах) вместе с 1 мл (10 литровый ферментер) ^®Desmophen, используемого в качестве пеногасителя, стерилизовали in situ в течение 45 минут при 121°С, охлаждали до 25°С (±1°С) и засевали 0,5 л (6,25%, 12 литровый ферментер) посевной среды, описанной выше.

Ферментацию осуществляли при следующих параметрах:

Температура:	25°С
Перемешивание:	300 об/мин (Vtip=l,57 м/с)
Аэрация:	0,5 об/об/мин
Время сбора:	237 ч

Продуцирование ингибитора липазы, перцихиннина, определяли путем оценки ингибирования липазы как описано в примере 6. Конечный рН культурального бульона доводили до 3-4. Затем культуральный бульон собирали и центрифугировали, и соединение перцихиннин выделяли и очищали из отфильрованной культуры и мецелия методом, описанным в примере 4.

ПРИМЕР 4.

Выделение и очистка перцихиннина

Культуральный бульон (3 литра) собирали и центрифугировали для отделения мицелия (20 г) и отфильтрованной культуры. Мицелий экстрагировали метанолом (3 литрами) и активные экстракты объединяли и концентрировали при пониженном давлении до объема 50 мл. Этот неочищенный материал очищали с помощью препаративной ВЭЖХ при следующих условиях:

1) Колонка: MCl^® Gel CHP-20P (BioCart, 50×100 мм; Kronlab)

Элюент: A) H₂O В) МеОН

Градиент:	мин	%А	%В
	0	95	5
	5	95	5
	45	0	100

Скорость: 45 мл/мин

Детекция: 220 и 254 нм

Активные фракции элюировались через 17 минут. Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении и лиофилизовали.

Конечную очистку проводили с помощью препаративной ВЭЖХ при следующих условиях:

1) Колонка: Purospher Star RP-18e (5 мкм, 125×25 мм; Merck)

Элюент: А) 0,1% TFA В) СН₃CN

Градиент:	мин	%А	%В
	0	95	5
	5	95	5
	45	0	100

Скорость потока: 38 мл/мин

Детекция: 210 и 300 нм

Перцихиннинсодержащие фракции элюировались через 21 минуту. Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении и лиофилизовали.

2) Колонка: Purospher RP-18e (5 мкм, 125×25 мм; Merck)

Элюент: А) 0,1% TFA В) СН₃CN

Градиент:	мин	%А	%В
	0	80	20
	10	80	20
	10,1	75	25
	17	75	25
	17,1	70	30
	50	70	30
	55	0	100
	100	0	100

Скорость потока: 5 мл/мин

Детекция: 210 нм

Перцихиннинсодержащие фракции элюировались через 37 минут. Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении и лиофилизовали. Общий выход соединения перцихиннина из 20 г мицелия составлял 2 мг.

Физико-химические и спектральные свойства перцихиннина представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 2 1 H-ЯМР- и 13С-ЯМР-спектроскопические данные для перцихиннина в ДМСО при 300К
	1H	13C
1	-	172,97
2	-	74,24
3	-	148,37
4	5,51	120,45
5	2,73/2,57	36,99
6	4,93	78,41
7	2,54/2,37	27,05
8	5,11	117,92
9	-	134,66
10	1,60	17,77
11	1,68	25,57
12	4,01	59,39
12-ОН	4,97	-

Пример 5.

Получение и очистка липазы

Адипоциты от самцов крыс (Wistar, 220-250 г) выделяли посредством обработки коллагеназой, как описано в литературе. Жировые клетки от каждой из 10 крыс три раза промывали путем флотации с использованием 50 мл буфера для гомогенизации (25 мл Трис/HCl, рН 7,4, 0,25 М сахароза, 1мМ EDTA, 1 мМ DTT,10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл антипаина, 20 мкг/мл пепстатина). После этого добавляли 10 мл буфера для гомогенизации. Жировые клетки гомогенизировали в покрытом тефлоном стеклянном устройстве (Braun-Melsungen) при 1500 об/мин и при 15°С. Гомогенизированный продукт центрифугировали (пробирки Sorvall SM24, 500 об/мин, 10 мин, 4°С). Слой между верхним жировым слоем и осадком отделяли и снова центрифугировали. Затем выделяли верхний слой и три раза центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 45 минут при 4°С. Полученный маточный раствор добавляли к 1 г гепаринсефарозы (Pharmacia-BioTech, CL-6B, пять раз промытой 25 мМ Трис/HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl). После инкубирования в течение 60 минут при 4°С (со встряхиванием через каждые 15 минут), раствор центрифугировали (пробирки Sorvall SM24, 3000 об/мин, 10 мин, 4°С). Верхний слой доводили до рН 5,2 добавлением уксусной кислоты и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Осадки выделяли центрифугированием (пробирки Sorvall SS34, 12000 об/мин, 10 мин, 4°С) и суспендировали в 2,5 мл 20 мМ Трис/HCl, рН 7,0, 1 мМ EDTA, 65 мМ NaCl, 13% сахарозы, 1 мМ DTT, 10 мкг/мл лейпептина/пепстатина/антипаина. Суспензию диализовали в течение ночи при 4°С против 25 мМ Трис/HCl, рН 7,4, 50% глицерина, 1 мМ DTT, 10 мкг/мл лейпептина, пепстатина, антипаина, а затем абсорбировали на колонке с гидроксиапатитами (0,1 г/1 мл суспензии, уравновешенной 10 мМ фосфатом калия, рН 7,0, 30% глицерин, 1 мМ DTT). Колонку четыре раза промывали уравновешивающим буфером (поток: 20-30 мл/ч). Липазу элюировали 0,5 М калийфосфатным буфером.

Продукт диализовали и концентрировали (5-10 раз) путем ультрафильтрации (Amicon Diaflo PM 10) при 4°С. Полуочищенная липаза может храниться в течение 4-6 недель при -70°С.

Пример 6.

Анализ на биоактивность

В качестве субстрата использовали флуоресцентный липидный аналог, MOHO-NBD-ацилглицерин (NAG), который, после интеграции в фосфолипидные везикулы, изменял свою окраску с 481 нм до 550 нм. Тестируемое соединение, растворенное в ДМСО, разводили аналитическим буфером (25 мМ Трис/HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl) в отношении 1:5. К 2,5 мкл этого раствора добавляли 180 мкл обработанного ультразвуком раствора субстрата (20 мкг/мл фосфатидилхолина, 10 мкг/мл фосфатидилинозита, 50 мкг/мл NAG в аналитическом буфере). После предварительного инкубирования при 30°С в течение 15 минут добавляли 20 мкл раствора фермента, предварительно разведенного 1:2 в аналитическом буфере, и сразу измеряли поглощение при 485 нм. После 60-минутного инкубирования при 30°С поглощение определяли снова. Для оценки ферментативной активности измеряли увеличение оптической плотности при 480 нм. Определение величин IC₅₀ проводили с использованием 10 концентраций свежерастворенного тестируемого соединения. Для анализа данных использовали пакет программ GRAPHIT, Elsvier-Biosoft.

Перцихиннин обнаруживал способность к ингибированию липазы при IC₅₀=2 мкм.