средство для стимуляции процесса обучения, восстановления памяти и эмоционального статуса

Формула изобретения

Средство 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорид формулы

стимулирующее процессы обучения и восстанавливающее память и эмоциональный статус.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к средствам для стимуляции процесса обучения, восстановления памяти и эмоционального статуса и может быть использовано в экспериментальной фармакологии, а также в медицине.

Медико-технические проблемы адаптации человека к различным условиям труда предъявляют к человеческому организму и, особенно, к его нервно-психической деятельности все большие требования. Постоянно повышенное чувство ответственности, длительное психическое и физическое напряжение, увеличение количества и интенсивности воздействия отрицательных факторов могут привести к развитию астении, депрессии и, наконец, просто к умственному переутомлению, что неизбежно скажется на скорости, точности и объеме выполняемой работы. В критических ситуациях поддержание обычного уровня умственной и физической работоспособности вряд ли может быть достигнуто без применения специальных фармакологических средств.

Известны фармакологические средства, активирующие функции головного мозга и стимулирующие процессы обучения. Наиболее изученными являются вещества с медиаторным типом действия. Из препаратов, рекомендованных к практическому применению, самая большая группа средств - психостимуляторы фенаминовой группы (фенамин, центедрин, сиднокарб, помолин и др. (См. "Достижения современной фармакологии", Л., 1976, с.203-214). Несмотря на определенное положительное влияние этих препаратов, особенно новых - сиднокарба, сиднофена, на умственную работоспособность человека, уменьшение усталости, исчезновение сонливости, повышение настроения, общую активацию деятельности мозга, умеренное улучшение кратковременной памяти и воспроизведения информации, им свойственны некоторые отрицательные побочные эффекты - необходимость подбора индивидуальных доз, повышение возбудимости, активация эмоционального статуса с явлениями эйфории, возможность развития пристрастия, повышение температуры тела и артериального давления, тахикардия и т. д. Таким образом, психистимуляторы фенаминовой группы можно рассматривать преимущественно лишь в качестве средств однократного (2-3 разового) применения. Препараты этой группы часто используются в качестве стимуляторов физической работоспособности "допингового" типа (См. Машковский и др. Экспериментальное и клиническое изучение нового психостимулятора сиднокарба. Ж. "Невропатология и психиатрия, 1971, т.71, №11, с.1704-1709).

Другая группа средств с механизмом медиаторного действия - ингибиторы фосфодиэстеразы (кофеин, теофиллин, теобромин и др). Из этих препаратов в качестве психостимулятора чаще всего используется кофеин. По активности он значительно уступает препаратам предыдущей группы, но в достаточно высоких дозах дает сопоставимую стимуляцию психической деятельности, возбуждение, бессонницу, элементы эйфории. На физическую работоспособность влияет намного слабее фенамина. Действие препаратов этой группы в осложненных условиях ненадежно. Умеренное положительное влияние кофеина и других ксантинов на обучение и воспроизведение информации хорошо изучено фармакологами и физиологами. (См. "Память в механизмах нормальных и патологических реакций. Л., 1976, с.122-158).

Известны также вещества с общетонизирующим типом действия (стрихнин, коразол, нативные препараты золотого корня, лимонника и др). Для препаратов этого типа характерно повышение общего тонуса и возбудимости центральной нервной системы, в том числе сенсорных систем, и улучшение рефлекторной передачи импульсов независимо от характера медиатора. Влияние препарата на обучение - память в основном проявляется в удлинении процесса реверберации, в повышении значимости слабых раздражителей и улучшении на этой основе кратковременной памяти.

Известна также группа препаратов, улучшающих энергетический и пластический обмен мозга (психоэнергизаторы, ноолептики - мефексамид, центрофеноксин, актебрал, эуклидин, пирацетам, пировалерон, тонибрал). Препараты активируют синтез макроэргов в мозге, скорость и степень наработки РНК, белков, фосфолипидов мембран, процессы восстановления в поврежденной нервной системе. Улучшение обучаемости, памяти, способности к воспроизведению информации, особенно на фоне хронического утомления, психастений - один из наиболее ярких эффектов этих средств. Психоэнергизаторы и ноолептики малотоксичны, обычно хорошо переносятся при длительном приеме, в том числе лицами преклонного возраста, больными с патологией сердечно-сосудистой системы. Наиболее активными ноолептиками являются пирацетам и пировалерон - средства, осуществляющие прямое воздействие на мозг и улучшающие когнитивные (познавательные) процессы, такие как способность к обучению, память, внимание, а также умственную работоспособность. Эта группа препаратов также не свободна от некоторых побочных эффектов, таких как: гиперкинезия, увеличение массы тела, повышенная раздражительность, сонливость, депрессия, астения (чаще наблюдаются у пожилых людей), бессоница, повышение артериального давления.

Известна также группа синтетических актопротекторных препаратов (гутимин, амтизол, бемитил, тигурил и др.), являющихся наиболее перспективными среди потенциальных стимуляторов умственной и физической работоспособности, процесса обучения и эмоциональной сферы. К настоящему времени накоплен большой опыт клинического применения бемитила (торговое название "Бемактор") в различных областях медицины (Новости фармации. "Бемактор" - новый препарат для общемедицинской практики. Ж. "Терра Медика Нова" №4 ^'98. По материалам научных работ кафедры фармакологии ВМедА Санкт-Петербург, Россия). Препарат "Бемактор" (Биметил) является производным бензимидазола - соединения, близкого по строению к пуриновым основаниям нуклеиновых кислот - аденину и гуанину и является структурным аналогом предлагаемого изобретения. Применение бемактора при астенических синдромах различного происхождения уже через 3-5 дней приводит к уменьшению перечисленных симптомов и к появлению ощущения бодрости, к повышению активности, умственной и физической работоспособности. По выраженной противоастенической активности бемактор превосходит многие препараты, включая одно из самых эффективных и малотоксичных средств из перспективного фармакологического класса ноотропов - пирацетам (ноотропил).

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании средства, являющегося производным бензимидазола, для стимуляции процесса обучения, восстановления памяти и эмоционального статуса, достаточно надежного и безопасного для длительного применения с целью "управления" процессами запоминания - обучения - воспроизведения информации, превышающего известные средства по активности и не имеющего побочных эффектов. Задачей изобретения является также расширение арсенала средств на основе производных бензимидазола, являющихся наиболее перспективными среди потенциальных стимуляторов умственной и физической работоспособности.

Для решения поставленной задачи предложено средство 2 -аллилтиобензимидазола гидрохлорид формулы

стимулирующее процессы обучения и восстанавливающее память и эмоциональный статус.

Сущность предложенного изобретения заключается в том, что синтезировано новое, неизвестное ранее соединение - 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорид (далее соединение (1). Получение заявляемого средства осуществляют в 3 стадии.

1-ая стадия: Получение технического 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорида (соединения 1).

Соединение (1) синтезируют из 2-меркаптобензимидазола при обработке его хлористым аллилом в абсолютном этиловом спирте при кипении. Продукт реакции извлекают кипящей 2-х н. соляной кислотой. Сушат на воздухе и выделяют в виде кристаллогидрата с одной молекулой воды. Для очистки от примесей технический 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорид очищают перекристаллизацией из 2-х н. соляной кислоты.

2-ая стадия: Получение основания 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорида.

Для очистки от примеси исходного 2-меркаптобензимидазола продукт первой стадии обрабатывают водным раствором едкого натра и превращают в основание. Примесь при этом растворяется, нерастворенное основание 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорида отфильтровывают.

3-я стадия: Получение фармакопейного 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорида.

Полученное на 2-ой стадии основание перекристаллизовывают из 2-х н. соляной кислоты и затем из смеси этилацетата с абсолютным этиловым спиртом. При обработке кислотой основание переходит в соль. Полученный продукт сушат на воздухе до постоянной массы.

Полученное соединение 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорид представляет собой бесцветный порошок горьковато-кислого вкуса, со слабым характерным запахом. Практически нерастворим в воде, трудно растворим в хлороформе, легко растворим в 95% спирте и в безводной уксусной кислоте. Температура плавления 137-140°С. Эмпирическая формула C₁₀H₁₀N₂ S·HCl·H₂O. Молярная масса 244,75. Количественный синтез представлен в примере 1.

Далее изобретение поясняется с помощью иллюстраций, где:

на фиг.1 показано влияние соединения (1) на прочность фиксации навыка в долговременной памяти - по воспроизведению УРАИ в разные сроки обучения;

на фиг.2 представлен УФ-спектр соединения (1).

Методом УФ-спектроскопии в области 220-400 нм подтверждена подлинность заявленного соединения (1). УФ-спектр поглощения 0,001% раствора препарата в воде имеет три максимума поглощения: при 250±2 нм, 285±2 нм, 292±2 нм. Пример 2.

Для подтверждения активности и эффективности соединения (1) была проведена сравнительная оценка заявленного и известных средств при обучении животных. Были изучены препараты фенаминового ряда (фенамин, сиднокарб, центедрин), психоэнергизатора и ноолептики (мефексамид, тонибрал, пирацетам и др.), стимуляторы (кофеин, стрихнин, коразол), группа производных бензимидазола (бемитил, заявленное соединение 1 и др.), прочие стимуляторы. Всего исследованию подвергнуто 96 соединений. Опыты проводились на крысах-самцах массой 175±15 граммов. До начала эксперимента у всех животных оценивался эмоциональный статус по методу Кинга. Эмоционально лабильные и заторможенные особи (обычно менее 10%) из дальнейших опытов исключались. Исследования проведены в несколько этапов:

1. Процесс обучения - выработка условного рефлекса активного избегания.

Все вещества вводились внутрибрюшинно за 60 минут до выработки условного рефлекса активного избегания (УРАИ) в арифметически возрастающих дозах (5, 10, 20, 40 мг/кг и т.д.) - от практически не работающей дозы, через оптимальную дозу для данного препарата, до дозы, вызывающей выраженный токсический эффект. УРАИ вырабатывался в специально построенной У-образной камере с равнозначными отсеками. Он заключался в побежке животного после подачи импульсного тока (1,5 Гц, 40 В) на сетку пола в первый "посадочный" отсек с выбором одного из двух других отсеков: темного, где на пол также подавался ток, или освещенного, ненаказуемого болевым раздражителем. За критерий обученности принимался 6-7-кратный последовательный правильный выбор животными освещенного отсека за 1-3 секунды, не сопровождающийся межсигнальными реакциями. В таблице 1 представлены результаты предварительного сравнения средств, в их оптимальных, с точки зрения влияния на обучение - память, дозах. Основным качественным показателем, характеризующим эффективность и быстроту процесса обучения, является число побежек (число предъявлений животному условий ситуации), необходимых для достижения критерия обученности. Именно этот показатель (а не общее время, затраченное на обучение) свидетельствует о реальной скорости оценки ситуации, выбора, формирования и удержания в кратковременной памяти правильного решения, возможности использовать только это решение по ходу короткого опыта. Анализ данных таблицы 1 показал, что соединение 1 обладает высокой степенью эффективности и позволяет сократить среднее число побежек до 6,15±0,15. В контроле критерий обученности достигается в среднем на 12,07±0,90 побежке. Второй показатель - среднее время, затраченное на все обучение (или рассчитанное на одну побежку), отражает в большей мере общий тонус центральной нервной системы (ЦНС), ее возбудимость и двигательную активность животного. Характерно, что препараты, эффективно снижающие число побежек до критерия обученности у крыс, как правило, резко сокращают и общее время обучения. Это сокращение обусловлено уменьшением числа побежек и числа ошибочных решений, среднее время, затрачиваемое на каждую побежку меняется меньше.

О степени положительного влияния препаратов на воспроизведение навыка можно судить по тем же двум показателям - среднему числу побежек, необходимому животным для напоминания ситуации и предъявления ими критерия обученности, и затраченному на это времени. Из таблицы 1 очевидно, что соединение формулы 1 является эффективным - для напоминания ситуации и воспроизведения УРАИ необходимо 1,6±0,10 побежек и 40±5 секунд до выдачи критерия обученности. В таблице 2 представлено сокращение среднего числа побежек (предъявления условной ситуации), необходимых для выработки критерия обученности под влиянием заявленного соединения формулы 1 и аналогичных средств, обладающих очень высокой, высокой и средней степенью эффективности. Поскольку заявители ставят перед собой задачу расширения арсенала средств на основе производных бензимидазола, то дальнейшее сравнение ведется с препаратами других групп, стимулирующих процесс обучения и восстанавливающих память и эмоциональный статус.

2. Анализ динамики УРАИ.

Для анализа динамики формирования УРАИ (см. таблицы 3, 4) процесс обучения был условно поделен на несколько этапов, в границах которых высчитывалось среднее время одной побежки и количество совершенных ошибок. Такими этапами являлись: 1-5, 6-10, 11-15, 16-20 побежек. Полученные данные показывают, что соединение (1) по своему действию на первом этапе обучения мало отличается от лучших ноолептиков (пирацетам, мефексамид), но статистически значимо улучшает процесс в сравнении с контролем и психостимуляторами. Наиболее важным является то, что соединение (1) уже с 6-ой побежки резко сокращает % ошибочных решений. С 11-ой побежки ошибки в этой группе обучаемых практически исчезают, составляя в контроле 31%. Из препаратов сравнения лучшим оказался пирацетам.

3. Процесс воспроизведения УРАИ.

Поскольку процесс воспроизведения УРАИ протекает значительно быстрее, чем первичное обучение, он был условно разделен на более короткие этапы: 1-2, 3-4, 5-6 побежек. В пределах этапов были определены затраты времени животными на одну побежку, подсчитано количество ошибок, совершенных в течение 6 побежек (в этом интервале УРАИ воспроизводился у 95% обученных крыс), и число животных, достигших критерия обученности с 1-ой побежки. Полученные данные представлены в таблице 5. Данные в таблице 5 показывают, что главное преимущество соединения (1) над препаратами сравнения проявилось в виде наиболее высокого в этой группе числа животных, достигших критерия обученности с первой побежки (76%).

4. Влияние соединения (1) на воспроизведение информации, хранимой в долговременной памяти.

Для изучения влияния соединения (1) на динамику процесса консолидации был использован метод одноразового обучения крыс (один удар тока), ведущий к появлению и частичному запоминанию эмоции страха перед болевым воздействием в данной обстановке. В результате формируется условно-рефлекторная реакция пассивного избегания (УРПИ), отличающаяся от УРАИ тем, что последняя формируется путем многократного сочетания условного (свет) и безусловного (боль) раздражителей. Исследования проведены на 360 белых крысах-самцах массой 180±10 г. Выработка УРПИ проводилась в камере из 2-х отсеков: большого темного с электрофицированным полом и меньшего ярко освещенного. Болевое раздражение в виде однократного удара током (40 вольт, 2 сек) наносилось через 25 секунд после забегания крысы в темный отсек, после чего животное сразу же извлекалось. В последующем через разные интервалы времени (для каждого интервала - отдельная группа из 20 крыс) оценивалась способность животных воспроизвести ситуацию при повторном (один раз) помещении в светлый отсек и, как следствие, запоминания ситуации, больше или меньше времени задержаться в нем. Максимальное время наблюдения составило 5 минут. Для опыта использовали животных после предварительного отбора: в эксперимент брались только те из них, которые задерживались в светлом отсеке не более 30 сек (биологическое стремление крысы уйти в темноту). При этом ток на пол в темном отсеке не подавался.

За час до посадки в камеру и одноразового болевого воздействия под кожу вводилось соединение (1) в количестве 20 мг/кг, крысам контрольной группы - физиологический раствор. Оценка запоминания проводилась по вероятностному принципу: определялся % животных в группе, не забежавших в темный отсек, а также среднее время задержки животных данной группы в освещенном отсеке в течение периода наблюдения. Динамика консолидации УРПИ и ее изменение под влиянием соединения (1) представлены в таблице 6. Результаты опытов показали, что способность животных помнить и воспроизводить кратковременное эмоциональное состояние в экспериментальной ситуации имеет волнообразную динамику: в течение ближайших 60 сек животные демонстрируют высокий уровень кратковременной памяти (число животных, прочно помнящих ситуацию, достигает 72-84%). Затем в течение ближайшего часа способность животных контрольной группы к воспроизведению УРПИ резко падает (этап кратковременной памяти полностью себя исчерпывает к 5 часу), а затем эта способность восстанавливается (этап консолидации следа в долговременной памяти) и достигает максимума через 24 часа, удерживается до 4-х суток на уровне 40-41,5%, после чего быстро угасает. Под влиянием соединения 1 способность к воспроизведению УРПИ на этапе консолидации следа не опускается ниже 40%, причем данные в этом интервале времени (1-2 часа) соответствуют лучшим результатам в контроле. После второго часа начинается подъем кривой и к 5-и часам (наихудшие данные в контроле) воспроизводимость в опыте превосходит контроль в 2,5 раза. Четко выраженный пик (62%) наступает в 24-часовой точке. Таким образом, данные показывают выраженное стимулирующее влияние соединения (1) на внутренние механизмы консолидации следа, а именно на ускорение биосинтетических процессов, которые лежат в основе перевода информации на долговременное хранение.

5. Оценка влияния соединения (1) на прочность фиксации УРАИ в долговременной памяти.

Наиболее удобной моделью для оценки прочности фиксации УРАИ в долговременной памяти после однократного обучения является естественная амнезия. Опыты выполнены на 64 крысах-самцах массой 170±5 г. Проверка сохранности УРАИ проводилась на разных группах животных через 1, 5, 10 и 20 суток после дозированного (15 побежек) обучения. Соединение (1) вводилось однократно (20 мг/кг в/бр) за час до первичного обучения, животные контрольной серии получали физраствор. Результаты опытов приведены на фиг.1. Полученные данные свидетельствуют о резких различиях в способности животных опытной и контрольной групп к воспроизведению УРАИ. Эта динамика в основном обусловлена временной амнезией у крыс контрольной группы (ухудшение воспроизведения УРАИ по числу побежек и времени примерно в 2,5 раза). У животных опытной группы под влиянием соединения (1) УРАИ не угасает: число побежек через сутки после обучения - 2,24±0,21, через 20 суток - 2,1±0,18, общее время до воспроизведения УРАИ - 110 и 45 сек соответственно. Таким образом, соединение (1) значительно ослабляет действие амнезирующих факторов на прочность фиксации навыка в долговременной памяти.

Вышеописанные опыты повторяли при намеренном усложнении формы обучения:

- градуральное (дробное) обучение (ежедневное повторное обучение крыс каждый раз в "дозе", недостаточной для их полного обучения). Результаты представлены в таблице 7. Соединение (1) значительно ускорило процесс формирования условного рефлекса у крыс: 80% из них полностью обучились к 3-му дню против 50% в контроле;

- переобучение животных по методу В.А.Батурина (после каждых 10 побежек меняется правильное - не наказуемое током - направление побежки). Результаты представлены в таблице 8. Сравнение эффективности препаратов при переобучении показало более выраженное положительное влияние соединения (1) по большинству показателей, характеризующих переобучение. Соединение (1) снижает % задержек животных в исходном отсеке (быстрее формируется установочная реакция, уменьшается страх) и число ошибочных побежек, среднее время обучения и увеличивает % обучившихся крыс. По этим основным показателям соединение (1) в 1,5-2 раза превосходит пирацетам;

переобучение крыс при изменении условного раздражителя (темнота-свет) через каждые 10 побежек. Положительное подкрепление (отсутствие ударов током) создавалось то в освещенном, то в темном отсеках камеры. Результаты представлены в таблице 9. Результаты показывают, что под влиянием соединения (1) значительно ускоряется процесс формирования условного рефлекса по всем показателям.

6. Установление оптимальной дозы и длительности эффекта соединения (1) при пероральном и парентеральном путях их введения.

Опыт проводился по обычной методике обучения крыс в У-образном лабиринте. О действии препарата судили по снижению числа побежек, необходимых для выработки критерия обученности. Введение соединения (1) осуществляли в разных дозах, разным путем и в разные сроки. Исследования проведены на 19 группах крыс (по 10 в группе) массой 180±5 грамм. Полученные данные представлены в таблице 10. Соединение (1) достаточно хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта у крыс, при этом оптимальная доза, активирующая обучение при пероральном пути введения, лишь в 3 раза выше таковой при внутрибрюшинном введении, приближающимся по своим характеристикам к внутривенному. Пик действия при пероральном введении смещается на час и приходится на 2-часовую точку, продолжительность эффекта в пределах 3-4 часов. Соединение (1) обладает достаточной широтой действия. Так, при внутрибрюшинном введении увеличение дозировки в 6 раз (с 20 до 120 мг/кг) все еще оказывает положительное влияние на обучение.

7. Оценка влияния соединения (1) на обучение - память - воспроизведение информации животных в осложненных условиях.

Исследование проводилось путем моделирования:

- гипоксической гипоксии, имитирующей условия высокогорья;

- сильного и продолжительного эмоционально-болевого стресса в хроническом эксперименте;

- черепно-мозговой травмы разной степени тяжести.

При моделировании гипоксической гипоксии опыты выполнялись на имитированной высоте 8000 м (барокамера). Животные опытной группы за 60 мин до опыта получали внутрибрюшинно соединение (1) в дозе 20 мг/кг. Опыты проводили в 2-х вариантах: выработка УРАИ на "высоте" с последующей проверкой сохранности рефлекса через 24 часа на "уровне моря" и выработка УРАИ на "уровне моря" и проверка сохранности рефлекса через 24 часа на "высоте". Результаты опытов приведены в таблице 11. Из полученных данных видно, что соединение (1) на модели сравнительно кратковременного нарушения высшей нервной деятельности (ВНД) животных в условиях тяжелой гипоксической гипоксии практически сняло отрицательное влияние на обучение и воспроизведение навыка в отличие от животных контрольной группы, у которых воспроизведение ранее выработанного УРАИ на "высоте" ухудшается примерно в 1,5 раза, что свидетельствует о затруднении извлечения информации, хранящейся в долговременной памяти.

Сильный и продолжительный эмоционально-болевой стресс вызывался подвешиванием крыс за дорзальную шейную складку кожи на 24 часа. Опыты выполнялись на 30 крысах-самцах массой 185±10 граммов. Соединение (1) вводилось под кожу дважды: за час до подвешивания и через сутки - сразу после освобождения животных. Оценка элементов свободного поведения животных проводилась с использованием методики "открытого поля". Результаты опытов представлены в таблицах 12 и 13. Интактная группа животных получила в те же сроки физраствор, но не подвергалась воздействию эмоционально-болевого стресса. Полученные данные свидетельствуют о том, что предварительное введение соединения (1) восстановило обучаемость животных почти до уровня интактных животных, причем воспроизводимость навыка уже на третьи сутки даже превысила этот уровень почти вдвое. Соединение (1) также существенно противодействует снижению спонтанной двигательной активности животных в "открытом поле" в остром периоде (24 часа) и мало изменяет ее динамику в дальнейшем. Введение соединения (1) несколько улучшает состояние эмоциональной реактивности - в остром послестрессовом периоде она была снижена только в 2 раза по сравнению с интактными животными (в контроле падает в 11 раз), что связано со свойством заявленного средства быстро и значительно повышать резистентность организма к широкому кругу экстремальных воздействий, в том числе к эмоционально-болевому стрессу.

Изучение группового поведения животных при воздействии сильного стрессового фактора.

Стрессовое воздействие создавалось наложением на среднюю треть хвоста крыс "стандартного" зажима, после чего вся группа животных помещалась в отдельную клетку, где выдерживалась 24 часа. Постоянная боль, усиливающаяся при передвижениях по клетке, практически все время провоцировала у крыс агрессивное поведение (драки), исключала отдых, что способствовало усилению астенизации нервной системы и невротическим срывам. Эксперименты поставлены на 30 крысах-самцах массой 180±5 граммов. Исследование состояния DYL животных проводилось в динамике через 1 час после окончания стрессового воздействия, затем на 7-е и 14-е сутки. Опытной группе крыс подкожно вводилось соединение (1) в дозах 20 мг/кг четырежды: за час до начала стрессового воздействия, через сутки (за час до первого исследования ВНД), через 7 и 14 суток, также за час до исследования ВНД. Контрольной группе вводился физраствор. Интактной группе также вводился физраствор, но стрессовому воздействию она не подвергалась. Результаты экспериментов представлены в таблицах 14 и 15. Полученные данные свидетельствуют о том, что подопытные животные, получившие с профилактической и восстановительной целями соединение (1), продемонстрировали значительно более высокую степень обучаемости и лучшее состояние эмоциональной сферы. Все крысы выработали УРАИ в первый же день послестрессового периода, упрочение рефлекса шло даже лучше, чем у интактных животных: более 75% крыс показали полное обучение (предъявление критерия обученности с 1-2 побежки) на 1-ые сутки, все 100% - на 14 сутки. За все время наблюдения ни у одного животного не отмечено судорожных реакций при выработке рефлекса. Пищевая активность и групповое поведение не отличались от таковых у интактных животных.

Для оценки влияния соединения (1) на состояние ВНД животных в остром периоде черепно-мозговой травмы была проведена серия опытов на 200 крысах массой 190±5 граммов. Использовались методики выработки и воспроизведения УРАИ в У-образной камере, "вращающегося стержня", "открытого поля". Защитный эффект соединения (1) сравнивался с аминалоном, который предложен для лечения резидуальных явлений черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Через 48 часов после ЧМТ исследовалась способность животных к выработке УРАИ, координационная способность ("вращающийся стержень"), уровень локомоторики при обучении, спонтанная двигательная активность и эмоциональный статус. Препараты (в группе контроля - физраствор) вводились под кожу трижды: через час после ЧМТ, через 24 часа и через 48 часов (за час до проведения исследования ВНД). Результаты опытов приведены в таблице 16. Полученные данные свидетельствуют, что под влиянием лечения соединением (1) (20мг/кг) существенно изменился спектр тяжести посттравматического периода (1-48 часов) - примерно в 3 раза уменьшился % животных с тяжелым течением посттравматического периода и в 2 раза увеличился % крыс с легким течением ЧМТ. Животным с тяжелым течением ЧМТ выработать УРАИ не удается, локомоторика и эмоциональный статус значительно снижены или отсутствуют. Животным со средней тяжестью течения выработать УРАИ удается, но время выработки в 1,5-2 раза превышает таковое у интактных крыс, число ошибок увеличено. Животные с легким течение ЧМТ и признаками повышенной возбудимости мозга УРАИ вырабатывают легко, по времени в 1,5-2 раза быстрее, чем у интактных крыс, локомоторика и эмоциональный статус выражены хорошо; аминалон (200 мг/кг) оказался мало активным.

В посттравматическом периоде у животных, подвергнутых прерывистому лечению соединением (1) (инъекций на протяжении 20 суток), отмечено довольно быстрое восстановление эмоционального и моторного статуса, достаточного для выработки УРАИ у 100% животных через 4 суток после тяжелой ЧМТ. Животные адекватно реагировали на электростимуляцию, у них почти отсутствовали периоды повышенной психомоторной возбудимости и заторможенности, а также все проявления агрессии. Через 96 часов после ЧМТ обучение шло даже лучше, чем у интактных животных и по затратам времени, и по числу побежек, необходимых для выработки критерия обученности. Воспроизведение УРАИ в дальнейшем шло обычным путем.

Таким образом, эффективность соединения (1) как средства стимуляции процесса обучения, восстановления памяти и эмоционального статуса проявилась в полной мере не только в обычных, но и в осложняющих процесс обучения условиях.

Пример 1.

Стадия 1. В колбу помещается 2020 г 2-меркаптобензимедазола и 2020 мл абсолютного этилового спирта. К содержимому колбы прикапывают хлористый аллил при температуре 45°С, после чего реакционная смесь прогревается в течение 7,5 часов от 53°С до 65°С. Затем смесь хлористого аллила и спирта отгоняют до суха.

Сухой остаток экстрагируют 3 л кипящей 2-х н. соляной кислоты с добавлением 250 г активированного угля, в течение 1 часа. Полученный раствор отфильтровывают, уголь промывают 500 мл кипящей 2-х н. соляной кислотой.

Фильтрат охлаждают, полученный осадок отфильтровывают и промывают ледяной водой. Сушат на воздухе. Выход: 2241 г (65-68%).

Стадия 2. 87 г продукта, полученного в первой стадии, помещают в колбу на 300 мл и заливают 87 мл дистиллированной воды, охлаждают. Охлажденный свежеприготовленный 30% раствор NaOH прикапывают к реакционной смеси при перемешивании. Максимальная температура смешения 20°С. После окончания прикапывания смесь перемешивается в течение 3 часов. Реакция должна оставаться щелочной. Полученный осадок отфильтровывают и промывают ледяной дистиллированной водой до нейтральной реакции. Сушат в сушильном шкафу при температуре 60°С 2 часа, а потом на воздухе. Выход: 68 г (96,5%).

3-я стадия. Полученное во второй стадии основание заливают 94 мл 2-х н. соляной кислоты и 50 мл концентрированной соляной кислоты и кипятят при перемешивании на водяной бане 2 часа. Полученный раствор горячим фильтрованием отделяют от нерастворимых примесей. По мере остывания в фильтрате выпадают крупные кристаллы. Через 7-8 часов кристаллы отделяют и промывают ледяной 2-х н. соляной кислотой. Сушат на воздухе 3-4 дня. Выход: 80 г (95%).

Полученные кристаллы перекристаллизовывают из смеси этилацетата и спирта 3:1.

Кристаллы не растворяются при комнатной температуре. Смесь доводится до кипения, при охлаждении выпадает 2-аллилтиобензимидазола гидрохлорид. Выход: 25,5 г (96%).

Пример 2. В качестве испытаний на подлинность приведены УФ-спектр в воде (см. фиг.2) и 3 характерные реакции:

0,05 г препарата растворяют в 1 мл 50% спирта и прибавляют 3 капли раствора едкого натра (10 г NaOH до 100 мл Н₂О). Выпадает белый творожистый осадок, растворяющийся при добавлении еще 5 капель раствора едкого натра.

0,05 г препарата растворяют в 1 мл 50% спирта и прибавляют 2 мл смеси бромида и бромата калия (6 г бромида калия KBr и 1,7 г бромата калия KBrO₃ растворяют в 100 мл воды) и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Образуется желтая эмульсия, из которой через 1-2 минуты выделяются капли оранжевой смолы, прилипающей к стенкам пробирки.

0,05 г препарата растворяют в 1 мл 50% спирта и прибавляют 5 капель раствора йодида калия (10 г KJ растворяют в свежей кипяченой и охлажденной воде и доводят до 100 мл. Раствор должен быть бесцветным. Хранить в темном стекле, с притертыми пробками, в темноте.) и 5 капель концентрированной фосфорной кислоты (H₃PO ₄). Через 1 минуту прибавляют 1 мл раствора сульфата меди (10 г CuSO₄·5H₂O до 100 мл Н ₂О). Выпадает коричневый осадок меркаитида меди. Проведение указанных реакций является достаточным для установления подлинности препарата.

Обезвоженный препарат имеет температуру плавления 137-140°С. (Перед определением температуры плавления образец высушивают до постоянной массы при 105°С. Безводный препарат гигроскопичен.)

Измерение рН раствора проводили потенциометрическим методом. Полученное значение рН=2,3-2,9.

Обнаружение примеси исходного вещества проводили методом тонкослойной хроматографии.

Пластинку с нанесенными пробами соединения (1) и в качестве свидетеля - 2-меркаптобензимедазола высушивали в течение 2 минут при 105°С, затем помещали в камеру со смесью растворителей (см. примечание) и хроматографировали восходящим методом. Когда фронт растворителя доходил до конца пластинки, ее вынимали из камеры и сушили в сушильном шкафу при 105°С в течение 15 минут. Пластинку просматривали под ультрахемископом при длине волны 254 нм. Пятно примеси 2-меркаптобензимидазола в испытуемом препарате не превышало расположенное примерно на том же уровне пятно свидетеля по величине и интенсивности (не более 0,1% в препарате). Допускается присутствие на старте пятна хлорида аммония.

Таблица 1
Название препарата	Число животных в опыте	Оптимальная доза мг/кг	Среднее число побежек до выработки (предъявления) критерия обученности (Х±2м)		Среднее время до выработки (предъявления) критерия обученности в секундах (X±2 м)
			При обучении	Через 24 часа	При обучении	Через 24 часа
1	2	3	4	5	6	7
Контроль (физиол. раствор)	128	-	12,07±0,9	4,2±0,22	750±55	190±20
Психостимуляторы фенаминового ряда
Фенамин	24	0,5	9,75±0,6	2,62±0,15	570±40	50±5
Сиднокарб	18	5	8,9±0,41	2,71±0,15	300±35	105±10
Центедрин	16	2,5	8,63±0,35	3,00±0,15	325±30	100±10
Психоэнергизаторы и ноолептики
Мефексамид	24	10	7,45±0,15	2,10±0,10	215±20	35±5
Тонибрал	24	20	6,82±0,35	1,83±0,10	625±40	55±5
Когитум	24	250	9,10±0,22	2,85±0,10	545±45	145±15
Эуклидан	31	25	8,60±0,15	2,10±0,15	355±35	55±5
Пирацетам	38	20	7,00±0,17	1,87±0,12	360±40	50±5
Актебрал	35	25	8,50±0,21	2,45±0,11	330±35	70±5
Центрофенаксин	35	20	9,14±0,20	2,57±0,14	300±25	50±5
Панклар	28	100	10,0±0,27	3,25±0,16	400±35	105±10
Панклар Са	28	100	9,10±0,25	2,10±0,13	360±40	50±5
Стимуляторы других групп
Кофеин	10	25	10,1±0,35	2,34±0,21	325±30	65±5
Стрихнин	10	0,5	10,2±0,40	3,25±0,26	320±20	65±5
Коразол	10	0,5	9,21±0,35	3,10±0,22	305±15	50±5

1	2		3			4			5		6		7
Группа производных бензимидазола
Бемитил	24		10			6,87±0,26			2,00±0,14		400±45		40±10
Соединение формулы 1	72		20			6,15±0,15			1,60±0,10		310±20		40±5
Таблица 2.
Сокращение среднего числа побежек до
6,00-6,50				6,51-7,00				7,01-7,50
Степень эффективности препарата
Очень высокая				Высокая				Средняя
Соединение Формулы 1				Тонибрал				Мефексамид
				Пирацетам
				Бемитил
Таблица 3
Название препарата		Число животных в группе			Среднее время одной побежки (секунда) на этапах повторения условной ситуации
					1-5		6-10			11-15		16-20
Контроль		42			40		31			15		3
Соединение 1		52			21		7X			2 X		-
Пирацетам		16			24		23			6X		2
Мефексамид		16			26		20			8X		2
X/ Результаты отражают не скорость движения животных в лабиринте, а время от "старта" /начало электростимуляции/ до забегания в правильно выбранный освещенный отсек ("финиш"). Различия с контролем статистически значимы при Р<0,05.

Таблица 4.
Название препарата		Число животных в группе		% ошибочных реакций при обучении на этапах повторения условной ситуации
				1-5		6-10		11-15		16-20
Контроль		42		67		52		31		12
Соединение 1		52		47X		18X		4X		-
Пирацетам		16		49X		34X		11X		3 X
Мефексамид		16		46X		40 X		15X		7X
X/ Различия с контролем статистически значимы при P<0,05
Таблица 5.
Название препарата	Число животных в группе		% животных, воспроизведших УРАИ с 1-ой побежки		Средние затраты времени				% ошибочных реакций за 1-6 побежек
					на 1 побежку в секундах
					1-2 этапы	3-4 этапы	4-6 этапы
Контроль	64		18,7		12,1	6,0	4,2		34,5
Соединение 1	46		76		4,3	2,5	1,6		13
Пирацетам	28		52		5,5	2,1	1,2		15
Мефексамид	35		61		4,7	5,1	1,5		10

Для препаратов различия с контролем статистически значимы при Р<0,05.

Таблица 6.
Время после однократного удара током		Способность к воспроизведению ситуации
		%животных, помнящих ситуацию		Время до забегания в темный отсек (сек)
		Соединение 1	контроль	Соединение 1	контроль
Секунды	15	87,5	87,5	5650	5650
	60	84	72,5	5127	4853
минуты	10	66	54	4378	3818
	30	46,5	53	3556	3895
	60	40	36	3234	2939
часы	2	39,5	29,5	3131	2583
	3	45,5	25,5	3411	2583
	4	48,5	23	3496	2196
	5	49,5	21,5	3587	2050
	6	52	27	3768	2256
	12	53	32	3845	2482
	24	62	40	4177	2906
сутки	2	51,5	38	3601	2870
	3	46,5	41,5	3369	3257
	5	36,5	35,5	2863	3203
	7	31,5	31,5	2621	2786
	15	28,5	23,5	2389	2280

Таблица 7.
Название препарата	Дни опыта	%%животных, достигших критерия обученности на данный день X	%%ошибок при обучении	Среднее время обучения крысы (за 5 побежек) в данный день(сек)
Контроль (физраствор)	1	0	57,3	420±40
	2	20	26,7	330±32
	3	50	29	235±27
	4	70	20	45±9
	5	100	0	5±1
Соединение 1	1	0	50,7	290±30
	2	50	18,7	185±26
	3	80	6.7	65±11
	4	90	7	20±3
	5	100	0	5±1
Пирацетам	1	0	42	215±27
	2	40	23	165±23
	3	70	20	50±8
	4	90	20	15±4
	5	100	0	7±2
X/ Приводятся накопительные данные на день опыта

Таблица 8.
Название препарата	Изменение направления избегания	% обучившихся из 12 в каждой группе	Среднее время обучения сек.		% задержек рефлекса		% ошибочных побежек		Число произвольных выходов из освещенного отсека
Контроль(Физраствор)	0	0	375		21,5		53,5		11
	1	14	335		28,6		44,3		7
	2	30	250		38,5		35,8		4
	3	30	180		21,5		28,6		5
Соединение 1	0	57	245		18,2		28,6		6
	1	70	330		14,3		31,3		8
	2	70	190		7,1		30		2
	3	70	105		4,3		19,6		2
Пирацетам	0	14	345		17,2		50		3
	1	42	210		11,4		35,8		1
	2	30	145		11,4		34,3		2
	3	42	185		8,6		35,7		2
Примечание: в каждой группе по 12 крыс. Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05.
Таблица 9
Название препарата	Порядок смены условного раздражителя	%% обучившихся крыс	Среднее время обучения сек	%% задержек УРАИ		%% ошибочных побежек		Число выходов из правильно выбранного отсека
Контроль(физраствор)	Темнота	14	405	8		51		7
	Свет	28	255	4		44		6
	Темнота	14	420	2		60		2
	Свет	28	280	2		42		3
Соединение 1	Темнота	14	290	3		45		4
	Свет	84	130	1		27		2
	Темнота	56	140	0		36		2
	свет	100	130	0		28		0
Примечание: в каждой группе по 14 крыс. Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05.

Таблица 10.
Дозы мг/кг	Интервалы времени после введения соединения (1)
	30 мин			1 час		2 часа		4 часа		6 часов
Внутрибрюшинное введение
5				7,9±0,7
10				6,3±0,5
20	7,7±0,6			6,0±0,4		7,3±0,5		8,1±0,6		12,0±0,6
40				6,2±0,5
80				6,7±0,5
100				8,5±0,6
Пероральное введение
20						11,1±0,6
40						10,0±0,7
60				8,2±0,7		6,7±0,4		7,9±0,7		10,9±0,8
80						7,0±0,4
120						9,4±0,6
160						9,5±0,6
Примечание: в каждой группе по 10 крыс Различия с контролем, где критерий обученности достигается в среднем на 12,07±0,90 побежке, для соединения (1) статистически значим при Р<0,01 для дозы 20мг/кг (внутрибрюшинное введение) в интервале 30 мин - 2 часа (оптимум - 1 час), для дозы 60 мг/кг (пероральное введение) - в интервале 1-4 часа (оптимум - 2 часа).
Таблица 11
Группа животных/название препарата		Количество животных	Число побежек до предъявления критерия обученности				Общее время, затраченное на обучение или воспроизведение УРАИ (сек)
			При обучении		Через 24 часа		При обучении		Через 24 часа
Интактн.X/		20	10,6±0,3		3,8±0,15		405±30		100±20
1. Обучение в обычных условиях, воспроизведение УРАИ при гипоксии
Контроль		15	10,7±0,3		5,1±0,2		380±45		340±30
Соедин. (1)		15	5,3±0,1		3,0±0,1		160±15		120±20
2. Обучение при гипоксии, воспроизведение УРАИ в обычных условиях
Контроль		15	15,6±0,3		6,0±0,2		655±45		230±25
Соедин.(1)		15	11,1±0,25		2,6±0,1		420±37		75±10
X/ группе интактных животных вводился физраствор; Различия с контролем статистически значимы при р<0,05

Таблица 12.
Группа животн/назван. препар.	Кол. животных		Выработка и воспроизведение УРАИ в сроки после болевого воздействия
			1-е сутки			3-и сутки				7-е сутки
			Средн. число побежек		Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ	Средн. число побежек		Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ		Средн. число побежек	Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ
Интактные	10		11,4±		450±	4,4±		210±		1,3±	70±
			0,8		40	0,5		25		0,1	10
Контроль	10		0		0	6,2±0,6		355±40		2,1±0,3	130±25
Соединение 1	10		14,1±		420±	2,4±		160±		1,2±	75±
			0,9		50	0,4		20		0,1	10
0 - выработка УРАИ возможна у 30% крыс Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05
Таблица 13
Группа животных/название препарата		Количество животных		Время после эмоционально-болевого стресса
				1-е сутки			3-и сутки		7-е сутки
Спонтанная двигательная активность
Интактные		10		14,3±1,4			8,7±1,1		7,2±1,2
Контроль		10		3,2±0,3			5,4±0,7		4,6±0,6
Соединение 1		10		8,9±1,1			6,6±0,8		4,4±0,6
Эмоциональный статус (число болюс)
Интактные		10		5,7±1,0			4,2±0,7		2,1±0,5
Контроль		10		0,5±0,1			3,5±0,7		6,1±0,7
Соединение 1		10		2,7±0,4			3,2±0,4		2,0±0,5
Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05

Таблица 14.

Группа животн/назван. препар.

Кол. животных

Выработка и воспроизведение УРАИ в сроки после стресса

1-е сутки

7-е сутки

14-е сутки

Средн. число побежек

Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ

Средн. число побежек

Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ

Средн. число побежек

Средн. время до выработки или воспроизведения УРАИ

Интактные

10

11,8±

425±

5,8±

70±

1,4±

50±

0,9

45

0,5

15

0,1

10

Контроль

10

00

00

0

610±

9,1±

325±

70

0,7

45

Соединение 1

10

15,7±

730±

3,8±

45±

1,1±

20±

1,1

60

0,3

20

0,1

5

00 - выработка УРАИ невозможна у 100% крыс 0 - выработка УРАИ невозможна у 50% крыс Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05

Таблица 15

Группа животных/название препарата

Количество животных

Время после группового эмоционально-болевого стресса

1-е сутки

7-е сутки

14-е сутки

Спонтанная двигательная активность

Интактные

10

16,5±1,6

10,1±1,2

4,1±0,6

Контроль

10

10,8±1,1

9,0±1,1

5,5±0,6

Соединение 1

10

20,0±1,8

9,2±1,0

4,9±0,5

Эмоциональный статус (число болюс)

Интактные

10

5,0±1,0

2,8±0,5

0,6±0,1

Контроль

10

0,8±0,1

4,7±0,8

6,1±0,9

Соединение 1

10

1,2±0,3

2,5±0,3

1,0±0,2

Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05

Таблица 16.
Группа животных/Название препарата	Общее число крыс с ЧМТ	Из них выжило через 48 часов	Распределение в подгруппах по тяжести течения
			тяжелое	средней тяжести	легкое
Контроль	70	36(51%)	17(47%)	11(30%)	8(22%)
Соединение (1)	85	46(54%)	8(17%)	18(39%)	20(44%)
Аминалон	45	25(55%)	12(46%)	5(20%)	8(32%)
Итого	200	107(54%)	37	34	36
Выработка УРАИ в группах с разной степенью тяжести ЧМТ
Среднее число побежек			-	11,8±0,4	5,6±0,4
Среднее время одной побежки, сек			-	119,6±27	53,0±21
Число ошибок (1-10 побежек),			100	57,6	27,9
%% отказов обучаться			100	-	-
Для соединения (1) различия с контролем статистически значимы при Р<0,05