новое антитело со специфичностью к злокачественной опухоли толстой кишки

Формула изобретения

1. Связывающая структура для лечения и диагностики различных злокачественных опухолей и злокачественных заболеваний человека, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток, где указанная связывающая структура преимущественно представлена CDR-структурами тяжелой цепи, определяемыми, по существу, аминокислотами 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, а дополнительная специфичность связывания обеспечивается одной или несколькими CDR-структурами легкой цепи, определяемыми, по существу, аминокислотами 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2.

2. Связывающая структура для лечения и диагностики различных злокачественных опухолей и злокачественных заболеваний человека, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток, где указанная связывающая структура включает одну или несколько последовательностей, определяющих комплементарность областей (CDR) антитела в легкой цепи, содержащей, по существу, аминокислоты 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и CDR-последовательностей в тяжелой цепи, содержащей, по существу, аминокислоты 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2.

3. Связывающая структура по п.1 или 2, содержащая все указанные CDR-последовательности.

4. Связывающая структура по любому из пп. 1-3, которая представляет собой антитело и/или его фрагменты.

5. Связывающая структура по п.1 или 2, представляющая собой антитело и/или его фрагменты, а также содержащая вариабельную область легкой цепи, содержащей, по существу, аминокислоты 1-110 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащей, по существу, аминокислоты 130-249 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2.

6. Связывающая структура по п.5, где указанное антитело содержит всю аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2.

7. Связывающая структура по п.1 или 2, которая сильно и/или гомогенно связывается в опухолевых эпителиальных клетках и/или с поверхностью опухолевых эпителиальных клеток, выбранных из группы, включающей первичные и/или метастатические клетки карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких.

8. Связывающая структура по п.1 или 2, которая слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с клетками карциномы почек и/или предстательной железы, и/или злокачественной меланомы.

9. Связывающая структура по п.1 или 2, которая сильно связывается с апикальными участками поверхности эпителия толстой кишки и эпителия тонкого кишечника.

10. Связывающая структура по п.9, которая связывается с апикальной частью клеточной поверхности микроворсинок и/или щеточной каемки клеток поверхностного эпителия толстой кишки.

11. Связывающая структура по п.1 или 2, которая слабо и/или умеренно связывается с железистым эпителием молочной железы и/или с окружающей его соединительной тканью.

12. Связывающая структура по п.1 или 2, которая слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с нормальными тканями, включая ткани селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы и/или ЦНС.

13. Связывающая структура по п.1 или 2, которую получают путем фагового отбора.

14. Связывающая структура по п.13, где указанный фаговый отбор предусматривает использование комбинации предварительно иммунологически отобранного in vivo набора связывающих структур, представленных на фаговых частицах, и субтрактивный отбор фаговых частиц с использованием пар тканей с различными фенотипами.

15. Связывающая структура по п.1 или 2, где указанными последовательностями являются последовательности, происходящие от макака-крабоеда (Масаса fascicularis).

16. Связывающая структура по п.1 или 2, где указанные аминокислотные последовательности могут быть, по крайней мере, на 78% (Vl) и на 86% (Vh) идентичны соответствующим аминокислотным последовательностям человека.

17. Связывающая структура по п.1 или 2, которая имеет низкую иммуногенность или вообще не имеет иммуногенности у человека.

18. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была дериватизирована посредством генетического связывания с полипептидами, и/или посредством химического конъюгирования с органическими или неорганическими химическими молекулами, и/или посредством ди-, олиго- или полимеризации.

19. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была генетически лигирована или химически конъюгирована с цитотоксическими полипептидами или с цитотоксическими органическими или неорганическими химическими молекулами.

20. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была генетически связана или химически конъюгирована с биологически активными молекулами.

21. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была генетически связана или химически конъюгирована с иммуноактивирующими молекулами.

22. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была модифицирована для повышения или снижения ее авидности и/или аффинности.

23. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была модифицирована для увеличения ее выхода.

24. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была модифицирована для изменения ее фармакокинетических свойств.

25. Связывающая структура по п.1 или 2, которая была модифицирована для сообщения ей новых фармакокинетических свойств.

26. Связывающая структура по п.1 или 2, которая является меченой и связывание которой является специфическим и ингибируется немеченой формой указанной связывающей структуры, но не другими связывающими структурами, причем указанная структура не ингибирует связывание других связывающих структур, имеющих другие специфичности.

27. Последовательность ДНК, кодирующая антитело по п.6, где указанная последовательность ДНК содержит последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1.

28. Фармацевтическая композиция для лечения и диагностики различных злокачественных опухолей и злокачественных заболеваний человека, содержащая в качестве действующего начала связывающую структуру по любому из пп.1-26.

29. Способ in vitro гистопатологической диагностики и прогнозирования злокачественных заболеваний человека, где образец подвергают контакту со связывающей структурой по любому из пп. 1-26 и с индикатором.

30. Способ по п.29, где указанным образцом является образец тканей, который перед взятием среза был заморожен и/или фиксирован формалином и залит парафином.

31. Способ по п.29, где указанный способ предусматривает типирование опухоли.

32. Способ по п.29, где указанный способ предусматривает скрининг опухоли.

33. Способ по п.29, где указанный способ предусматривает диагностику и прогнозирование развития опухоли.

34. Способ по п.29, где указанный способ предусматривает мониторинг состояний, предшествующих образованию злокачественной опухоли.

35. Способ in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественных заболеваний человека, предусматривающий определение концентраций связывающей структуры по любому из пп.1-26 в физиологических жидкостях.

36. Способ in vivo-диагностики и прогнозирования злокачественных заболеваний человека, предусматривающий определение локализации связывающей структуры по любому из пп.1-26 в опухолевых отложениях у обследуемого пациента.

37. Способ по п.36, где перед указанным определением индивидууму вводят указанную связывающую структуру.

38. Способ по п.37, где указанная связывающая структура накапливается в опухолевых отложениях.

39. Способ по любому из пп.36-38, который является количественным.

40. Способ лечения злокачественного заболевания человека, где индивидууму вводят связывающую структуру по любому из пп.1-26.

41. Способ по п.40, где указанную связывающую структуру модифицируют посредством генетического связывания с молекулой с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами.

42. Способ по п.40, где указанную связывающую структуру модифицируют посредством дериватизации.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток; к структуре-мишени, присутствующей и/или экспрессируемой в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток; к связывающей структуре, которая распознает и блокирует указанную структуру-мишень; к веществу, которое связывается с указанной структурой-мишенью или блокирует экспрессию указанной структуры-мишени; к фармацевтическим композициям, содержащим указанную связывающую структуру, структуры-мишени или вещество в качестве действующего начала; к вакцинным композициям, включающим указанные структуры-мишени в качестве действующего начала; к способу отбора фага; к способам in vitro- и in vivo-диагностики и прогнозирования, а также лечения злокачественных заболеваний человека, предусматривающим использование вышеуказанных веществ.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансформация нормальных клеток в клетки злокачественных опухолей ассоциирована с генотипическими и/или фенотипическими изменениями как трансформируемых клеток, так и микроокружения растущей опухоли (Kerbel R.S., 1995). В принципе, некоторые из этих изменений могут распознаваться иммунной системой как опухолеспецифические антигены (TSA) и могут служить основой для опухолеспецифической иммунотерапии. Хотя явления мутаций, лежащие в основе возникновения опухоли и туморигенеза, могут приводить к экспрессии TSA как таковые, однако, вторичные изменения, такие как нарушение регуляции экспрессии и посттрансляционные модификации нормальных антигенов, могут приводить к образованию множества опухолеассоциированных антигенов, которые могут быть использованы в качестве мишеней для иммунотерапии.

Молекулы, ассоциированные с опухолевым фенотипом, могут быть идентифицированы с использованием современных технологий геномики и протеомики, которые предусматривают непосредственное применение самих этих мишеней для идентификации молекулярных модификаций и изменений уровней экспрессии (Williams K.L., 1999). В более косвенном методе опухолеассоциированные антигены (ТАА), характеризующие фенотип опухоли, были также идентифицированы с использованием моноклональных антител, образованных из гибридомы (Kohler G., Milstein С., 1976).

Технология фагового дисплея стала уже известной альтернативой гибридомной технологии, а для некоторых применений она даже является альтернативой методу генерирования моноклональных антител по принципу управляемого антигеном отбора, отличающегося от метода чистого скрининга (Hoogenboom H.R. et al., 1998). Эта технология основана на использовании бактериофаговых частиц, которые несут на своей поверхности конкретный фрагмент антитела, кодируемый их геномом, что позволяет проводить отбор фага и его кодирующей ДНК как генетической упаковки. В случае, если были получены праймеры, комплементарные генам вариабельной тяжелой и легкой цепи антитела, то гены этого антитела, предназначенные для встраивания в фаговые векторы, могут быть амплифицированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в иммунокомпетентном или неиммунокомпетентном животном любого вида, и может быть сконструирована большая фаговая библиотека антител.

Для отбора фаговых библиотек на клетках получают тканевые срезы и другие биологические материалы, которые генерируют моноклональные антитела или пептиды, связывающиеся с компонентами в используемых сложных антигенных материалах (Hoogenboom H.R. et al., 1998, Tordsson J. et al., 1997). Результатом прямого позитивного отбора с использованием сложных антигенов является отбор специфичностей из общего набора тканевых специфичностей со сдвигом в сторону высокоэкспрессируемых и иммунодоминантных антигенов вплоть до антигенов с высокоаффинными взаимодействиями. Для более точной идентификации дифференциально экспрессированных антигенов, являющихся репрезентативными для данного фенотипа, необходимо использовать субтрактивные подходы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к связывающей структуре, такой как антитело, связывающееся с опухолевыми клетками, а в частности, с эпителиальными опухолевыми клетками, такими как клетки карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких. Настоящее изобретение также относится к структурам-мишеням, присутствующим и/или экспрессируемым в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также относится к новому субтрактивному способу отбора с использованием тканевых срезов или комбинаций срезов тканей и клеток в качестве материалов для отбора фага.

Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток и которая преимущественно представлена CDR-структурами тяжелой цепи, определяемыми в основном аминокислотами 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; а дополнительная специфичность связывания обеспечивается одной или несколькими CDR-структурами легкой цепи, определяемыми в основном аминокислотами 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток и которая включает одну или несколько последовательностей гипервариабельных участков (определяющих комплементарность областей) (CDR) антитела в легкой цепи, содержащей в основном аминокислоты 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, и CDR-последовательностей в тяжелой цепи, содержащей в основном аминокислоты 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура содержит все указанные последовательности CDR.

В другом варианте осуществления изобретения указанной связывающей структурой является антитело и/или его фрагменты, которые в других вариантах осуществления изобретения включают вариабельную область легкой цепи, содержащей в основном аминокислоты 1-110 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащей в основном аминокислоты 130-249 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей. В еще одном варианте осуществления изобретения указанное антитело содержит всю аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей.

В одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура сильно и/или гомогенно связывается в эпителиальных опухолевых клетках и/или с поверхностью эпителиальных опухолевых клеток, выбранных из группы, состоящей из первичных и/или метастатических клеток карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с клетками карциномы почек и/или предстательной железы, и/или злокачественной меланомы. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура сильно связывается с апикальными участками поверхности эпителия толстой кишки и эпителия тонкого кишечника. В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура связывается с апикальным участком клеточной поверхности микроворсинок и/или щеточной каемки клеток поверхностного эпителия толстой кишки. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или умеренно связывается с эпителием молочной железы и/или с окружающей ее соединительной тканью.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с нормальными тканями, включая ткани селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы и/или ЦНС.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанную связывающую структуру получают путем фагового отбора, где указанный отбор фага в другом варианте осуществления изобретения предусматривает использование комбинации предварительно иммунологически отобранного in vivo спектра связывающих структур, отображенных на фаговых частицах, и субтрактивного отбора фаговых частиц с использованием пар тканей с различными фенотипами. В другом варианте осуществления изобретения указанными последовательностями являются последовательности, происходящие от макака-крабоеда (Масаса fascicularis), где указанные аминокислотные последовательности могут быть, по крайней мере, на 78% (Vl) и на 86% (Vh) идентичны соответствующим аминокислотным последовательностям человека.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура имеет низкую иммуногенность или вообще не имеет иммуногенности по отношению к человеку.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура была дериватизирована посредством генетического лигирования с полипептидами и/или посредством химического конъюгирования с органическими или неорганическими химическими молекулами, и/или посредством ди-, олиго- или полимеризации.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура генетически лигирована или химически конъюгирована с цитотоксическими полипептидами или с цитотоксическими органическими или неорганическими химическими молекулами; или с биологически активными молекулами; или с иммуноактивирующими молекулами.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура модифицирована для повышения или снижения ее авидности и/или аффинности; или для увеличения ее продуктивности; или для изменения ее фармакокинетических свойств; или для сообщения ей новых фармакокинетических свойств.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура является меченой, и ее связывание является специфическим и ингибируется немеченой формой указанной связывающей структуры, но не другими связывающими структурами, причем указанная не ингибирует связывание других связывающих структур, обладающих другими специфичностями.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей антитело, определенное выше, то есть антитело, содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, где указанная последовательность ДНК включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 в Списке последовательностей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к структуре-мишени, обнаруживаемой и/или экспрессируемой в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток, где указанная структура-мишень может быть специфически связана связывающей структурой и способна специфически связываться со связывающей структурой, определенной выше, и с другими связывающими структурами, имеющими аналогичные связывающие свойства.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная структура-мишень способна специфически блокироваться указанными связывающими структурами и специфически блокировать связывающие структуры.

В других вариантах осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или на высоком уровне и/или гомогенно экспрессируется в опухолевых клетках и/или на поверхности эпителиальных опухолевых клеток, выбранных из группы, состоящей из первичных и/или метастатических клеток карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или гетерогенно экспрессируется и/или не экспрессируется в клетках карциномы почек и/или предстательной железы, и/или злокачественной меланомы.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или на высоком уровне экспрессируется в апикальных участках поверхностного эпителия толстой кишки и эпителия тонкого кишечника.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или экспрессируется в ассоциации с апикальным участком клеточной поверхности микроворсинок и/или щеточной каемки клеток поверхностного эпителия толстой кишки.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или умеренно экспрессируется в эпителии молочной железы и/или в окружающей ее соединительной ткани.

В других вариантах осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или гетерогенно экспрессируется или не экспрессируется в нормальных тканях, включая ткани селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы и/или ЦНС.

В другом варианте осуществления изобретения обнаружение и/или экспрессия указанной структуры-мишени ассоциированы с эпителиальной тканью.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень имеет кажущуюся молекулярную массу в ее нередуцированной форме 90 и/или 220 килодальтон.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антиидиотипу структуры-мишени, определенной выше, где указанный антиидиотип специфически связан связывающей структурой, обладающей аналогичной специфичностью связывания по отношению к указанной структуре-мишени, и специфически связывается с этой связывающей структурой.

В одном варианте осуществления изобретения указанный антиидиотип специфически блокируется указанными связывающими структурами и специфически блокирует эти структуры.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая распознает структуру-мишень, определенную выше, и которая имеет органическую химическую природу. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура блокирует связывание указанной связывающей структуры, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к веществу, блокирующему экспрессию структуры-мишени, определенной выше.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным веществом является антисмысловой олигонуклеотид и/или молекула рибозима.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к веществу, которое блокирует функцию структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала, по крайней мере, одну связывающую структуру, определенную выше.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала структуру-мишень, определенную выше, или антиидиотип указанной структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала вещество, определенное выше.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей в качестве действующего начала структуру-мишень или антиидиотип указанной структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу фагового отбора, предусматривающему использование комбинации предварительно иммунологически in vivo отобранного набора связывающих структур, представленных на фаговых частицах, и субтрактивный отбор фаговых частиц с использованием пар тканей с различными фенотипами.

В одном из вариантов осуществления указанного способа указанный предварительно отобранный набор связывающих структур включает антитела, происходящие от приматов.

В еще одном варианте осуществления указанного способа указанные пары тканей соответствуют друг другу. Предпочтительно, указанные совместимые пары тканей происходят от того же самого индивидуума.

В других вариантах осуществления изобретения указанные ткани используют в форме замороженных и/или фиксированных формалином/залитых в парафин тканевых срезов, и/или их фрагментов, и/или клеточных суспензий.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro гистопатологической диагностики и прогнозирования злокачественных заболеваний человека, где образец подвергают контакту, по крайней мере, с одной из связывающих структур, описанных выше, и с индикатором. Указанным образцом является, предпочтительно, образец тканей, который перед приготовлением среза был заморожен и/или фиксирован формалином и залит в парафин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает типирование опухоли, скрининг опухоли, диагностику и прогнозирование развития опухоли, а также мониторинг состояний, предшествующих образованию злокачественных опухолей.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше, в физиологических жидкостях.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций антиген-содержащей структуры-мишени, определенной выше, или антиидиотипа указанной структуры-мишени, определенной выше, в физиологических жидкостях.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций в физиологических жидкостях комплекса а) антиген-содержащей структуры-мишени, определенной выше, или антиидиотила указанной структуры-мишени, определенной выше, и b) по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vivo-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему определение локализации, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше, в опухолевых отложениях у исследуемого пациента. В одном из вариантов осуществления изобретения перед указанным определением индивидууму вводят указанную связывающую структуру. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура аккумулируется в метастазах опухоли. В еще одном варианте осуществления изобретения указанный способ является количественным.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше.

В других вариантах осуществления указанного способа указанную связывающую структуру модифицируют посредством генетического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством дериватизации.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту структуры-мишени, определенной выше. В одном из вариантов осуществления указанного способа вырабатывается иммунный ответ на указанную структуру-мишень.

В других вариантах осуществления изобретения указанную структуру-мишень модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными иммуногенными и/или антигенными свойствами, либо посредством дериватизации, либо посредством генетической модификации. В других вариантах осуществления изобретения указанную структуру-мишень смешивают с другими молекулами с получением смеси, обладающей измененными иммуногенными свойствами, или с адъювантами.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту вещества, определенного выше. В других вариантах осуществления изобретения указанное вещество модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством дериватизации. В одном из вариантов осуществления изобретения к указанному веществу вырабатывается иммунный ответ. В других вариантах осуществления указанного способа указанное вещество модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам для получения комбинированной молекулы, обладающей измененными иммуногенными и/или антигенными свойствами; или посредством генетической модификации. В других вариантах осуществления изобретения указанное вещество смешивают с другими молекулами для получения смеси, обладающей измененными иммуногенными свойствами, или с адъювантами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способе отбора настоящего изобретения в качестве материалов для фагового отбора используют тканевые срезы или комбинации тканевых срезов и клеток. Слабо фиксированные тканевые срезы должны представлять собой биологический материал с высокой степенью консервативности исходной структуры и фенотипа.

Указанный способ был разработан и применен с использованием иммунной фаговой библиотеки для злокачественных опухолей толстой кишки в целях субтрактивного отбора на соответствующих аутологичных парах тканей толстой кишки и злокачественных опухолей толстой кишки, взятых от шести различных пациентов. Одно из отобранных специфических антител, называемое здесь К293, обнаруживало гомогенную реакцию со всеми опухолями, используемыми в данном отборе, но крайне ограниченную реакцию с нормальной толстой кишкой. Клоны с картиной К293-специфичности часто обнаруживались в последних циклах отбора, что позволяло предположить о функциональности данного субтрактивного метода, основанного на использовании данных тканей.

Преимущественная экспрессия К293-распознаваемых опухолеассоциированных антигенов (ТАА) с помощью опухолевых фенотипов, развивающихся у пациентов, в отличие от in vitro-культивированных опухолевых клеточных линий, подчеркивают преимущество и целесообразность использования тканевых срезов в качестве материала для отбора, проводимого в целях идентификации реагентов для новых и терапевтически подходящих опухолеассоциированных антигенов.

Кроме того, антитело К293 продемонстрировало высокую степень реактивности по отношению к клеткам карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, легких и молочной железы и в высокой степени ограниченную реактивность при тестировании на широкой панели нормальных тканей. Была продемонстрирована реактивность клеточной поверхности, и наряду с этим наблюдалось отсутствие заметных уровней антигена в кровотоке, что дало основание предположить, что указанный антиген является подходящим для его нацеливания на опухоль. Этот факт также подтверждается гибридом "Fab К293-суперантиген SEA (D227A)", который продемонстрировал предварительную очевидность направленной терапевтической активности в "гуманизированной" SCID-модели с использованием гетеротрансплантированных опухолевых клеток человека.

И наконец, может быть осуществлена аффинная хроматография с использованием иммобилизованных фрагментов антитела К293 и очистка белковой фракции. Фракции, выявленные с помощью гель-фильтрации в невосстанавливающем ДСН-геле в виде полосы м.м. 35-40 кДа, пептического гидролиза и секвенирования полученных последовательностей трех пептидных фрагментов, подтвердили гомологию с GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой.

Настоящее исследование позволяет разработать стратегию для идентификации фенотипических различий между нормальными и патологическими тканями и опосредованной идентификации генов, кодирующих дифференциально экспрессированные молекулы. Эта стратегия была применена для идентификации антигенов, ассоциированных со злокачественной опухолью толстой кишки, и антител, реагирующих с указанными антигенами. В более широкой перспективе разработанный способ может быть также применен в других областях исследования с использованием пар тканей, таких как нормальные ткани и воспалительные ткани, или зрелые и незрелые ткани для идентификации воспалительного заболевания или маркеров и мишеней для определения стадии развития.

Эффективность использования тканевых срезов в качестве антигенного источника для субтракции фаговых библиотек оценивали на модельных системах. Полная субстракция одного кодированного фагом связывающего антитела из другого может быть достигнута с использованием фага, кодирующего антитела scFv, представляющие собой широкореактивные (С215) и опухоль-специфические (1F) антитела. Этот последний способ является слегка упрощенным вариантом, поскольку антиген 1F слабо экспрессируется, но не полностью отсутствует на ткани тонкой кишки (Tordsson et al., находится на рассмотрении). Следовательно, малая субстракция также фага 1F может приводить к редуцированному разделению двух специфических фагов.

Кроме того, если вместо культивированных интактных клеток Соlо205 для стадии позитивного отбора использовали фиксированные ацетоном тканевых срезов опухоли Соlо205, растущих у мышей SCID (и тканевые срезы матки для стадии негативного отбора), то выход фага 1F снижался в 12-16 раз по сравнению с выходом фага С215 (фиг.2, данные не приводятся). Это можно объяснить тем, что антиген 1F чувствителен к фиксации, или тем, что связывание scFv фага 1F чувствительно к жестким промывкам, используемым в методе отбора, основанном на использовании тканей.

Добавление стадии негативного отбора с использованием срезов матки не влияло на относительный выход фага С215 и 1F из клеток в отличие от проведения лишь позитивного отбора (Tordsson et al., находится на рассмотрении), что подтверждает специфичность данной системы и негативную реакцию с тканями матки, наблюдавшуюся ранее в иммуногистохимическом анализе, проведенном с использованием указанных специфических антител.

В заключение можно сделать вывод, что, несмотря на отсутствие оптимального опухоль-специфического фага в данной модели, была продемонстрирована эффективность и специфичность в отношении адсорбции фага на ткани, что дает основу для разработки схемы субтрактивного отбора. Кроме того, повторение стадии адсорбции в каждом раунде отбора (с минимальной потерей выхода фага) или между раундами отбора будет приводить к увеличению эффективности адсорбции.

Поскольку отбор библиотеки был осуществлен перед тем, как был продемонстрирован тот факт, что повторяемые стадии негативной адсорбции в каждом раунде субстрактивного отбора были более эффективными, то во всех семи раундах отбора использовались только однократные адсорбции. Это может не быть недостатком. Можно ожидать, что различные мощности негативного отбора, достигаемые при проведении различного числа адсорбции в каждом раунде отбора, должны действовать подобно настройке. Благодаря этому можно добиться постепенного сдвига выхода отбора от антител против высоко (широко) экспрессируемых антигенов (отсутствие негативной адсорбции) в сторону антител против явно дифференциально экспрессированных антигенов (повторный негативный отбор).

Однако данные, полученные в экспериментах на моделях настоящего изобретения, показали, что сила позитивного отбора значительно выше, чем сила негативного отбора. Кроме того, некоторые из этих специфичностей были обнаружены при низких частотах в узком "окне" одного или двух раундов отбора, после которых, как было очевидно, продолжающиеся раунды отбора насыщали фильтр отбора, и состав специфических антител изменялся в сторону широко реактивных антител.

Наблюдения, проведенные в процессе субтрактивного отбора библиотек, включали множество раундов отбора, необходимых для получения высокого процента связывающего фага. Это должно быть сопоставимо с 2-3 раундами, обычно достаточными при позитивном отборе на клетках или тканевых срезах. Этот факт указывает на то, что данный отбор служил в качестве эффективного фильтра для большинства специфичностей в данной библиотеке и может служить основой для разработки оптимальной стратегии отбора. Так, например, меньший коэффициент обогащения позволяет использовать большее число опухолей перед достижением оптимального раунда отбора. Это должно сдвигать отбор в сторону идентификации обычно экспрессированных опухолеассоциированных антигенов.

Большинство моноклональных антител против опухолеассоциированных антигенов представляет собой мышиные антитела, продуцированные с использованием гибридомной технологии. Однако ответы антител, которые идентифицируют различия между малыми изменениями нормальных антигенов человека, таких как аллоантигены, в большинстве случаев успешно вырабатываются у человека и видов, близких к человеку.

Только часто встречающиеся ТАА являются особенно ценными мишенями для иммунотерапии большого числа пациентов. Это исключает возникновение уникальных мутаций, специфичных для опухоли отдельного индивидуума, хотя они представляют собой истинные опухолеспецифические антигены. Поскольку часто экспрессированные опухолеспецифические антигены в большинстве случаев являются нормальными или минимально модифицированными (например, посттрансляционно модифицированными) антигенами, то приматы, иммунизированные человеческими опухолями, могут быть превосходным источником антител к указанным опухолеассоциированным антигенам.

При объединении таких наборов с субтрактивным фаговым отбором может оказаться целесообразным последующее разделение данного набора, и выбор специфичностей может быть лучше проконтролирован. Идентификация совершенно отличной серии противоопухолевых антител из иммунной библиотеки злокачественных опухолей толстой кишки при субтрактивном отборе настоящего изобретения, основанном на использовании тканей, в отличие от прямого позитивного отбора (Tordsson et al., находится на рассмотрении), подтверждает эту гипотезу.

Отобранные клоны, представленные специфическим антителом К293, продемонстрировали в высокой степени гомогенное окрашивание всех тканей карциномы толстой кишки, включенных в данный протокол отбора, и очень ограниченную реактивность с эпителием нормальной толстой кишки. Фильтр для субтрактивного отбора, который определял узкую фенотипическую специфичность для обеспечения соответствующего отбора (прохождения), обнаруживал небольшое различие между нормальным эпителием и злокачественным эпителием толстой кишки, которое было аналогичным у шести пациентов, то есть пациентов, у которых брали каждую соответствующую пару тканей. Из анализа на специфичность было очевидно, что критерии, установленные для данного фильтра, почти полностью выполняются специфическим антителом типа К293.

Эукариотические клетки ранее были использованы для субтрактивных отборов в целях идентификации антигенов клеточной поверхности. Однако, в отличие от использования клеток для фагового отбора, тканевые срезы позволяют идентифицировать реагенты для всех компонентов тканей, экспрессируемых in vivo, включая антигены, регулируемые факторами внешней среды или структурами, окружающими ткань, которые невозможно или трудно репродуцировать in vitro.

Две из четырех протестированных клеточных линий злокачественных опухолей толстой кишки не экспрессировали какого-либо детектируемого уровня антигена К293 ни в in vitro-культивированных клетках, ни in vivo у мышей SCID. Кроме того, другие пять клеточных линий, культивированные in vitro, были негативными по экспрессии антигена (данные не показаны).

Очевидно, что постоянная и гомогенная экспрессия, наблюдаемая для антигена К293 во взятых от пациентов опухолях, в значительной степени снижается в случае, когда клетки злокачественных опухолей толстой кишки культивируют in vitro. Кроме того, указанная экспрессия не может быть индуцирована при росте клеток in vivo в ксеногенном хозяине.

Гибридный белок K293FabSEA/Ell представляет собой формат для расширенного анализа на специфичность К293, что позволяло увеличивать чувствительность и уменьшать фон. Было показано, что эта конструкция взаимодействует с большим числом карцином толстой кишки, молочной железы и легких. У большинства из этих опухолей анализ на K293FabSEA/E11 был на 90% или более положительным для злокачественных клеток. Эта реакция не ограничивалась лишь первичными опухолями, поскольку высокая частота возникновения метастазов злокачественных опухолей толстой кишки также обнаруживала сильную реактивность. С другой стороны, в клетках злокачественных опухолей предстательной железы или почек не наблюдалось какой-либо реакции, и наблюдалась лишь ограниченная реакция в злокачественной меланоме.

Реактивность нормальных тканей была обнаружена только в апикальной части эпителия толстой и тонкой кишки, в железистом эпителии и в окружающей его строме в нормальной молочной железе.

Электронная микроскопия ясно показала, что K293FabSEA/E11 связывается с антигеном, который экспрессировался на клеточной поверхности как нормальных, так и злокачественных клеток. В нормальной слизистой толстой кишки реакция локализуется в апикальной клеточной поверхности, относящейся к микроворсинкам поверхностных эпителиальных клеток. Апикальное окрашивание также преобладает в высокодифференцированных опухолях, тогда как низко-умеренно дифференцированные опухоли давали гомогенно положительную реакцию на всех участках клеточной поверхности.

Хотя K293FabSEA/E11 не реагировал с муциноподобным материалом в опухолевых железистых образованиях, указанный антиген не мог быть детектирован в пуле плазмы, взятой от пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки. Этот пул обнаруживал высокие уровни антигена СА242 злокачественных опухолей толстой кишки, что указывало на высокую опухолевую нагрузку у этих пациентов. Поскольку K293FabSEA/E11 давал сильную положительную реакцию для 12 из 12 проанализированных первичных опухолей и для 3/4 метастазов толстой кишки, то это свидетельствует о том, что указанный эпитоп не экспрессируется в высокой степени на циркулирующем антигене.

K293FabSEA/E11 обнаруживает некоторые свойства, которые привлекают к нему интерес как к кандидату для нацеливания на опухоль, а именно: 1) он распознает высокую частоту позитивных первичных опухолей и метастазов, 2) он демонстрирует ограниченную реактивность по отношению к нормальным тканям, 3) он связывается с антигеном, который экспрессируется на поверхности опухолевых клеток, и 4) он связывается с антигеном, который не детектируется в периферической крови больных злокачественными опухолями.

Возможное использование K293FabSEA/E11 для нацеливания на опухоль, кроме того, было подтверждено в терапевтическом эксперименте с использованием мыши SCID, несущей "гуманизированную" опухоль. По сравнению с гибридным ненацеливающим контрольным белком FabSEA, K293FabSEA/E11 обнаруживал более чем 80%-ное снижение роста опухолей LS174Т в брюшной полости. Иммуногистохимическая оценка необработанных опухолей LS174T, растущих у мышей SCID, указывала на то, что с использованием K293FabSEA/E11 лишь 50% злокачественных клеток давали положительный результат (данные не приводятся). Это указывает на то, что некоторые K293Fab-негативные опухолевые клетки могут быть потенциально разрушены в результате эффекта воздействия на ближайшее окружение, возможно, путем высвобождения цитокина из Т-лимфоцитов. Таким образом, в опухолях, вырезанных у пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки, был обнаружен более высокий процент позитивных клеток, при этом такая терапевтическая эффективность должна потенциально увеличиваться.

Антиген К293 может входить в группу "секвестрированных" антигенов, которые всегда присутствуют в нормальной ткани, но которые в обычных случаях не обнаруживаются иммунной системой. В толстой и тонкой кишке антиген не присутствует на базальной поверхности клеток, где он может обнаруживаться циркулирующими антителами и иммунокомпетентными клетками. Однако во многих образцах опухолей было обнаружено, что указанный антиген К293 распределяется по всей клеточной мембране, а поэтому он может быть доступен для этих циркулирующих антител.

По своему профилю специфичности K293FabSEA/E11, очевидно, отличается от имеющихся и часто используемых антител, связывающихся с клетками злокачественных опухолей толстой кишки. А поэтому маловероятно, что оно связывается с этими известными молекулами-мишенями. Апикальное К293FаbSЕА/Е11-окрашивание нормальной толстой кишки обнаруживает сходство с реакцией, наблюдаемой для антител против СЕА. Однако сообщалось, что антитела против СЕА реагируют с гранулоцитами и/или с макрофагами. Кроме того, антиген СЕА легко детектируется в кровотоке и используется в качестве сывороточного маркера для злокачественных опухолей толстой кишки. Все антитела ВЗ, 19-9 и В72.3, реагирующие с клетками злокачественных опухолей кишки, имеют ограниченную гетерогенную реактивность в нормальной толстой кишке и таким образом имеют очевидное отличие от специфичности К293. Это также справедливо для антигенов MUC-1, -2, -3, -4, которые имеют другое распределение в нормальной толстой кишке по сравнению с антигеном, распознаваемом К293.

Разработанный субтрактивный метод фагового отбора настоящего изобретения, основанный на использовании тканей, должен открывать новые возможности для разработки технологий обнаружения мишеней. Геномика и протеомика основаны на идентификации дифференциально экспрессированных генов и белков. Эти способы предусматривают непосредственное представление самих мишеней, тогда как технология настоящего изобретения предусматривает использование библиотеки, представляемых фагом реагентов для выявления мишеней, экспрессируемых клетками и тканями.

Идентификация реагента для новой мишени дает эффективное средство для анализа распределения в тканях эпитопа и для очистки и характеризации их соответствующего антигена(ов). Иллюстрация успешной аффинной очистки и характеризация с помощью анализа последовательностей предполагаемого антигена-мишени для антитела К293 служит примером широких возможностей использования таких антител для зондирования в целях эффективной и быстрой идентификации мишени. Три пептида длиной в 10 аминокислот обнаруживали идентичность с молекулой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, что дает основание предположить, что она может быть мишенью для К293.

Хотя методы геномики могут приводить к идентификации генов-мишеней, однако, эта технология не обеспечивает сохранение изменений при посттрансляционных модификациях, вносимых на белковом уровне. Использование информации о генетической экспрессии в различных тканях может быть обеспечено поиском баз данных, относящихся к экспрессии генов (электронные Нозерн-блоты), хотя для прямой демонстрации необходимо использовать in situ-гибридизацию.

Протеомика может быть использована для детекции некоторых типов посттрансляционных модификаций. Однако для анализа тканевого распределения идентифицированного белка необходимо либо генерирование ДНК-зондов на основе их аминокислотной последовательности, используемой для in situ-гибридизации, либо генерирование реагентов антител к данному белку.

Ни геномика, ни протеомика не охватывают, например, углеводы и липиды, а также другие биологические молекулы небелковой природы. Была продемонстрирована мощная автоматизированная технология, которая объединяет протеомику с техникой фагового представления, или более конкретно, которая представляет собой способ отбора фага для антитела по отношению к пятнам белка на двумерных гелях (представленных компанией СаТ, Cambridge, U.K.). Это, несомненно, дает возможность генерировать реагенты для новых антигенов, однако, при этом следует учитывать ограничения протеомики и тот факт, что многие эпитопы, экспонированные на денатурированных белках, не экспонируются in vivo, а многие эпитопы, экспонированные на уложенных белках in vivo, не могут быть детектированы. Разумеется, что такая технология может быть также применена обратным способом с использованием реагента, генерированного методом субтрактивного фагового отбора, для детекции пятна белка-мишени с последующим проведением масс-спектрометрии и секвенирования для идентификации мишени.

Отобранные антитела, а в частности, специфичные антитела К293, имеют некоторые преимущественные свойства, позволяющие использовать их в качестве молекул для нацеливания на опухоль. Такими свойствами являются реактивность с опухолью с высокой гомогенностью связывания с крупной опухолевой фракцией карциномы толстой кишки, а возможно, также и с другими опухолями часто встречающихся типов. Важно отметить, что реактивность с нормальной тканью является достаточно ограниченной, и эта антиген-мишень не детектируется в кровотоке больных злокачественными опухолями при использовании стандартной методики. Кроме того, ожидается, что антитело приматов, в высокой степени гомологичное последовательностям иммуноглобулина человека, не индуцирует сильный ответ против ксено-антитела (приводящий к образованию и элиминации иммунного комплекса) у человека.

Стратегия для фагового отбора настоящего изобретения основана на использовании предварительно отобранного in vivo-набора связывающих структур (антител) от приматов в сочетании с узким фильтром для субтрактивного отбора.

Во избежание сдвига в иммунизации, такого как иммунодоминантность, рассматривается и другое применение настоящего изобретения, которое связано с использованием крупных неиммунных библиотек и которое позволит усиливать дифференцирующую эффективность разработанных стратегий отбора. Эти стратегии включают субтрактивный отбор с использованием аутентичного in vivo-фенотипа, представленного тканевыми срезами, изменение фона антигенного окружения для стимуляции антигенов, представляющих собой "общие знаменатели" фенотипа, и специфическое блокирование часто идентифицируемых эпитопов (с использованием клонированных антител).

Настоящая работа ясно продемонстрировала, что фаговый отбор может быть использован как детектирующее средство для стратегий, ориентированных на определенную мишень, и что критерии разрабатываемой схемы отбора имеют решающее значение для получения надежных результатов.

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами и прилагаемым к ним графическим материалом.

ПРИМЕР 1

Эффективный субтрактивный отбор на модели

Принцип субтрактивного отбора фагмидных библиотек настоящего изобретения проиллюстрирован на фиг.1. Отдельный фаг в пуле библиотеки, предназначенном для субтрактивного отбора (для идентификации опухолеассоциированных антигенов), может быть, в идеальном случае, классифицирован по характеру специфичности кодированных им антител, а именно: 1) по их реактивности с тканями широкого спектра, 2) по реактивности, ограниченной опухолями, и 3) по неспецифичности. Фагмидная библиотека также имеет большую фракцию фага, который не представляет кодированные антитела. Этот фаг не может специфически адсорбироваться в стадии негативного отбора, но он может быть отмыт в стадии позитивного отбора перед размножением фага в бактериях.

Фаг с широкой реактивностью, C215-scFv, реагирующий с эпителиальной клеточно-адгезивной молекулой, Ер-САМ, и фаг с более ограниченной специфичностью к опухолям, IF-scFv (ранее идентифицированный из фаговой библиотеки), смешивали (2,5×10⁷ фага С215 и 1,3×10 ⁶ фага 1F-scFv) и использовали для модельного эксперимента, проиллюстрированного на фиг.2А. Указанные специфические фаги инкубировали либо на срезах ткани, экспрессирующей С215, т.е. ткани тонкой кишки, либо на срезах ткани, негативной по обоим антигенам, ткани матки. После адсорбции на тканевых срезах специфический фаг, присутствующий в супернатанте, был подвергнут позитивному отбору с использованием клеток Соlо205.

Относительный состав различных трансдуцирующих единиц (различных фаговых клонов) в пуле еще неотобранных и отобранных фагов анализировали путем титрования колоний, и выход фага был проиллюстрирован для каждой фаговой специфичности. Эти данные продемонстрировали, что адсорбция на срезах тонкой кишки приводила к 33-кратному снижению выхода широко реактивного фага С215 по сравнению с адсорбцией на матке.

Соответствующее снижение выхода для другой специфичности фага, 1F, составляло лишь в 1,2 раза. После отбора с использованием срезов тонкой кишки отношение фагов (1F/C215) по сравнению с исходной смесью изменялось в 50 раз (при использовании срезов матки - в 1,8 раза).

В повторном эксперименте при использовании срезов тонкой кишки фаговое отношение изменялось в 17 раз (при использовании срезов матки - в 1,4 раза). Использование тканевых срезов для обеих стадий отбора показало снижение эффективности субстрактивного отбора. Комбинированное использование срезов тонкой кишки/опухоли SCID Соlо205 и толстой кишки/первичной карциномы толстой кишки приводило к 4-кратному и 3-кратному снижению выхода специфического фага С215, соответственно, по сравнению с соответствующими параметрами при использовании тканей матки для адсорбции. Однако при двукратном повторении стадии адсорбции эффективность адсорбции снижалась в 25 раз (данные не приводятся). В указанных экспериментах было использовано большое число специфических фагов, 3,8×10 ⁹ и 1,2×10¹⁰ фага С215 и фага 1F с фоном 6,1×10¹⁰ неспецифического фага D1.3, и эти эксперименты продемонстрировали высокую адсорбционную способность тканевых срезов тонкой кишки.

В эксперименте, проиллюстрированном на фиг.2В, равное высокое число фагов, 7,2×10⁹ С215, 2,2×10¹⁰ 1F и 4,2×10¹⁰ D1.3 было использовано для двух повторных негативных адсорбций с использованием срезов ткани матки, тонкой кишки или легких с последующим позитивным отбором с использованием срезов опухоли Соlо205. Адсорбция на срезах тканей тонкой кишки и легких значительно (р<0,05, n=4), т.е. в 11 и 2,2 раза, соответственно, снижала обогащение фагом С215 (выход фагов C215/D1.3) по сравнению с адсорбцией на ткани матки (фиг.2В). В противоположность этому на обогащение фагом 1F (55-64-кратное обогащение по сравнению с фагом D1.3) не влиял выбор тканей для адсорбции (снижение адсорбции на ткани тонкой кишки и матки составляло в 1,1 и 0,9 раз, соответственно).

В заключение можно сделать вывод, что негативная адсорбция фага С215 на тканевых срезах обнаруживала зависимость от тканевого антигена Ер-САМ и давала 33-кратную эффективность. Полученные данные также показали, что субтрактивный отбор зависит от эффективности как негативной, так и позитивной стадии отбора.

Материалы и методы

Животные

Обезьяны макак-крабоед (Масаса fascicularies) содержались в Шведском институте по изучению инфекционных болезней, в Стокгольме (Swedish Institute for Infections Diseases Control, Stockholm). Эти обезьяны были подкожно иммунизированы неочищенной суспензией опухоли толстой кишки человека с алюмовым адъювантом или без него (каждые два индивида). Бустер-дозы инъецировали на дни 21, 35 и 49.

Мыши-самки с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (С.В-17) были получены от Bommice, Ry, Denmark. Эти мыши содержались в стерильных условиях в макролоновых клетках (III) и получали стерильный гранулированный корм для грызунов, разработанный Специальной службой обеспечения кормами, Essex, UK, и стерильную воду по желанию. Мышам (две мыши на каждую клеточную линию) в возрасте 8-12 недель подкожно инъецировали в каждый бок 2×10⁶ клеток злокачественных опухолей толстой кишки, Colo205, WiDr, HT29 или LS174T, суспендированных в 200 мкл 1% сыворотки BALb/c. Эти опухоли выращивали до размера 4-5 мм в диаметре, а затем вырезали и замораживали для иммуногистохимического анализа.

Все животные содержались в соответствии со шведским законодательством, и на эти эксперименты было получено разрешение местного комитета.

Клетки и ткани

Клеточные линии толстой кишки человека Соlо201, Colo205, Colo320DM, SW480, SW620, WiDr, HT29 и LS174T были взяты из Американской коллекции типовых культур в Rockville, MD, а Соlо137 были взяты из CanAg AB, Gothenburg, Sweden. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco), в которую была добавлена 10% термоинактивированная фетальная телячья сыворотка (FBS) от Gibco и 0,1 мг/мл сульфата гентамицина (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel). Человеческие опухоли и нормальные ткани были получены из Университетского госпиталя в Лунде (Lund University Hospital) и из больницы общего профиля в Мальме (Maimo General Hospital, Sweden). Для субстрактивного отбора библиотеки были использованы пары тканей: первичная карцинома толстой кишки и нормальная ткань толстой кишки (находящаяся на расстоянии, по крайней мере, 5 см от участка поражения опухолью), полученные от шести индивидуумов.

Библиотека и фаговая модель

Фагмидный вектор, используемый для библиотеки и модельного фага, праймеры для амплификации и сборки гена scFv с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) генов легкой цепи лямбда и тяжелой цепи для встраивания в фагмидный вектор были описаны ранее (Tordsson J. et al., 1997, и Tordsson et al., находится на рассмотрении). Вкратце, кДНК амплифицировали из полноразмерной РНК селезенки с использованием набора для выделения РНК от Promega и набора для ПЦР РНК от РЕ Biosystems, Stockholm, Sweden. Модельные фаги D1.3, С215 и IF scFv, используемые в данном исследовании, кодируют гены резистентности к ампициллину, хлорамфениколу и тетрациклину, соответственно, что позволяет проводить анализ титров отдельного фага в фаговых смесях посредством титрования колоний с использованием чашек с агаром, содержащих различные антибиотики. Представленные антитела реагировали с лизоцимом куриных яиц (D1.3), антиэпителиальной адгезивной молекулой (С215) и с неизвестной до настоящего времени молекулой клеточной поверхности эпителиальной опухоли (1F, Tordsson et al., находится на рассмотрении).

Субтрактивные отборы

Срезы ткани для негативного отбора (толстой кишки, тонкой кишки или матки) сушили на воздухе на предметных стеклах, фиксировали в охлажденном льдом ацетоне и регидратировали в 20% FBS в TBS. Фаг библиотеки, 10¹⁰ или 10¹¹ в 20% FBS, или смеси клонов модельных фагов, "мини-библиотеки" инкубировали с указанными срезами в течение 15-24 ч при 4°С во влажной атмосфере для адсорбции нежелательных фаговых специфичностей.

Раствор адсорбированного фага переносили на срезы опухолей злокачественных опухолей толстой кишки и инкубировали, как указано выше, для положительного отбора. Эти срезы промывали шесть раз в течение десяти минут в буфере TBS, а затем два раза в течение 5 минут в гененазном буфере, 1 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 6 мМ CaCl ₂, 1 мМ EDTA, pH 8,0. Фаг элюировали в течение 30 минут 400 мкл 33 мкг/мл гененазы в гененазном буфере при комнатной температуре. Элюированный фаг "спасали" с использованием 1 мл 10 × концентрированного штамма DH5F' E.coli, ОП₆₀₀=1,0. Инфицированные бактерии разводили в буфере 2 × YT, в который был добавлен ампициллин при концентрации 0,1 мг/мл или хлорамфеникол (50 мкг/мл), и культивировали в течение 1-14 ч при 24-37°С (до тех пор, пока ОП₆₀₀ не достигала 0,5).

Затем добавляли хелперный фаг М13К07 (с множественностью заражения (m.o.i.) примерно 10), инкубирование продолжали еще 2 часа, после чего добавляли канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и полученную культуру вращали со скоростью 250 об/мин и при 28°С до тех пор, пока ОП₆₀₀ не достигала 2-3 (1-2 дня). Бактерии осаждали центрифугированием, а фаг в супернатанте осаждали путем преципитации с использованием ПЭГ/NaCl и центрифугирования. Осадок фага разводили в TBS.

Для модели фага с резистентносью к тетрациклину и хлорамфениколу проводили инкубирование в течение 45 минут при 37°С, а затем колонии титровали. Для конструкций фагмидной библиотеки с резистентностью к хлорамфениколу период времени этой экспрессии гена резистентности удлинялся до 2 часов.

В качестве альтернативы тканевым срезам использовали живые клетки в 1% BSA в PBS для позитивного отбора в модельных экспериментах. Адсорбированный фаг переносили и инкубировали на 3 миллионах клеток Соlо205 в течение 1 ч. Клетки три раза промывали в течение 10 минут, а затем элюировали 100 мкл гененазы, как описано выше. В вышеописанных экспериментах для уменьшения возможных неспецифических сайтов связывания добавляли фаг, имеющий пониженную инфицирующую способность и кодирующий ген резистентности к антибиотику (10¹²/мл).

В модельных экспериментах с использованием тканевых срезов для стадий негативного и позитивного отбора неспецифический фаг D1.3 scFv использовали в том же самом диапазоне концентраций, что и специфический фаг.

ПРИМЕР 2

Наблюдалось позднее обогащение специфичностей библиотеки и обнаружено оптимальное разнообразие во втором последнем раунде отбора

Выход фага библиотеки, хотя и небольшой по сравнению с выходом фага D1.3 scFv, используемого в качестве внутреннего контроля, увеличивался между шестым и седьмым раундами отбора, что указывало на накопление тканеспецифического фага в указанной библиотеке.

Антитела scFv продуцировали путем культивирования бактериальных клонов, инфицированных фагом библиотеки в последних четырех раундах отбора (260-280 клонов/раунд отбора). Частота встречаемости антител scFv, связывающихся со срезами тканей злокачественных опухолей толстой кишки и тканями нормальной толстой кишки, и относительный выход фага библиотеки по сравнению с фагом внутреннего контроля (обогащение библиотеки) показаны на фиг.3. Реактивность антител scFv с тканями (29/280) не могла быть продемонстрирована до тех пор, пока не был проведен пятый раунд отбора, что позволяло предположить, что негативная адсорбция подавляла накопление стандартных широко реакционных специфичностей.

В предыдущих исследованиях, проводимых с использованием той же самой библиотеки для позитивного отбора на клетках злокачественных опухолей толстой кишки (Tordsson et al., находится на рассмотрении), с использованием меланомной библиотеки для позитивного отбора на срезах меланомных тканей (Tordsson et al., 1997) и для позитивных отборов на различных опухолевых клетках (неопубликованные результаты) высокая частота встречаемости специфического фага была достигнута уже во втором или третьем раунде отбора.

Кроме того, новые специфичности, которые не были ранее отобраны из библиотеки клеток злокачественных опухолей толстой кишки, в данной работе были идентифицированы с использованием разработанного метода субтрактивного отбора на тканевых срезах. Картины иммуногистохимического окрашивания клонов антител scFv, представляющих шесть идентифицированных групп специфичностей, показаны на фиг.4. Антитело К302 scFv сильно реагирует с тканью злокачественных опухолей толстой кишки (А), но оно так же широко реагирует с собственной пластинкой и с клетками пейеровых бляшек в толстой кишке (В, С). Антитело К293 scFv реагирует с клетками и с осажденным материалом (вероятно, с муцином) в опухолевой ткани (D), и лишь с люминальным слоем нормального эпителия толстой кишки, и не реагирует с пейеровой бляшкой (Е, F). Антитело К320 scFv реагирует с опухолевыми клетками и с предполагаемыми инфильтрирующими клетками в ткани злокачественных опухолей толстой кишки (G). Это антитело сильно реагирует с нормальным эпителием толстой кишки глубоко в криптах, но не реагирует с клетками собственной пластинки (lamina propria) (H). Картина реакции антитела К294 scFv дает основание предполагать о внутриклеточной локализации распознаваемого антигена в толстой кишке (I) и в ткани злокачественных опухолей толстой кишки (данные не приводятся). Клон IIID9 scFv реагировал с клетками злокачественных опухолей толстой кишки, но не реагировал с осажденным материалом или инфильтрирующими клетками (J). Он реагировал более глубоко в криптах толстой кишки, чем К293 scFv, но, вероятно, более ограниченно, чем К320 scFv (К). Последнее специфическое антитело, IID11scFv, окрашивало поверхностный слой, выстилающий внутреннюю часть кровеносных сосудов (по всей вероятности, эндотелиальные клетки, L).

Состав типов специфичностей изменялся на протяжении трех последних раундов отбора (таблица 1). В пятом раунде отбора были обнаружены лишь два типа, наибольшая опухоль-ограниченная группа К293 и более широко реагирующая группа К302. После последнего раунда высокая частота группы К293 уменьшалась, а группы К302 увеличивалась, тогда как их частоты между пятым и шестым раундами отбора значительно не изменялись. В шестом раунде отбора появлялись четыре дополнительных типа специфичностей. Три из них исчезали в последнем раунде.

В заключение можно сделать вывод, что предпоследний раунд отбора продемонстрировал оптимальное разнообразие групп специфичностей с высоким числом специфичных, по сравнению с неспецифичными, фагов в библиотеке, тогда как после последнего раунда отбора преобладала группа широко реагирующего специфического фага К302. Это указывает на важность поиска оптимального раунда отбора для обнаружения широкого ряда специфичностей и дает основание предположить, что фильтр негативного отбора был эффективным вплоть до шестого раунда отбора, после которого он был насыщен.

Таблица 1 Частота встречаемости (%) специфического связывающего scFv на раунд отбора (R)
Группы специфичности	R 5	R 6	R 7
К293	69	65	28
К302	31	31	71
К320	0	1,1	0
К294	0	1,1	1,7
IIID9	0	0,6	0
IID11	0	0,6	0
Общая частота связывающих веществ:	10	65	89

ПРИМЕР 3

Экспрессия часто встречающегося и гомогенного опухолевого селективного антигена продемонстрирована с помощью гибридного белка К293-суперантиген

Репрезентативное антитело, К293, принадлежащее к группе с наибольшей специфичностью по отношению к опухоли, снова клонировали для генетического присоединения к иммунологической эффекторной молекуле, мутанту D227A суперантигена стафилококкового энтеротоксина A, SEA (D227A). Этот гибридный белок был культивирован и очищен в ферментере и использован для иллюстрации гомогенной реактивности с пятью видами опухолей. Реактивность указанного гибридного белка К293 scFv-SEA(D227A) продемонстрировала такое же гомогенное окрашивание опухоли злокачественных опухолей толстой кишки, показанной на фиг.5, как и Ер-САМ-специфический гибридный белок С215 Fab-SEA(D227A). Окрашивание осажденного материала внутри опухолевых каналов и реактивность, ограниченная поверхностным эпителием толстой кишки, были подтверждены с использованием гибридного белка К293 scFv-SEA(D227A).

Материалы и методы

Продуцирование антител scFv и scFv-SEA. (D227A)

Отдельные клоны несупрессорного штамма НВ2151 E.coli, трансдуцированные с фагом, полученным из шестого и седьмого раундов отбора библиотеки, культивировали в микролуночных планшетах (Nunc) в среде 2 × YT, дополненной 100 мкг/мл ампициллина, в течение 17 часов при 37°С. Аликвоты переносили в микролуночные планшеты со средой, содержащей низкое количество фосфатов и антибиотики для экспрессии scFv, контролируемой промотором phoA, и культивировали при 30°С в течение 17 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 2200 об/мин в течение 7 минут и супернатанты переносили на планшеты, содержащие равный объем/лунку 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS. Гибридные белки scFv-SEA(D227A) продуцировали путем ферментации и очищали с использованием аффинной колонки, связанной с кроличьим антителом против SEA, в соответствии с методом Tordsson et al. (1997) и стандартными методами. Очищенные гибридные белки количественно оценивали с помощью "сэндвич"-ELISA с использованием биотинилированных антител в качестве иммобилизированных и идентифицирующих антител. Целостность гибридных белков подтверждали с помощью иммуноблот-анализа с использованием биотинилированных кроличьих антител против SEA.

Иммуногистохимия

Срезы (6-8 мкм) фиксировали на охлажденном льдом ацетоне и регидратировали в 20% FBS в 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, рН 7,6 (TBS). Эндогенный биотин блокировали авидином и биотином (Vector Laboratories, Burlinngame, CA). Первичные scFv (культуральные супернатанты) или гибридные белки scFv-SEA(D227A), 5 мкг/мл, инкубировали с указанными срезами в течение 1 ч. Для детекции scFv использовали кроличью антисыворотку для С-концевой метки, ATPAKSE, а затем биотинилированные козьи антикроличьи антитела (DAKO A/S), 1 мкг/мл. Гибридные белки детектировали с использованием аффинноочищенных и биотинилированных кроличьих антител против SEA, 5 мкг/мл.

Эти реагенты, а затем конъюгированное с ПХ антитело StreptABComplex HRP (DAKO A/S), разведенное 1/110 в 50 мМ Трис, рН 7,6, инкубировали в течение 30 минут. В промежутках между всеми стадиями срезы 3 раза промывали в TBS. Реакцию окрашивания проявляли в течение 8 минут в 0,5 мг/мл тетрагидрохлорида 3,3'-диаминобензидина (Sigma), растворенного в Трис, рН 7,6, с использованием 0,01% H₂O₂. После 10-минутного контрастного окрашивания в 0,5% метиловом зеленом предметные стекла промывали в течение 10 минут в водопроводной воде и постепенно дегидратировали в 70-99% этаноле и ксилоле, а затем переносили в среду DPX (Sigma).

Метод фингерпринтов scFv

Гены scFv (представители scFv-специфичности) были амплифицированы посредством полимеразной цепной реакции. Были использованы аликвоты, 5 мкл, микролуночных бактериальных культур и праймеры, комплементарные 5'- и 3'-областям гена scFv в фагмидном векторе трансфецированных бактерий (области в промоторе phoA и в гене III M13). Картину HinfI-рестрикции амплифицированных генов scFv анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Клоны с уникальными картинами или прототипами отбирали и хранили как представителей каждой группы иммуногистохимической специфичности.

ПРИМЕР 4

Отсутствие или негативная регуляция экспрессии антигена К293 in vitro указывает на преимущества принципа отбора, основанного на использовании тканей (заключающегося в сохранении аутентичного in vivo фенотипа)

Слабо фиксированные замороженные срезы ткани опухолей, взятые от пациентов (в отличие от культивированных опухолевых клеток), являются источниками сложных антигенов (для фагового отбора), которые имеют близкое сходство с исходным опухолевым фенотипом. В отличие от гомогенной и постоянной реактивностей с опухолями пациентов антитело К293 scFv-SEA(D227A) слабо реагировало с 2/9 (НТ29 и LS174T) и не реагировало с 7/9 (Colo201, Colo205, Colo320DM, SW480, SW620 и WiDr) клеточными линиями злокачественных опухолей толстой кишки, как было показано с помощью проточной цитометрии, и в противоположность этому умеренно или сильно реагировало с С215 Fab-SEA(D227A) (таблица 1, результаты не приводятся). Две из негативных клеточных линий (Соlо205 и WiDr) и две слабо реагирующие клеточные линии подкожно культивировали у мышей SCID.

Для оценки реактивности К293 scFv-SEA(D227A) с указанными опухолями проводили иммуногистохимический анализ. Опухоль Соlо205 была полностью негативной, что же касается опухоли WiDr, то негативными были только опухолевые клетки, а осажденный материал был позитивным. Опухоль НТ29 была позитивной для малой фракции клеток, составляющей приблизительно 5-10%, и для осажденного материала. Опухоль LS174T была гетерогенно позитивной примерно для 50% клеток и для осажденного материала. Таким образом, постоянная и гомогенная экспрессия эпитопа К293 в первичных опухолях пациента не наблюдалась ни в in vitro-культивированных опухолевых клеточных линиях, ни в опухолях, происходящих от клеточных линий, культивированных в ксеногенном хозяине. Это указывало на то, что использование тканевых срезов в качестве источника антигена для фагового отбора имеет важное значение для обнаружения опухоль-ограниченной специфичности К293.

Слабая экспрессия эпитопа К293 на двух клеточных линиях, детектированных с помощью проточной цитометрии, позволяет предположить, что распознаваемый ТАА может быть экспрессирован на поверхности опухолевых клеток. Поверхностная экспрессия in vivo была подтверждена с помощью проточной цитометрии, осуществляемой на опухолевых клетках, происходящих от первичной карциномы толстой кишки и обработанных диспазой (нейтральной протеазой) и коллагеназой для дезинтеграции опухолей в клеточных суспензиях. Опухолевые клетки, отличающиеся от других клеток (таких как фибробласты, клетки крови и клетки гладких мышц), такие как клетки Ер-САМ+, детектируемые mAb C215, подвергали двойному окрашиванию для оценки реактивности K293scFv-SEA(D227A) (фиг.6). Крупная фракция Ер-САМ-положительных опухолевых клеток реагировала с К293 (приблизительно на 60%) после однократной ферментативной обработки, необходимой для экстракции клеток.

Хотя сила реактивности варьировалась, однако, реактивность K293scFv-SEA(D227A) была продемонстрирована в трех дополнительных экспериментах, проведенных с использованием клеток от вырезанных первичных опухолей, что подтверждало, что К293 ТАА экспрессируется на поверхности опухолевых клеток в аутологичном хозяине.

Таблица 2 Антитело К293 гомогенно окрашивает карциномы толстой кишки, но лишь слабо и гетерогенно реагирует с клеточными линиями злокачественных опухолей толстой кишки, культивированными in vitro или в ксеногенном хозяине, т.е. подкожно культивированными у мышей SCID
Клеточная линия	Проточная цитометрия	Подкожное культиврование у мышей SCID	Первичные карциномы толстой кишки
Соlо205	Негативная	Негативная	Гомогенное окрашивание пяти первичных карцином толстой кишки, используемых для отбора*
WiDr	Негативная	Негативная*
НТ29	Слабо позитивная	5-10% позитивных клеток*
LS174T	Слабо позитивная	50% гетерогенно позитивных клеток*
* Осажденный материал был в высокой степени позитивным.

Материалы и методы

Проточная цитометрия

Реактивность антител, присоединенных генетическими методами к стафилококковому эндотоксину A, SEA, по отношению к культивированным или свежеприготовленным опухолевым клеткам, была продемонстрирована с использованием биотинилированных кроличьих антител против SEA и с использованием авидина-РЕ.

Первичные клетки злокачественных опухолей толстой кишки человека получали из злокачественных опухолей толстой кишки, вырезанных в тот же самый день, и хранили на льду в 150 мМ NaCl вплоть до использования (менее, чем 4 ч). Эти опухоли разрезали на мелкие кусочки и медленно перемешивали путем вращения в растворе, содержащем 1 мг/мл коллагеназы (Sigma), 0,1 мг/мл гиалуронидазы (Sigma), 2,4 мг/мл диспазы (Boehringer Mannhiem) и 20 мкг/мл дезоксирибонуклеазы (Sigma), разведенной в среде RPMI 1640 (Gibco, Middlesex, UK) при комнатной температуре в течение ночи. Опухолевые клетки отделяли от тканевого дебриса путем фильтрации, один раз промывали PBS/1% BSA, а затем окрашивали 5 мкг/мл mAb С215/ФИТЦ-конъюгированного кроличьего антимышиного антитела (Dakopatts), разведенного 1/20, и 5 мкг/мл К293 scFv-SEA(D227A)/биотинилированных поликлональных кроличьих антител против SEA, разведенных 1/1000/авидина-РЕ, разведенного 1/20.

ПРИМЕР 5

Сильное и постоянное K293FabSEA/E11-окрашивание эпителиальных опухолей

Иммуногистохимическая реакция на различных опухолях человека систематизирована в таблице 3. Антитело K293FabSEA/E11 давало сильную положительную реакцию в аденокарциномах толстой кишки, поджелудочной железы, легких и молочной железы (фиг.7). Сильная реакция наблюдалась как в злокачественных клетках, так и в муциноподобном/слущивающемся материале в железистых структурах. В злокачественных опухолях почек или предстательной железы не наблюдалось какой-либо реакции, за исключением одной из двух злокачественных меланом, обнаруживающей слабую или умеренную реакцию. Все 12 исследованных опухолей злокачественных опухолей толстой кишки обнаруживали сильную положительную реакцию окрашивания.

Частота положительных злокачественных клеток в отдельных опухолях варьировалась от 75 до 100%. Пять из 6 опухолей молочной железы обнаруживали сильную положительную реакцию с частотой положительных злокачественных клеток 75-100%. Хотя частота положительных клеток в карциномах толстой кишки и молочной железы варьировалась от 75% до 100%, однако, большинство опухолей обнаруживали более чем 90%-ную положительную реакцию. Две из 2 исследуемых опухолей поджелудочной железы также обнаруживали сильную реакцию в более чем 90% злокачественных клеток.

Среди немелкоклеточных карцином легких (NSCLC) 2 были плоскоклеточными карциномами, а 4 - аденокарциномами легких. Для всех этих опухолей наблюдалось сильное окрашивание злокачественных клеток. В обеих исследованных плоскоклеточных карциномах позитивное окрашивание наблюдалось в более чем 90% опухолевых клеток. Для 2 аденокарцином наблюдалась реактивность у 90% опухолевых клеток, а 2 другие карциномы обнаруживали положительную реакцию в менее чем 10% клеток.

Картина реактивности K293FabSEA/E11 на различных злокачественных опухолях толстой кишки коррелировала со степенью дифференциации опухоли. В высокодифференцированных опухолях преобладало апикальное окрашивание злокачественных клеток. В некоторых из этих высокодифференцированных опухолей базолатеральные части злокачественных клеток были полностью негативными, а апикальные части были в высокой степени позитивными. В низкодифференцированных и умеренно дифференцированных опухолях иммунореакция не была поляризована в определенной части, а была достаточно однородно распределена в злокачественных клетках.

Таблица 3 Реактивность K293FabSEA/E11 с опухолевыми тканями
Злокачественная опухоль толстой кишки, первичная опухоль	Сильное окрашивание в 12/12 опухолях. 75-100% реактивность опухолевых клеток. Сильная реакция также наблюдалась в муциноподобном/слущивающемся материале.
Злокачественная опухоль толстой кишки, метастазы	Сильное окрашивание в 3/4 опухолях*. 75-100% реактивность опухолевых клеток.
Злокачественная опухоль поджелудочной железы	Сильное окрашивание в 2/2 опухолях. Примерно 90% реактивность опухолевых клеток.
Злокачественная опухоль молочной железы	Сильное окрашивание в 5/6 опухолях. (75-100% реактивность опухолевых клеток). Реакция также наблюдалась в муциноподобном/слущивающемся материале.
Немелкоклеточная карцинома легких (NSCLC)	Сильное окрашивание в 6/6 опухолях. <10% реактивность опухолевых клеток в 2/6, >90% реактивность в 4/6. Реакция также наблюдалась в муциноподобном/слущивающемся материале.
Злокачественная меланома	Слабая-умеренная реакция в 1/2 (примерно 90% реактивность опухолевых клеток). Нег. в 1/2

Злокачественная опухоль предстательной железы	Нег. 2/2
Злокачественная опухоль почек	Нег. 2/2
* Один из позитивных метастазов был фиксирован формалином и залит в парафин.

ПРИМЕР 6

K293FabSEA/E11 обнаруживает очень ограниченную перекрестную реактивность с нормальными тканями

В панели исследуемых органов реактивность с нормальными тканями ограничена толстой кишкой, тонкой кишкой и молочной железой. Сильное окрашивание апикальной части эпителиальных клеток наблюдается в толстой кишке (фигура 8). Это было также обнаружено в одной из двух проанализированных биопсий, взятых из тонкой кишки. Возможно, эти биопсии были взяты из разных участков, что указывает на то, что K293FabSEA/E11 реагирует лишь с определенными частями тонкой кишки. В ткани молочной железы слабая или умеренная реакция наблюдалась в эпителиальных железистых клетках и в частях окружающей стромы (фигура 8). При этом не наблюдалось какой-либо реакции в тканях желудка, селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы или ЦНС (таблица 4).

Таблица 4 Реактивность K293FabSEA/E11 с нормальными тканями
Толстая кишка	Сильная реакция в апикальных частях эпителия. 5/5
Тонкая кишка	Сильная реакция в эпителии в 1/2
Желудок	Нег. 2/2
Молочная железа	Слабая или умеренная реакция в железистом эпителии и в частях окружающей стромы. 2/2
Селезенка	Нег. 2/2
Почки	Нег. 2/2
Печень	Нег. 2/2
Легкие	Нег. 2/2
Кожа	Нег. 2/2
Поджелудочная железа	Нег. 2/2
Щитовидная железа	Нег. 1/1
Сердечная мышца	Нег. 1/1
ЦНС	Нег. 1/1

Материалы и методы

Иммуногистохимия

Криосрезы для оптической микроскопии

Опухолевые и нормальные ткани, любезно предоставленные Хирургическим отделением Университетской клиники в Лунде, мгновенно замораживали в изопентане, который был предварительно охлажден в жидком азоте, и хранили при -70°С. После приготовления криосрезов их сушили на воздухе в течение ночи. Срезы фиксировали в холодном ацетоне, блокировали в отношении эндогенного биотина авидином/биотином (Vector, Burlingame CA), а затем инкубировали с первым" антителом K293FabSEA/E11 в течение одного часа.

Гибридный белок получали путем генетического лигирования генов VH и VL K293 (полученных из scFv, отобранного из библиотеки) с генами СН1 и С-лямбда-цепи собакоподобной обезьяны. Объединенный Fab лигировали с химерным мутантом суперантигена стафилококкового энтеротоксина АЕ (D227A, обнаруживающим значительно пониженный уровень связывания с МНС класса II), Е11. Эта конструкция, K293FabSEA/E11, продемонстрировала очень низкие уровни неспецифического связывания и позволяла проводить чувствительную детекцию с использованием антисыворотки, содержащей "вторые" кроличьи поликлональные антитела против SEA, продуцированные и биотинилированные стандартными методами.

"Вторые" антитела инкубировали в течение 30 минут, а затем проводили стадию конъюгирования со стрептавидином-биотином/ПХ (Dakopatts, Copenhagen) еще 30 минут. Между всеми стадиями проводили трехкратные промывки 0,05 М Трис, рН 7,6, и 0,15 М NaCl. В качестве хромогена использовали диаминобензидин (DAB) и срезы подвергали контрастному окрашиванию в 0,5% метиловом зеленом. В качестве позитивного контроля использовали пан-эпителиальный реактивный гибридный белок, C215FabSEA(D227A). В качестве негативного контроля использовали гибридный белок, образованный между Fab, не реагирующим с тканями, и SEA-D227A, или не-первое" антитело. Все антитела использовали в концентрации 5 мкг/мл. Результаты выражали как негативное, слабое, умеренное или сильное окрашивание, соответственно.

Парафиновые срезы для оптической микроскопии

Опухолевую ткань лимфатических метастазов злокачественных опухолей толстой кишки фиксировали в 4% формальдегиде (Sigma, St. Louis, МО) при 4°С в течение ночи. После промывки в PBS ткань дегидратировали и заливали в парафин (Histolab AB, Gothenburg, Sweden). Получали парафиновые срезы и оставляли на ночь при 37°С для сушки. Срезы депарафинизировали, регидратировали и подвергали иммуногистохимическому окрашиванию, как описано выше.

ПРИМЕР 7

K293FabSEA/E11 распознает экспрессируемый на поверхности антиген

Субклеточная локализация иммунореакции была более точно продемонстрирована на тонких срезах по сравнению с 8 мкм-криосрезами. В 2 мкм срезов на пластике можно было продемонстрировать апикальное, а также базо-латеральное окрашивание клеточных мембран клеток злокачественной опухоли толстой кишки (фигура 9А). Эти опухолевые образцы были также обработаны для электронной микроскопии. Разрешение электронной микроскопии, очевидно, дает возможность продемонстрировать, что иммунореакция локализуется на внешней поверхности злокачественных клеток. Окрашивание и последующая микроскопия 2 мкм полутонких срезов, а затем электронная микроскопия нормальной толстой кишки также продемонстрировали, что иммунореакция локализуется на уровне внешней поверхности микроворсинок в люминальном эпителии (фиг.9В и С).

Материалы и методы

Срезы на пластике для оптической микроскопии и электронной микроскопии

Опухолевый и нормальный тканевый материал обрабатывали, как описано ниже. Свежий иссеченный материал фиксировали в смеси 4% формальдегида (Sigma, St. Louis, МО) и 0,25% глутаральдегида (ТААВ, Berkshire) в течение 2 часов. После промывки в PBS эти ткани подвергали криоконсервации путем промывания в PBS, содержащем 30% сахарозу, в течение ночи с последующим мгновенным замораживанием в изопентане/жидком азоте, как описано выше. 50 мкм свободноплавающих криосрезов инкубировали с теми же антителами, которые были описаны для оптической микроскопии, но время инкубирования было изменено. "Первое" антитело инкубировали в течение ночи, "второе" антитело - в течение 3 часов, а стрептавидин-биотин/ПХ - в течение еще 3 часов. После реакции в DAB срезы подвергали вторичной фиксации в 1% OsO₄ (Standard supplies, Kallered), дегидратировали и заливали в агар Epon (Agar Scientific Ltd, Stensted, U.K.).

Полутонкие срезы (2 мкм) для оптической микроскопии и ультратонкие срезы (50-60 нм) для электронной микроскопии приготавливали на ультрамикротоме (LKB, Bromma, Sweden). Полутонкие срезы подвергали контрастному окрашиванию 1% метиленовым синим. Ультратонкие срезы окрашивали в 2% уранилацетате и цитрате свинца с использованием устройства для окраски ультратонких препаратов (LKB, Bromma).

ПРИМЕР 8

K293FabSEA/E11 не распознает циркулирующий антиген в сыворотке пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки

На фиг.10 продемонстрирован размер фракции радиоактивно меченных конструкций гибридного белка SEA и циркулирующего опухолевого антигена после инкубирования с образцами плазмы, взятыми у пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки и у одного здорового волонтера, соответственно.

При инкубировании с плазмой от больных злокачественными опухолями по сравнению с инкубированием с плазмой от здорового индивидуума было обнаружено менее чем 1,5-кратное увеличение уровня K293FabSEA/E11 в виде белковых комплексов. С другой стороны, при инкубировании с плазмой больных злокачественными опухолями наблюдалось восьмикратное увеличение уровня С242-Fab-конструкции (позитивный контроль), присутствующей в форме комплекса. Таким образом, K293FabSEA/E11 не распознавал какой-либо циркулирующий антиген у больных злокачественными опухолями.

Материалы и методы

Композиция тестируемого соединения

50 мкг K293Fab-SEA/E11, C215Fab-SEA_mut.9 и C242Fab-SEA_mut.23 метили ¹²⁵I до достижения удельной активности 10 мкКи/мкг с использованием пробирок, предварительно покрытых препаратом Iodogen (Pharmacia-Amersham Biotech) (Fraker & Speck, 1978). Меченые тестируемые соединения определяли по соответствующей концентрации белка и удельной радиоактивности с помощью ВЭЖХ (см. ниже).

Образцы плазмы брали у пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки (n=12), у которых обнаруживали высокие уровни циркулирующего антигена СА242, с помощью коммерчески доступного набора для анализа (CanAG Diagnostics АВ, Gothenburg, Sweden), и у одного здорового волонтера, в плазме которого обнаруживали очень низкий уровень СА242.

Анализ тест-растворов в плазме

50 мкл неразведенных образцов плазмы инкубировали с 1 мкг/мл тестируемого соединения (разведенного в PBST) в течение 60 минут при комнатной температуре и инкубационную смесь встряхивали. Все образцы анализировали с помощью ВЭЖХ (см. ниже).

Поскольку образцы плазмы содержали антитела против SEA и могли давать ложноположительный сигнал взаимодействия, они были инкубированы с белком А для удаления иммуноглобулинов. После проведения этой стадии удаления содержание антитела против SEA составляло <10 пмоль/мл. Содержание СА242 в объединенной плазме, взятой от больных злокачественными опухолями, составляло 479 ед/мл, а в образце здорового донора после инкубирования с белком А это содержание составляло менее чем 20 ед/мл.

Меченые тестируемые соединения и полученные образцы анализировали с помощью вытеснительной ВЭЖХ. Затем инъецировали 50 мкл образца (Waters 717 Auto Sampler) и разделяли на колонке TSK G3000 SW (7,5×600 мм, Toso Haas). Образец элюировали 10 мМ PBS, рН 7,4, при скорости потока 1,0 мл/мин при комнатной температуре. Детекцию осуществляли с использованием УФ-детектора (А280 нм, Waters 486) и детектора для измерения радиоактивности (Flo-One, A-515-AX), соединенных последовательно, и данные собирали в течение 35-60 минут в зависимости от конкретного образца. Фракции, содержащие тестируемое соединение в виде связанного комплекса, наблюдались как высокомолекулярные пики, появляющиеся на хроматограмме раньше, чем само тестируемое соединение. Фракции, содержащие йодированный фрагмент или свободный йод, наблюдались как низкомолекулярные пики. Хроматограммы радиоактивности интегрировали и площадь пиков для комплексных тестируемых соединений и низкомолекулярных соединений выражали в процентах от общей площади.

ПРИМЕР 9

Очистка опухолеассоциированного антигена, который распознавался антителом К293 со специфичностью к злокачественным опухолям толстой кишки

Опухолевый экстракт получали из ткани злокачественных опухолей толстой кишки человека. Этот экстракт наносили на две колонки, контрольную и предколонку, связанную с C215Fab-SEAm9, и на колонку, связанную с K293Fab-SEAm9. При нанесении тканевого экстракта на указанные колонки эти колонки соединяли последовательно, но в процессе щелочного элюирования связанных белков их разделяли.

Фракции, проэлюированные с колонки, связанной с K293Fab-SEAm9, собирали, нейтрализовали, концентрировали, а затем анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН в невосстанавливающих условиях (фиг.11). Главная полоса (отмеченная А на фиг.11) могла наблюдаться приблизительно при 35-46 кДа во фракции, проэлюированной при высоком рН. Эту главную полосу вырезали и подвергали протеолитическому гидролизу трипсином. Генерированные триптические лептидные фрагменты выделяли, и для трех из этих выделенных пептидов определяли последовательности для первых десяти N-концевых аминокислотных остатков (фиг.12). Эти три короткие N-концевые пептидные последовательности (Список последовательностей, SEQ ID NO: 3-5) обнаруживали полную гомологию с частями человеческого белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GADPH) (фиг.13).

Материалы и методы

Солюбилизация опухолевой ткани

Ткань злокачественной опухоли толстой кишки человека, экспрессирующую антиген К293, была предоставлена клиниками Швеции и хранилась в замороженном виде при -70°С в банке тканей ABR. Замороженные ткани злокачественных опухолей толстой кишки разрезали скальпелем с получением срезов и эти срезы переносили в пробирку с предварительно охлажденным при 4°С изотоническим сахарозным буфером (0,25 М сахароза, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, при 25°С), содержащим 1% (об/об) Nonidet P-40 (NP-40) и ингибиторы протеазы (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Boehringer Mannheim). Тканевые срезы гомогенизировали с использованием гомогенизатора Ultra-Turrax и оставляли при 0°С для солюбилизации. Солюбилизированный раствор центрифугировали при 11000 об/мин (на центрифуге Hettich, ротор Universal 30 RF) для удаления значительного количества клеточного дебриса. Затем супернатант центрифугировали при 108000 × g при 4°С (на ультрацентрифуге Beckman, ротор Ti-60) и, наконец, фильтровали через 0,2 мкм-фильтр Minisart plus (Sartorius AG, Gottingen, Germany).

Аффинная очистка антигенов ткани

Антитела, K293Fab-SEAm9 и C215Fab-SEAm9 связывали с NHS-активированными колонками HiTrap^® (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) в соответствии с инструкциями производителей. Контрольную колонку и предколонку, связанную с C215Fab-SEAm9, и колонку, связанную с K293Fab-SEAm9, соединяли последовательно и предварительно промывали исходным буфером (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 при 4°С, содержащим 0,2% NP-40). Затем экстракт загружали на колонку при скорости потока 0,1 мл/мин и сквозной поток рециркулировали, а затем колонки промывали исходным буфером. Связанные антигены на каждой колонке элюировали градиентом диэтиламина, начиная от рН 7, который за 20 минут достигал значения 11. 0,5 мл фракций собирали, нейтрализовали 0,1 мл 1 М Трис-HCl, рН 6,7, и хранили при -20°С. Очистку проводили при 4°С с использованием системы ЖЭХБ (жидкостной экспресс-хроматографии белков) АКТА от Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). Проэлюированные фракции собирали, концентрировали, а затем анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Идентифицированные полосы белка вырезали и хранили при 4°С. Затем белки гидролизовали трипсином и N-концевую пептидную последовательность для отдельных пептидов определяли в Центре анализа белков (Karolinska Institute, Stockholm, Sweden).

ПРИМЕР 10

K293FabSEA/E11 способен подавлять рост опухолей у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID)

Суперантиген SEA обладает способностью активировать Т-лимфоциты с продуцированном цитокинов и цитотоксичности. Если этот суперантиген присоединить к реагирующему с опухолью антителу, то он может быть нацелен на опухолевые клетки. Локализация данного суперантигена в области опухоли приводит затем к селективному цитолизу опухолевых клеток.

Результат этого эксперимента представлен на фиг.14, который показывает, что у животных, обработанных K293FabSEA/E11, наблюдалось 80% снижение опухолевой массы по сравнению с контрольными животными, обработанными ненацеленными антителами (против меланомы) NRML-05-FabSEA (D227A).

Материалы и методы

Нескольким мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (Bommice, Ry, Denmark) внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали 5×10⁶ клеток злокачественных опухолей толстой кишки LS174T (АТСС, Rockville, MD) в 0,2 мл носителя (PBS-1% сыворотка BALb/c). Через 24 часа мышам инъецировали i.p. 20×10 ⁶ мононуклеарных клеток периферической крови человека (ПКМК), полученных путем отделения, на смеси Фиколл-Гипак, лейкоцитарных пленок, взятых у доноров крови в Университетской клинике в Лунде, Швеция. Через 1, 3 и 6 дней после инъецирования опухоли животных обрабатывали 100 мкг NRML-05FabSEA/D227A (6 животных) или 100 мкг K293FabSEA/E11 (7 животных). На 51-й день животных умерщвляли, опухолевые узлы удаляли и определяли их массу.

БИБЛИОГРАФИЯ

- Hoogenboom HR, de Bruine АР, Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC. Antibody phage display technology and its applications. (1998) Immunotechnology 4:1

- Kerbel RS. Significance of tumor-host interactions in cancer growth and metastases. (1995) Cancer Metastasis Rev 14:259

- Kohler G, Milstein C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. (1976) Eur J Immunol 6:511

- Tordsson J, Abrahmsen L, Kalland T, Ljung C, Ingvar С Brodin T. Efficient selection of scFv antibody phage by adsorption to in situ expressed antigens in tissue sections. (1997) J Immunol Methods 210:11

- Tordsson J, Lavasani S, Ohlsson L, Karlstrom P, Svedberg H, Abrahmsen L and Brodin T. A3 - a novel colon and pancreatic cancer reactive antibody from a primate phage library selected using intact tumor cells. Submitted to Int J Cancer.

- Williams KL. Genomes and proteomes: towards a multidimensional view of biology. (1999) Electrophoresis 20:678

НАДПИСИ К ГРАФИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ

Фиг.1. Принцип субтрактивного отбора. Специфическая адсорбция широко реактивного фага (черный) и снижение уровня непредставляющего и неспецифического фага (белый) путем промывок в процессе позитивного отбора. Затем элюировался опухоле-ограниченный фаг (контрольный).

Фиг.2. Эффективный субтрактивный отбор. Негативная адсорбция на срезах тканей матки или тонкой кишки с последующим позитивным отбором на клетках Соlо205 (А). Две повторных адсорбции на тканевых срезах матки, тонкой кишки или легких и позитивный отбор на тканевых срезах опухоли Соlо205 (В).

Фиг.3. Позднее обогащение панели тканеспецифического фага из субтрактивно отобранной библиотеки.

Фиг.4. Картина иммуногистохимического окрашивания scFv, отобранного из библиотеки. Окрашивание карциномы толстой кишки (А), эпителия толстой кишки (В) и пейеровых бляшек (С) антителом К302 scFv и К293 scFv (D-F). Окрашивание карциномы толстой кишки (G) и эпителия толстой кишки (Н) антителом К320 scFv и IIID9 scFv (J, К). Окрашивание эпителия толстой кишки антителом К294 scFv (I) и кровеносных сосудов толстой кишки антителом IIID11scFv (L).

Фиг.5. Иммуногистохимическая реактивность К293 scFv-SEA(D227A) по отношению к злокачественным опухолям толстой кишки (А) и к нормальной толстой кишке (В) и реактивность С215 Fab-SEA(D227A) по отношению к злокачественной опухоли толстой кишки (С) и к нормальной толстой кишке (D) при 100 нм. Прямоугольная черточка в (А) соответствует 100 мкм.

Фиг.6. Проточная цитометрия на свежих клетках злокачественной опухоли толстой кишки, полученных из вырезанной первичной карциномы толстой кишки человека. Клетки, отсортированные по размеру, гранулярность (А, В) и Ер-САМ, экспрессированные в качестве маркера эпителиальных клеток, были окрашены 5 мкг/мл К293 scFv-SEA(D227A) (серая линия) или гибридным белком без "первого" антитела, используемым в качестве негативного контроля (черная линия) (С).

Фиг.7. К293FabSEA/E11-окрашивание различных опухолей.

А. Окрашивание умеренно дифференцированных опухолей злокачественных опухолей толстой кишки давало яркую окраску клеток как злокачественных опухолей (показано стрелкой), так и муциноподобного материала (m) в железистых структурах.

В. Окрашивание высокодифференцированных злокачественных опухолей толстой кишки давало сильную окраску апикальной части (показано стрелкой) злокачественных клеток, а базальные части небольших опухолей (b) не давали какой-либо реакции.

С. Сильное окрашивание злокачественных клеток в опухоли молочной железы (показано стрелкой).

D. Сильное окрашивание злокачественных клеток в аденокарциноме легких (показано стрелкой). Прямоугольная черта в А соответствует 50 мкм, то же самое относится к B-D.

Фиг.8. А. К293FabSЕА/Е11-окрашивание нормальной толстой кишки. Отмечено апикальное окрашивание эпителиальных клеток (показано стрелкой). Иммунореакция наблюдается на внешнем эпителии полости толстой кишки, тогда как крипты (с) были негативными. В. К293FabSЕА/Е11-окрашивание нормальной молочной железы. В железистом эпителии (g) и в частях окружающей стромы (s) наблюдалось слабое или умеренное окрашивание. С. Нормальная молочная железа окрашивалась гибридным белком FabSEA, образованным между пан-эпителиальным маркером С215 и SEAD(227A) (FabC215SEA-D227A). Следует отметить сильное мечение клеток железистого эпителия (g). В стромальных частях (s) никакой реакции не наблюдалось. D. Нормальная молочная железа, используемая в качестве негативного контроля (без "первого" антитела), не обнаруживала реакции ни в клетках железистого эпителия (g), ни в стромальных частях (s). Прямоугольная черта в А соответствует 50 мкм. Черта в В соответствует 50 мкм, то же самое относится к С и D.

Фиг.9. Полутонкий срез злокачественной опухоли толстой кишки (А) и нормальной толстой кишки (В) был окрашен K293FabSEA/E11. В срезе злокачественных опухолей толстой кишки базальная (стрелка b), апикальная (стрелка а) и латеральная части опухолевых клеток были позитивно окрашены. В нормальной толстой кишке позитивное окрашивание наблюдалось в апикальной поверхности эпителиальных клеток (показано стрелкой). Электронная микроскопия показала, что иммунореакция локализуется на поверхности микроворсинок в эпителиальных клетках нормальной толстой кишки (С, показано стрелкой). Прямоугольная черта в А соответствует 30 мкм, и это также относится к В.

Фиг.10. Анализ на образование комплекса гибридных белков антитело-SEA" с компонентами плазмы, взятой у пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки и у здоровых пациентов. Построен график процента радиоактивности, проэлюированной в высокомолекулярной области. Отмечается высокий уровень связывания C242FabSEA с плазмой, взятой у пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки.

Фиг.11. Анализ фракции, проэлюированной с аффинной колонки, связанной с К293, проведенный с помощью электрофореза в нередуцирующем ПААГ с ДСН (дорожка 1). Главная полоса, отмеченная А, была вырезана для анализа аминокислотной последовательности. Указаны положения используемого стандарта молекулярных масс.

Фиг.12. N-концевые последовательности, SEQ ID NO: 3-5 в Списке последовательностей для трех триптических пептидных фрагментов из полосы белка 35-45 кДа (помеченной А), выделенной в результате К293-аффинной очистки (см. фиг.11).

Фиг.13. Иммунотерапевтическое действие гибридных белков FabSEA на рост опухолевых клеток LS-174T у мышей SCID, которым были введены мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК). Отмечается снижение массы опухоли (в мг) после обработки K293FabSEA/E11.