материал для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты

Формула изобретения

Применение высушенных и окрашенных препаратов соскобов из цервикального канала матки и уретры в качестве материала для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биологии и сельскому хозяйству, а именно к выделению дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК) из архивных препаратов для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР).

Уровень техники.

В литературе описаны устройства, предназначенные для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза. К таким устройствам относятся препараты, приготовленные нанесением исследуемого материала на 2 предметных стекла с последующей окраской одного метиленовой синькой для светового микроскопирования, второй препарат запасной. Лабораторные диагностические исследования. С.М. Плотичер, Киев, 1962, с.13-18. В них в качестве исследуемого материала используют выделения и соскобы из цервикального канала, уретры и влагалища. Справочник Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) под редакцией А.И.Карпищенко, Санкт-Петербург "Интермедика", 2001, с.114-124.

Сущность изобретения.

Задачей изобретения является увеличение времени хранения исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Эта задача достигается применением архивных препаратов в качестве исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Исследуемый материал готовят так: берут 2 препарата, один окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный, оставленные в архиве лаборатории лечебно-профилактического учреждения (далее - ЛПУ), наносят на мазки по 0,2 мл физиологического раствора и оставляют на 10 минут для получения суспензии исследуемого материала, затем осторожно перемешивают стеклянной палочкой суспензию до полного растворения мазков. Полученную суспензию отсасывают пипеткой и помещают ее в микрообъемы с крышкой (пробирки типа Эппендорф). Исследуемый материал готов. Таким образом готовят 2 материала на исследование из 2-х препаратов (один окрашенный, другой неокрашенный) от одного больного.

Получение исследуемого материала из архивных препаратов для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР увеличивает время его хранения, т.к. ДНК этих возбудителей в препаратах сохраняются долго, год и более.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

При выявлении у больных возбудителей гонореи и трихомониаза препараты их оставляют в архиве ЛПУ согласно приказу Министерства здравоохранения СССР от 4 декабря 1986 г. №1570. Приложение 1, с.1-10 "Об улучшении выявления больных гонореей и трихомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах поликлиник". Согласно приказу оставляют 2 препарата от каждого больного гонореей или трихомониазом, 1 препарат окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный. Из них готовят два исследуемых материала для выделения ДНК и последующего обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Выделение ДНК из полученного исследуемого материала производят, используя готовые наборы реагентов разных фирм, например ЗАО "НПФ ДНК-Технология" (Россия).

Далее амплификацию выделенных ДНК и детекцию результатов амплификации производят на оборудовании для ПЦР анализа, например, на АйСайклер Ай Кью (I Cycler I Q) с оптической приставкой фирмы Bio-Rad (США).

Принцип метода состоит в следующем. Вначале производится лизис анализируемых образцов в лизирующем буфере. Затем выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР), суть которой заключается в том, что методом амплификации ин витро в течение нескольких часов выделяется и размножается определенная последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в миллионы раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие участок ДНК, специфический для определяемого патогенного агента. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Медицинские лабораторные технологии, том 2 под редакцией А.И.Карпищенко, Санкт-Петербург "Интермедика", 2002, с.533-570. В таблице показаны результаты ПЦР анализа на трихомонады на этом оборудовании, проведенного 10 сентября 2003 года.

Первая колонка таблицы - координаты лунки в 96-луночном планшете, вторая - номер цикла амплификации, третья - фамилия больного и метод окраски мазков. Например, ДНК, выделенная из архивного препарата окрашенного метиленовой синькой от больной Сыроватской, находится в лунке С4, ее же ДНК, выделенная из архивного неокрашенного препарата, находится в лунке С9.

В лунке F8 находится положительный контрольный материал на трихомонады, а в F9 - отрицательный контрольный материал на трихомонады.

Из таблицы видно, что на ПЦР исследование взяты материалы от 5 женщин:

1. Сыроватская (SUROV), в ее окрашенном метиленовой синькой препарате от 1 февраля 2002 г. при световой микроскопии были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

2. Каратаева (KARAT), в окрашенном препарате от 25 августа 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

3. Новгородова (NOVG), в окрашенном препарате от 31 января 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

4. Петрова (PETR), также в окрашенном препарате от 7 марта 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

5. Ядрихинская (YEDRICH), также в окрашенном препарате от 17 апреля 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

Эти женщины лечились в гинекологическом отделении Якутской городской клинической больницы №1, препараты от каждой (один окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный) хранились в клинико-диагностической лаборатории больницы. Сроки хранения препаратов составляют один год и более, поэтому они названы архивными препаратами.

Из таблицы видно, что во всех препаратах, из которых были приготовлены исследуемые материалы после одного года и более хранения, сохранились ДНК Trichomonas vaginalis (трихомонад).

Обнаружение, амплификация и детекция специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis методом ПЦР графически представлены на чертеже.

Обозначение на чертеже:

С4, С5, С6, С7, С8, С9, F4, F5, F6, F7, F8, F9 - лунки планшета, в которых находятся выделенные ДНК, цвет каждой лунки соответствует цвету кривой амплификации ДНК Trichomonas vaginalis на координатной плоскости. Например, в лунках С4 и С9 находились выделенные ДНК Trichomonas vaginalis из 2-х препаратов больной Сыроватской (SUROV, см. таблицу). Кривая темно-синего цвета на координатной плоскости, пересекающая линию Threshold Position на 12 (11,0) цикле амплификации, свидетельствует об обнаружении, амплификации и детекции специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в лунке С4. То же самое в лунке С9, только кривая темно-зеленого цвета.

В лунке С4 находились выделенные ДНК Trichomonas vaginalis из препарата Сыроватской, окрашенного метиленовой синькой, а в лунке С9 выделенные ДНК из ее же неокрашенного препарата.

То же самое в парах лунок:

С5 и F4 - выделенные ДНК из препаратов Каратаевой и соответствующие им цветные кривые.

С6 и F5 - выделенные ДНК из препаратов Новгородовой и соответствующие им цветные кривые.

С7 и F6 - выделенные ДНК из препаратов Петровой и соответствующие им цветные кривые.

С8 и F7 - выделенные ДНК из препаратов Ядрихинской и соответствующие им цветные кривые.

F8 - положительный контроль Trichomonas vaginalis и соответствующая кривая синего цвета, пересекающая линию Threshold Position на 19 (18,1) цикле амплификации.

F9 - отрицательный контроль Trichomonas vaginalis и соответствую кривая вишневого цвета, проходящая ниже линии Threshold Position.

Вывод: применение архивных препаратов в качестве исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР дает достоверные и воспроизводимые результаты.

Таблица PCR Amplification vs Cycle: Data 10-Sep-03 1439.opd
	Threshold Cycle Ct	Identifier
С4	11.0	SUROV METIL
С5	15.1	KARAT METIL
С6	12.3	NOVG METIL
С7	13.3	PETR METIL
С8	15.3	YEDRICH METIL
С9	19.1	SUROV MAZOC NEOKR
F4	19.5	KARAT MAZOC NEOKR
F5	14.9	NOVG MAZOC NEOKR
F6	18.4	PETR MAZOC NEOKR
F7	18.2	YEDRICH MAZOC NEOKR
F8	18.1	POS TRICH
F9	N/A	NEG TRICH