способ получения контрольной плазмы с нормальным уровнем протромбинового комплекса

Формула изобретения

Способ получения лиофилизированной контрольной плазмы с нормальным уровнем протромбинового комплекса, включающий взятие крови от доноров во флаконы с консервантом, отделение плазмы центрифугированием при 1800-2000 об/мин в течение 30 мин, отделение ее от форменных элементов, объединение плазмы доноров в пул, центрифугирование пула при тех же условиях, розлив и лиофилизацию, отличающийся тем, что после повторного центрифугирования к пулу плазмы добавляют буферное вещество HEPES до конечной концентрации (0,004±0,0005)М, затем замораживают и закаливают при температуре не выше -38°С в течение 4-6 ч, лиофилизацию проводят, начиная с температуры продукта не выше - (54±14)°С с выходом на положительную температуру через (10±1) ч и завершением процесса лиофилизации при температуре +(12±3)°С, используя график сушки продолжительностью (17±1) ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается получения лиофилизированного диагностического реагента - контрольной плазмы с нормальным и стабильным в течение не менее 1 года уровнем факторов протромбинового комплекса, используемого для расчета протромбинового индекса (%-ПИ) по формуле и/или построения калибровочного графика для расчета активности факторов протромбинового комплекса.

В настоящее время существуют многочисленные модификации методов определения указанных прокоагулянтов, при воспроизведении которых используют разные контрольные реагенты для построения калибровочных графиков и аналитических расчетов по формуле. Это затрудняет получение сравнимых результатов. Зарубежные фирмы (Boehringer Mannheim, Dade, Sigma, George king bio-medical, Hospitex diagnostics, Human, Grifols, Biomerieux) выпускают лиофилизированные реагенты: Международные и Национальные. Однако технология их изготовления запатентована. Кроме того, импортные диагностикумы и тест-системы дорогостоящие.

В качестве прототипа использован разработанный нами ранее "Способ получения донорской стандарт-плазмы" (патент N 1592717, авторы: Г.К.Платонова, Л.Н.Тарасова). Существенным недостатком прототипа является то, что используемый график сушки достаточно продолжителен и составляет не менее 24 часов; максимальная температура продукта не выше +5°С. Кроме того, дорогостоящий реагент HEPES вводят непосредственно в консервирующий раствор перед взятием крови; происходит его потеря при осаждении форменных элементов.

Целью настоящего изобретения является получение диагностического реагента - контрольной плазмы из свежего донорского пула, объединенного не менее чем от 15 доноров, содержащего нормальный уровень протромбинового комплекса, стабильного в течение 1 года, для расчета протромбинового индекса по формуле (%-ПИ) и/или построения калибровочного графика для расчета активности факторов протромбинового комплекса.

Поставленная цель достигается тем, что буферное вещество HEPES вносят в плазму из расчета 0,004±0,0005 М после отделения форменных элементов, а не в донорскую кровь, и высушивают методом лиофилизации по следующему графику сушки: начальная температура продукта не выше минус 54±14°С, выход на положительную температуру через 10±1 час и завершение при температуре 12±3°С; продолжительность процесса сублимации равняется 17±1 час.

После лиофилизации определяют потерю в массе при высушивании, которая не должна превышать 2%; рН 7,35±0,15; протромбиновый индекс должен находиться в пределах 99±5%, концентрация фибриногена 2,75±0,75.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА

Контрольную плазму с нормальным уровнем факторов протромбинового комплекса получают следующим образом: кровь не менее 15 доноров берут во флаконы с консервантом (цитрат натрия, азид натрия и контрикал) в соотношении 9:1. Центрифугируют при 1800-2000 об/мин и температуре +(4-6)°С в течение 30 минут. Полученные образцы плазмы каждого донора отделяют от форменных элементов, смешивают, получая пул, и повторно центрифугируют при том же режиме. Супернатант отделяют и добавляют в него буферное вещество HEPES до конечной концентрации 0,004±0,0005 М. Полученную нативную контрольную плазму разливают по 1 мл в силикони-рованные пенициллиновые флаконы емкостью 10 мл. Замораживают и закаливают на плите сублиматора при температуре не выше -38°С в течение 4-6 часов. Сублимационную сушку проводят согласно графику сушки контрольной плазмы (табл.2, чертеж).

После лиофилизации определяют потерю в массе при высушивании диагностического реагента, протромбиновый индекс (%-ПИ), а также концентрацию фибриногена. В качестве контроля при расчете %-ПИ используют пул свежей плазмы не менее 20 доноров. Если этот показатель находится в пределах 99±5%, а концентрация фибриногена (Ф) не менее 2,0 г/л, реагент используют как контрольную плазму для расчета протромбинового индекса и/или активности факторов протромбинового комплекса при проведении исследований с пробами плазмы больных и/или здоровых лиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

(проведены на базе лаборатории биохимии крови ГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови и Республиканской станции переливания крови при институте).

Разработанный способ использован при получении 5 серий контрольной плазмы. При изготовлении серий 040901, 010302, 020602, 030902 и 041202 использовали кровь 17, 17, 16, 18 и 20 доноров соответственно. Потеря в массе при высушивании реагента всех полученных серий не превышала 2%. Определение рН, протромбинового индекса и фибриногена образцов контрольной плазмы проводили после лиофилизации, через 6 и 12 мес. Результаты исследований приведены в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что полученный реагент можно применять как контрольную плазму с нормальным и стабильным в течение не менее 1 года уровнем факторов протромбинового комплекса и использовать для расчета протромбинового индекса (%-ПИ) по формуле и/или построения калибровочного графика для расчета активности протромбинового комплекса.

Разработанный способ найдет применение при создании производственной технологии изготовления отечественной контрольной донорской плазмы, использование которой в клинико-диагностических и специализированных гемостазиологических лабораториях удобно, позволяет получить сравнимые результаты исследований; кроме того, реагент значительно дешевле зарубежных аналогов.

Таблица 1
Некоторые показатели контрольной плазмы в процессе хранения
№ серии	Срок хранения (месяцы)
	После лиофилизации			6			12
	рН	%ПИ	Ф г/л	рН	%ПИ	Ф г/л	рН	%ПИ	Ф г/л
040901	7,35	98,5	2,75	7,38	97,0	3,00	7,40	96,5	3,00
010302	7,25	99,0	3,00	7,28	98,5	2,50	7,30	98,0	2,00
020602	7,35	99,0	3,50	7,40	98,5	3,00	7,43	100,0	2,75
030902	7,29	99,0	2,50	7,32	98,0	2,75	7,35	97,5	2,75
041202	7,30	99,5	2,50	7,31	98,0	3,00	7,30	97,0	3,00

Таблица 2
ГРАФИК СУШКИ Контрольной плазмы серии 020602
Порядковый номер	Время регистрации процесса лиофилизации (час)	Температура кассеты (в град С)	Температура продукта (в град С)
1	19	-68	-46
2	20	-67	-44
3	21	-26	-33
4	22	-25	-29
5	23	-15	-24
6	24	-15	-23
7	1	0	-18
8	2	+4	-15
9	3	+5	-8
10	4	+5	0
11	5	+6	+3
12	6	+6	+4
13	7	+7	+6
14	8	+7	+7
15	9	+8	+8
16	10	+9	+9
17	11	+10	+10