способ фракционирования эритроцитов в градиенте плотности раствора агарозы

Формула изобретения

Способ фракционирования эритроцитов путем наслоения эритроцитарной массы на градиент плотности, центрифугирования, отделения раствора, содержащего легкую фракцию, наслоения осадка на градиент плотности, центрифугирования, отделения раствора, содержащего среднюю фракцию, от осадка, содержащего тяжелую фракцию с последующей очисткой каждой фракции от остатков градиента плотности, отличающийся тем, что эритроцитарную массу наносят на 1%-ный раствор агарозы, для отделения раствора, содержащего легкую фракцию, центрифугируют при 5000 g, осадок наслаивают на 1,5%-ный раствор агарозы, для отделения средней фракции от тяжелой центрифугируют при 6000 g, а очистку каждой фракции осуществляют с помощью хроматографической колонки со стеклофильтром.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к способу фракционирования эритроцитов, циркулирующих в кровяном русле.

Наиболее близким к заявляемому является способ разделения эритроцитов в градиенте плотности яичного альбумина (Т.Б. Кобозев, Н.А. Троицкая, В.И. Купренко, Н.А. Кобозева // Патология систем крови и кровообращения. - Симферополь, 1978. - с.49-51).

В соответствии с этим способом эритроцитарную массу, предварительно отделенную от плазмы, наслаивают на 28% раствор яичного альбумина и центрифугируют 10 мин (1400 g). Эритроциты, оставшиеся на поверхности раствора, отбираются - легкая фракция, а осевшие на дно пробирки наслаивают на 43% раствор яичного альбумина и центрифугируют 10 мин (1400 g). Эритроциты, оказавшиеся на поверхности, отделяются, - средние эритроциты, от осевших на дно пробирки - тяжелая фракция. Полученные три фракции эритроцитов отмывают от остатков яичного альбумина 0,15 М раствором NaCl.

Недостатками описанного способа разделения эритроцитов на фракции является дорогое сырье для приготовления градиента плотности, длительность разделения эритроцитарного пула и значительное загрязнение каждой фракции эритроцитов остатками яичного альбумина.

Задачей изобретения является уменьшение материальных и временных затрат и получение трех фракций эритроцитов, полностью очищенных от градиента плотности.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве градиента плотности поочередно используется 1% и 1,5% раствор агарозы (34°С) в 0,9% растворе NaCl. Постоянная температура растворов поддерживается в термостате. В данных условиях растворы агарозы приобретают плотность, необходимую для создания градиента, в котором и будут разделяться эритроциты. Эритроцитарная масса сначала наслаивается на 1% раствор агарозы и центрифугируется 10 мин (5000 g), затем осевшие на дно эритроциты наносят на 1,5% раствор агарозы и центрифугируют 10 мин (6000 g). В обоих случаях после центрифугирования извлекается верхний слой агарозного геля, содержащий легкие и средние эритроциты соответственно. Тяжелые эритроциты, осевшие на дно пробирки, собираются после второго центрифугирования. Очистка фракций эритроцитов от остатков градиента плотности проводят в хроматографической колонке со стеклофильтром.

Осуществление заявленного способа поясняется следующим примером технологического процесса.

Предварительно готовят 1% раствор агарозы (34°С) в 0,9% растворе NaCl. Проверяют ареометром плотность полученного раствора, которая должна равняться 1,077-1,079 г/мл, что соответствует плотности легкой фракции эритроцитов. Четыре миллилитра эритроцитарной массы, предварительно отделенной от плазмы, наслаивают на 20 мл приготовленного раствора и центрифугируют 10 мин (5000 g). Верхний слой агарозного геля, содержащий фракцию легких эритроцитов, удаляют, а красные клетки крови, прошедшие через градиент плотности, повторно наслаивают на 20 мл 1,5% раствора агарозы (34°С) в 0,9% растворе NaCl и центрифугируют 10 мин (6000 g). Плотность данного раствора должна быть 1,086-1,096 г/мл, что соответствует плотности средних эритроцитов. После второго центрифугирования верхний слой содержит среднюю фракцию, а осевшие на дно пробирки клетки - тяжелая фракция, обладающая плотностью 1,107 г/мл. Для очистки групп клеток от агарозного геля применяют хроматографическую колонку со стеклофильтром, через которую пропускают каждую фракцию в отдельности.

Достоверность разделения эритроцитарного пула на фракции контролировалась микроскопическими методами - определение диаметра эритроцитов в каждой из фракций, а также физическими маркерами, в качестве которых выступали степень деформации клетки и вязкость плазматической мембраны (см. таблицу).

Таблица Физические характеристики эритроцитов, фракционированных в градиенте плотности раствора яичного альбумина и раствора агарозы
Физические характеристики	Градиент плотности	Фракции эритроцитов
		легкие	средние	Тяжелые
Относительная вязкость	альбумин	2.21±0.16	2.43±0.11	2.61±0.16
	агароза	2.30±0.12	2.41±0.18	2.63±0.20
Средний диаметр	альбумин	8.19±0.38	7.22±0.27	5.94±0.23
	агароза	8.33±0.18	7.12±0.41	6.01±0.21
Коэффициент деформируемости	альбумин	0.571±0.030	0.603±0.022	0.634±0.019
	агароза	0.565±0.025	0.598±0.030	0.637±+0.022
Определение относительной вязкости для каждой из фракций проводилось при величине гематокрита 40%. Коэффициент деформируемости определялся по методу С.И.Моисеева, В.С.Гуревич. (Чем меньше коэффициент, тем выше коэффициент деформируемости. При снижении деформируемости коэффициент приближается к единице).

Данные таблицы показывают, что градиент плотности раствора агарозы позволяет также эффективно фракционировать эритроциты на три группы, как и раствор яичного альбумина, но существенным недостатком последнего является загрязненность отдельных белков клеточных мембран эритроцитов остатками градиента плотности, что отчетливо видно на электрофореграммах.

Изобретение поясняется чертежом.

На чертеже - электрофореграммы белковых спектров клеточных мембран эритроцитов, фракционированных:

1 - в градиенте плотности раствора агарозы,

2 - в градиенте плотности раствора яичного альбумина.

Белок полосы 5 - актин, обладает способностью связывать яичный альбумин, что значительно деформирует результаты количественного анализа белков клеточных мембран эритроцитов, фракционированных в градиенте плотности раствора яичного альбумина. В то же время, белковый спектр мембран эритроцитов, фракционированных в градиенте плотности раствора агарозы, не претерпевает никаких изменений, что позволяет точно анализировать количественные характеристики белковой компоненты клеточных мембран эритроцитов в их онтогенезе.

Таким образом, результаты исследования доказывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно разделять эритроциты, циркулирующие в кровяном русле, на легкие, средние и тяжелые фракции, очищенные от примесей градиента плотности с минимальными временными и материальными затратами.