способ регистрации активных форм кислорода в семенной жидкости для оценки фертильности

Формула изобретения

Способ определения фертильности мужчин путем регистрации активных форм кислорода в семенной жидкости с помощью хемилюминесценции эякулята, отличающийся тем, что сначала проводят люминолзависимую хемилюминесценцию и при светосумме, превышающей 2,9±0,8 отн.ед., отделяют лейкоциты из эякулята путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности, затем проводят повторное измерение люминолзависимой хемилюминесценции семенной жидкости и вновь определяют светосумму свечения и при сохранении высоких значений ее параметров эякулят оценивают как инфертильный.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологии репродукции.

Общепринятым для оценки мужской фертильности является изучение параметров эякулята, куда входят макроскопические, микроскопические, биохимические и функциональные критерии. Оценка показателей спермограммы в значительной степени субъективна и зависит от характеристик исследуемого образца: чем выше концентрация сперматозоидов в эякуляте и чем меньше доля прогрессивно подвижных форм, тем менее согласуются результаты разных лаборантов. В ряде случаев низкая частота оплодотворения в культуре является следствием функциональных аномалий сперматозоидов, не выявляемых при анализе традиционных показателей спермограммы (Леонтьева О.А., Воробьева О.В., Козлов В.В., 2000). С другой стороны, стандартные методы диагностики не всегда позволяют судить о причинах изменения функций сперматозоидов (Руководство ВОЗ, 1999). Таким образом, результаты рутинных исследований эякулята недостаточно надежны с клинической точки зрения, так как в ряде случаев фертильность бывает не нарушена при значительных отклонениях спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться у мужчин с нормозооспермией (Liu D., Baker H.W.G., 1992).

В последнее время появляются публикации, свидетельствующие о влиянии свободно-радикального окисления на процессы репродукции (Conte G., Milandi D., De Marinis L., 1999). В частности, доказана способность сперматозоидов к образованию свободных радикалов, получивших обобщающее название - активные формы кислорода: супероксидный анион-радикал, анион-радикал гидроксила, синглентная форма кислорода, перекись водорода и гипохлорит. Проблема действия активных форм кислорода на сперматозоиды в настоящее время мало изучена. Ясно лишь, что избыток активных форм кислорода может оказать негативное влияние на половые клетки (Aitken R.J., 1999).

Известен способ измерения радикалов в суспензии сперматозоидов при добавлении хемилюминесцентных соединений (люминол и люцигенин), взятый за прототип (Руководство ВОЗ, 1999, с.113-115). Данный метод применяется в суспензии клеток, приведенной к определенной концентрации. К недостаткам метода можно отнести необходимость унифицирования числа сперматозоидов, нестабильность применяемых реактивов, отсутствие нормативных критериев.

Технический результат - упрощение и повышение специфичности способа за счет стабильности используемых реактивов и получение референтных значений для оценки мужской фертильности.

По предложенному методу проведена оценка семенной жидкости 10 мужчин, состоящих в браке и имеющих здоровое потомство. Эякулят этих пациентов был использован в программе донорской инсеминации. Для сравнительной оценки проведено исследование 31 бесплодного мужчины.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Перед измерением свечения 0,1 мл исследуемой спермы смешивают с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10^-5 М, тщательно перемешивают и ведут запись хемилюминесценции при 37°С в течение 5 мин.

Исследование проводят в течение 1 часа после разжижения.

При величине светосуммы, превышающей 2,9±0,8 отн.ед., даже при нормальном содержании лейкоцитов, проводят разделение клеток путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности и определяют уровень люминолзависимой хемилюминесценции (в качестве градиента плотности используется фиколл/гипак: 20 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл. рН приготовленного градиента доводится до 7.5. Для разделения клеток 1 мл эякулята наслаивается на 1 мл приготовленного градиента и центрифугируется при 500 g в течение 20 минут).

Полученный уровень люминолзависимой хемилюминесценции является показателем количества активных форм кислорода, генерируемых половыми клетками.

Исследуют спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию эякулята прибором «Хемилюминомер-003». Регистрируют спонтанную светимость, максимальную светимость и светосумму свечения. Полученные результаты выражают в условных единицах по отношению к эталону свечения СФХМ - 1ГОСТ 9411-81, суммарный световой поток которого составляет 5,1×105 квант/сек.

На чертеже изображен предлагаемый способ.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Клинический пример 1. Наблюдаемый Ч. 27 лет, состоит в первом браке в течение 4-х лет, имеет одного здорового ребенка двухлетнего возраста мужского пола. Работа не имеет профессиональных вредностей. Проживает в г. Уфе.

По данным объективного обследования: нормостеник, рост 182 см, вес 80 кг, привычные интоксикации отсутствуют. Вторичные половые признаки по мужскому типу. Яички D=S, 4 см, плотноэластической консистенции, придатки не изменены.

Per rectum - предстательная железа эластической консистенции, не увеличена, поверхность гладкая, срединная бороздка четкая, семенные пузырьки не пальпируются.

Данные лабораторного обследования:

1. Сок предстательной железы - лейкоциты единичные в поле зрения, лецитиновые зерна в большом количестве.

2. Спермограмма - концентрация сперматозоидов 138 млн/мл, подвижность категории «а» - 37%, «в» - 23%, «с» - 10%, «d» - 30%, нормальные морфологические формы 64%, объем 3 мл, серо-белого цвета, рН - 7,5, вязкость - 0,5 см, лейкоциты менее 1 млн/мл.

3. Уровень гормонов: ФСГ - 1,2 мМЕ/мл (норма), пролактин - 265 мМЕ/мл (норма), тестостерон - 16.5 нг/мл (норма).

4. Исследование мазка из уретры методом полимеразной цепной реакции: Ch.trachomatis - отриц., М.hominis - отриц., М.genitalium - отриц., Ureaplasma - отриц., N.gonorrhoae - отриц., Trichomonas - отриц.

5. Кровь на RW, ВИЧ, HBS-ag - отрицательный результат.

Наблюдается в Республиканском центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией в течение 2-х лет. В данный период времени наблюдаемый Ч. работал по программе инсеминации спермой донора, его сперма использована для хранения в криоконсервированном виде для проведения процедур донорской инсеминации. Материал применялся для искусственной инсеминации в 13 натуральных циклах у женщин с различной фертильностью, зарегистрировано две нормально развивающиеся беременности.

Для определения уровня активных форм кислорода использован нативный эякулят наблюдаемого. Показатели люминолзависимой хемилюминесценции цельной спермы: светосумма (СС) - 1,61 отн.ед, спонтанная светимость (СпС) - 0,41 отн.ед., максимальная светимость (Мс) - 0,43 отн.ед.

Показатели люминолзависимой хемилюминесценции отмытых сперматозоидов: СС - 1,72 отн.ед, СпС - 0,6 отн.ед., Мс - 1,53 отн.ед.

Показатели люминолзависимой хемилюминесценции спермоплазмы: СС - 0,93 отн.ед, СпС - 0,49 отн.ед., Мс - 0,26 отн.ед.

Резюме: фертильность наблюдаемого доказана рождением одного ребенка и наступлением двух зарегистрированных беременностей. Данные параметров эякулята, согласно стандартному лабораторному исследованию, соответствуют нормативам ВОЗ. Показатели люминолзависимой хемилюминесценции соответствуют средним показателям группы контроля.

Клинический пример 2. Наблюдаемый В. 27 лет, состоит в первом браке в течение 2,5 лет, детей не имеет. Рабочий. Проживает в г. Стерлитамаке республики Башкортостан. Профессиональные вредности: контакт с продуктами нефтепереработки. Из анамнеза: острая гонорея - лечился.

По данным объективного обследования: нормостеник, рост 176 см, вес 74 кг, курит. Вторичные половые признаки по мужскому типу. Яички D - 4,5 см, S - 4,5 см, плотноэластической консистенции, определяется умеренное расширение семенных вен слева при проведении пробы Вальсальвы, пальпация тестикул безболезненна.

Per rectum - предстательная железа эластической консистенции, не увеличена, поверхность гладкая, срединная бороздка четкая, семенные пузырьки не пальпируются.

Данные лабораторного обследования:

1. Сок предстательной железы - лейкоциты единичные в поле зрения, лецитиновые зерна в большом количестве.

2. Спермограмма - концентрация сперматозоидов 72,5 млн/мл, подвижность категории «а» - 38%, «в» - 20%, «с» - 14%, «d» - 28%, нормальные морфологические формы 77%, объем 3,2 мл, серо-белого цвета, рН - 7,2, вязкость - 0,5 см, лейкоциты менее 1 млн/мл.

1. Уровень гормонов: ФСГ - 1,3 мМЕ/мл (норма), пролактин - 310 мМЕ/мл (норма), тестостерон - 15,1 нг/мл (норма).

2. Исследование мазка из уретры методом полимеразной цепной реакции: Ch.trachomatis - отриц., М.hominis - отриц., М.genitalium - отриц., Ureaplasma - отриц., N.gonorrhoae - отриц., Trichomonas - отриц.

3. Кровь на RW, ВИЧ, HBS-ag - отрицательный результат.

4. При ультразвуковой доплерографии сосудов мошонки выявлен стойкий патологический рефлюкс в области левых семенных вен при натуживании.

Наблюдается в Республиканском центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией в течение двух месяцев. Диагноз: Субклиническое варикоцеле слева. Нормоспермия.

Для определения уровня активных форм кислорода использован нативный эякулят наблюдаемого. Показатели люминолзависимой хемилюминесценции цельной спермы: СС - 69,61 отн.ед, СпС - 14,57 отн.ед., Мс - 16,37 отн.ед.

Показатели люминолзависимой хемилюминесценции отмытых сперматозоидов: СС - 34,61 отн.ед, СпС - 8,54 отн.ед., Мс - 9,8 отн.ед.

Показатели люминолзависимой хемилюминесценции спермоплазмы: СС - 1,41 отн.ед, СпС - 0,03 отн.ед., Мс - 0,38 отн.ед.

Резюме: у наблюдаемого выявлены патологические характеристики кровотока по венам левого семенного канатика. Не выявлено нарушений морфофункциональных характеристик эякулята при проведении стандартных методов оценки. Уровень люминолзависимой хемилюминесценции нативной спермы превышал нормативные показатели контрольной группы. После удаления лейкоцитов из образца параметры люминолзависимой хемилюминесценции сохраняют высокие значения. Это свидетельствует о повышенной генерации активных форм кислорода сперматозоидами.

Разработанный комплексный метод хемилюминесцентного исследования процессов генерации активных форм кислорода в эякуляте рекомендуется применять для оценки мужской инфертильности в клинической урологии как эффективный дополнительный метод диагностики.