штамм бактерий bacillus pumilus км мгу 467, стимулирующий прорастание семян орхидей, и способ его использования

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Bacillus pumilus KM МГУ 467 для увеличения всхожести и ускорения прорастания семян редких и исчезающих видов наземных и эпифитных орхидей в культуре in vitro.

2. Способ бактеризации семян орхидей путем помещения семян на поверхность агаризованной питательной среды с их последующей бактеризацией культурой бактерий, стимулирующей прорастание семян, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для прорастания семян и для выращивания культуры бактерий используют модифицированную среду Knudson-C, бактеризацию семян осуществляют путем нанесения биомассы бактерий Bacillus pumilus KM МГУ 467 в виде пасты на поверхность питательной среды с семенами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения - новый штамм бактерий, стимулирующий в искусственных условиях прорастание и ускоряющий развитие семян редких и исчезающих видов орхидей, а также способ его использования.

В связи со стремительным сокращением численности и разнообразия дикорастущих орхидей в настоящее время для их сохранения применяют вегетативное, микроклональное и семенное размножение этих растений. Первое сопряжено с длительным периодом формирования генеративно-зрелого растения, второе и третье - со сложностью подбора сочетания и концентраций фитогормонов и добавок растительного и грибного происхождения для успешного развития эксплантатов и семян.

Известно, что многие штаммы бактерий оказывают благоприятное влияние на рост, развитие и продуктивность растений. Бактеризация семян орхидных, однако, не применяется, хотя в 1922 году был известен штамм клубеньковой ризобактерии Bacillus radicicola (современное название - Rhizobium leguminosarum), который целесообразно взять за прототип (1). Этот штамм, выделенный из люцерны и добавленный в виде водного раствора к семенам эпифитных орхидей, стимулировал их развитие в культуре in vitro (во флаконах). В качестве питательных сред были использованы среды Пфефера, Эшби и раствор В (современное название среды Knudson-B). Аналоговый штамм способствовал активному прорастанию 80% семян орхидей из рода Epidendron и 50% семян орхидей из рода Laelia-Cattleya, что выражалось в формировании листочков у проростков и их интенсивном зеленом цвете. В неинокулированных контрольных вариантах взошедшие 20% семян Laelia-Cattleya, несмотря на сформированную точку роста, были ахлорофилльными.

Штамм-прототип к настоящему моменту утерян, а основными недостатками аналога изобретения являются следующие:

1. Узкий спектр действия штамма-прототипа. Стимулирующий эффект Bacillus radicicola (Rhizobium leguminosarum) продемонстрирован только на семенах эпифитных тропических орхидей.

2. Создание повышенной влажности при проращивании семян орхидей. При добавлении к семенам водной суспензии бактериальной культуры in vitro увеличивается влажность, что отрицательно сказывается на прорастании семян.

3. Использование питательных сред, не оптимальных для проращивания семян орхидей. Среда Эшби, при использовании которой был отмечен наиболее очевидный стимулирующий эффект воздействия штамма-прототипа, более пригодна для культивирования азотфиксирующих микроорганизмов, чем для проращивания семян орхидей. Результатом использования этой питательной среды могла быть заниженная всхожесть семян орхидей в контрольном варианте.

Целью предлагаемого изобретения является получение эффективного штамма бактерий для бактеризации семян орхидей, увеличивающего их всхожесть и ускоряющего их прорастание и развитие, обладающего широким спектром действия, а также разработка условий для его использования.

Указанная цель достигается штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467. В отличие от штамма-прототипа заявленный штамм стимулирует прорастание и развитие различных представителей семейства орхидных: тропических эпифитных орхидей из рода Dendrobium Sw. (D. crumenatum, D. nobile, D. leonis, D. moschatum), тропической наземной орхидеи Paphiopedilum barbatum, американской наземной (литофитной) орхидеи Ponthieva racemosa, а также наземной орхидеи умеренного климата - Dactylorhiza fuchsii. К преимуществам заявляемого штамма Bacillus pumilus KM МГУ 467 можно отнести его легкость в культивировании, хранении и использовании (непосредственный подсев биомассы бактерий к семенам орхидей). Штамм эффективен при использовании модифицированной среды Knudson-C (состав приведен ниже), оптимальной для культивирования различных видов орхидей. На этой среде штамм культивируют как до бактеризации семян, так и при их совместном культивировании.

В отличие от штамма-прототипа, выделенного из люцерны, штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 был изолирован из ризопланы корней эпифитной орхидеи Dendrobium leonis (Lindl.) Rchb.f, интродуцированной в Фондовую оранжерею ГБС им. Н.В. Цицина РАН в 1986 г. из Вьетнама. Выделение проводили на модифицированной среде Knudson-C. Критериями отбора служили следующие свойства: способность стимулировать прорастание семян эпифитных и наземных видов орхидей из тропической и умеренной климатических зон, а также способность обеспечивать прорастание и развитие семян и сеянцев орхидных на максимально простой по составу и недорогостоящей агаризованной среде, используемой для проращивания орхидных.

Штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 депонирован в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова под регистрационным номером 467.

Штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 обладает следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные прямые палочки 3,0-5,0×0,7-0,9 мкм, одиночные, в парах и коротких цепочках. Размеры клеток приведены для односуточной культуры, выращенной на среде МПА при 30°С. Образуют термоустойчивые споры. Споры имеют форму эллипса, расположены центрально, спорангий не расширен. При росте на МПА штамм образует колонии диаметром 2-3 мм серовато-белого цвета, круглые, плоские с гладкой поверхностью, слабо зубчатым краем и матовым блеском. Штамм хорошо растет как на плотных (МПА - мясо-пептонный агар), так и на жидких (МПБ - мясо-пептонный бульон) средах.

Физиологические свойства.

Анаэробно не растет, каталазо- и оксидазоположительный. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, маннит. Газ из глюкозы не образует. Гидролизует казеин и желатин, не сбраживает крахмал. Потребляет цитрат, не использует пропионат и не восстанавливает нитрат. Не растет при 55°С, отмечен рост при 5 и 7% NaCl. Реакция Фогеса-Проскауэра на образование ацетоина положительная. Фенилаланин не дезаминирует. Индол не образует.

Культура чувствительна к следующим антибиотикам: олеандомицину, стрептомицину, гентамицину, пенициллину, канамицину, левомицетину, неомицину, тетрациклину. Штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 непатогенен и безопасен для здоровья человека.

При длительных пересевах штамм диссоциирует.

Хранение штамма. Штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 хранится на картофельном агаре и на МПА при комнатной температуре под вазелиновым маслом. Можно хранить и на средах без масла с пересевами. Культура хорошо сохраняется в лиофильно-высушенном состоянии в сахарозо-желатиновой среде.

Для решения поставленной цели предлагается способ бактеризации штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467 с помощью непосредственного подсева бактериальной биомассы к семенам. Осуществляемый способ предусматривает культивирование заявленного штамма в течение 3-4 суток на минеральной модифицированной среде Knudson-C следующего состава (г):

Са(NO3)2 ·4Н2O	1,0
(NH4) 2SO4	0,5
КН2PO 4	0,25
MgSO4·7H2O	0,25
FeSO 4·7H2O	0,025
MnSO4 ·4H2O	0,075
сахароза	20,0
активированный уголь	1,0
агар	15
вода дистиллированная	1000 мл

Зрелые, отмытые от стерилизующего агента семена орхидей вносят во флаконы с герметичными крышками с застывшей агаризованной питательной средой Knudson-С. С помощью стерильной бактериальной иглы или петли биомассу предлагаемого штамма наносят на поверхность плотной среды, начертив на ней решетку. В качестве контроля используют семена орхидей, не инокулированные бактериальным штаммом. Флаконы содержат в климокамере.

Следующие материалы иллюстрируют достижение поставленной цели и подтверждают возможность осуществления изобретения. Из таблицы 1 видно, что штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 в условиях in vitro эффективно увеличивает число прорастающих семян наземных и эпифитных орхидей. Из таблицы 2 видно ускорение развития семян D. crumenatum культурой Bacillus pumilus KM МГУ 467.

Таблица 1
Влияние инокуляции семян различных видов эпифитных и наземных орхидей культурой Bacillus pumilus KM МГУ 467
Вид орхидеи	Всхожесть семян, %
	Контроль	Бактеризация штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467
Ponthieva racemosa	0,0	23,0
Dactylorhiza fuchsii	0,0	3,5
Paphiopedilum barbatum	0,0	8,0
Dendrobium crumenatum	9,5	40,0
Dendrobium nobile	8,0	56,5
Dendrobium leonis	20,0	83,3
Dendrobium moschatum	0,0	33,0

Таблица 2
Влияние культуры Bacillus pumilus KM МГУ 467 на прорастание и развитие семян эпифитной орхидеи Dendrobium crumenatum Sw
Вариант опыта	Фазы прорастания семян Dendrobium crumenatum Sw., %
	Ненабухшие семена	Набухшие семена	Протокормы	Проростки с листьями
Контроль	53	32	15	0
Бактеризация штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467	19	7	39	35

Пример 1

Штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 выращивают в пробирках на скошенной агаризованной модифицированой среде Knudson-C, состав которой приведен выше, в течение трех-четырех суток в темноте при температуре 30°С.

Посев семян орхидей, полученных из зрелых и свежесобранных семенных коробочек, проводят в стерильных условиях в ламинаре. Семенную коробочку протирают спиртом и вскрывают при помощи скальпеля. Семена стерилизуют 20 мин в свежеприготовленном 15%-ном растворе бытового препарата "Белизна", затем трижды отмывают по 20 мин в стерильной дистиллированной воде.

Семена вносят во флаконы на 100 мл с 35 мл питательной среды Knudson-C с содержанием агара 8,0 г/л и рН 6,0. С помощью стерильной бактериальной иглы биомассу штамма Bacillus pumilus KM МГУ 467 в виде пасты вносят на поверхность среды, начертив на ней решетку. В качестве контроля используют асимбиотические культуры семян орхидей. Флаконы содержат в климокамере со следующим режимом: температура (дневная и ночная) 25°С, освещение 8000 лк, длина светового дня - 16 ч, относительная влажность воздуха - 70%. Разрастаясь по поверхности среды, штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 находится в непосредственном контакте с семенами, протокормами и ювенильными растениями орхидей. Влияние бактериальных культур на прорастание семян определяют по времени прорастания и размерам проростков. Наблюдения проводят через каждые 10 сут.

Примеры 2-4 демонстрируют влияние штамма Bacillus pumilus KM МГУ 467 на всхожесть семян наземных орхидей.

Пример 2

Семена американской наземной или литофитной орхидеи Ponthieva racemosa R. Brown засевают во флаконы без обычной предпосевной обработки (длительное замачивание) и подвергают бактеризации, как в примере 1. Семена Р. racemosa прорастают через 28 сут после посева. Спустя 90 сут их протокормы достигают 3-4 мм в диаметре и покрываются длинными белыми ризоидами. Всхожесть семян составляет 23%. Неинокулированные семена не прорастают.

Пример 3

Бактеризацию семян наземной орхидеи умеренного климата Dactylorhiza fuchsii (Druce) Soo. проводят по примеру 1. Первые признаки прорастания семян в симбиотической культуре появляются спустя 100-120 сут после посева. Через 5 мес образовываются протокормы с хорошо развитыми ризоидами. Всхожесть составляет 3,5%. В асимбиотической культуре всхожесть семян отсутствует.

Пример 4

Семена тропической наземной орхидеи Paphiopedilum barbatum (Lindl.) Pfitz. высевают во флаконы и бактеризуют, как описано в примере 1. Через 60 сут после посева семян наземной орхидеи Р. barbatum с предлагаемым штаммом отмечают набухание 8% семян, которые затем хорошо развиваются до фазы формирования первого листа и первого придаточного корня. Контрольные семена не прорастают.

Примеры 5-8 демонстрируют стимулирующее действие штамма Bacillus pumilus KM МГУ 467 на прорастание семян эпифитных тропических орхидей из рода дендробиум (Dendrobium Sw.).

Пример 5

Бактеризацию семян D. crumenatum Sw. осуществляют по вышеописанной в примере 1 методике. Всхожесть семян в симбиотической культуре составляет 40%, в асимбиотической - 9,5%. Сеянцы, выращенные совместно со штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467, к 60-м сут культивирования достигают длины 1,6 мм. Длина сеянцев в асимбиотической культуре через 60 сут после посева составляет 0,6 мм.

Пример 6

Семена D. nobile Lindl. высевают во флаконы и бактеризуют, как описано в примере 1. Всхожесть семян через 60 сут при совместном проращивании с бактериальной культурой составляет 56,5% семян. В контрольном варианте всходит 8% семян.

Пример 7

Семена D. leonis (Lindl.) Rchb.f. высевают во флаконы и бактеризуют по примеру 1. Всхожесть семян в асимбиотической культуре через 60 сут инкубации составляет 20%. При симбиотическом проращивании всходит 83,3% семян.

Пример 8

Бактеризацию семян D. moschatum (Buch. - Ham.) Swartz. проводят, как описано в примере 1. Всхожесть семян к 60 сут инкубации при совместном проращивании с бактериальной культурой составляет 33%, в то время как в контрольном варианте семена не прорастают. Через 100 сут проростки имеют листовую пластинку и корень, а длина ювенильного побега составляет 3,5 мм.

Пример 9 иллюстрирует влияние штамма Bacillus pumilus KM МГУ 467 на фазы прорастания семян тропической эпифитной орхидеи D. crumenatum Sw.

Пример 9

Семена D. crumenatum высевают во флаконы, бактеризуют и культивируют по примеру 1. Через 60 сут инкубации в симбиотической культуре ненабухшими остаются 19% семян, набухшие семена составляют 7%,образуется 39% протокормов и 35% проростков с листьями. В контрольном варианте 53% семян остаются ненабухшими, 32% - набухшими, 15% семян образуют протокормы. Проростков, имеющих листья, в асимбиотической культуре не отмечено. Большее число набухших семян в контроле объясняется тем хорошо известным фактом, что для набухания семян орхидей (но не дальнейшего развития) зачастую достаточно присутствия воды и определенной температуры (увеличение размеров зародыша происходит не за счет клеточного деления, а за счет увеличения размеров клеток в немеристематической зоне).

Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus pumilus KM МГУ 467 в отличие от прототипа обладает способностью стимулировать в культуре in vitro прорастание и ускорять развитие семян как эпифитных, так и наземных орхидей из тропического и умеренного климатических поясов. Применение бактеризации семян культурой Bacillus pumilus KM МГУ 467 позволяет получить без предпосевной обработки проростки наземных орхидей с трудно прорастающими семенами. Бактеризацию штаммом Bacillus pumilus KM МГУ 467 осуществляют непосредственным подсевом к семенам на синтетическую питательную среду Knudson-C без добавления дорогостоящих стимуляторов роста растений и добавок неопределенного состава растительного и грибного происхождения. Предлагаемый штамм и способ его применения может быть рекомендован для использования в оранжереях и теплицах при искусственном семенном размножении орхидей.

Источник информации

1. Knudson L. Nonsymbiotic germination of orchid seeds //Botanical gazette. 1922. V. 73. №1. P. 1-25.