синергическая композиция для ингибирования вич

Формула изобретения

Синергическая композиция для ингибирования ВИЧ, характеризующаяся тем, что она содержит азидотимидин и пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты - ниглизин, в концентрациях, физиологически достижимых в крови: для азидотимидина 0,0037-0,0254 мкМ, для ниглизина 0,0052-9,64 мкМ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к вирусологии и медицине, а именно к разработке композиционных препаратов на основе азидотимидина и производных глицирризиновой кислоты, способных эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека при низких физиологических концентрациях входящих в них отдельных компонентов.

В условиях распространения эпидемии СПИДа проблема лечения этого опасного заболевания остается одной из актуальных проблем современной медицины. На протяжении уже почти 15 лет в клинической практике для лечения ВИЧ-инфекции широко используется азидотимидин (АЗТ) - эффективный ингибитор вирусной обратной транскриптазы [1]. В последние годы в связи с быстро развивающейся в организме ВИЧ-инфицированных пациентов резистентностью вируса к азидотимидину [2], а также из-за высокой токсичности препарата (в том числе митохондриальной токсичности) [3, 4] его применение ограничено. А монотерапия АЗТ в настоящее время не рекомендована Всемирной организацией здравоохранения, поскольку приводит к появлению устойчивых к препарату мутантов вируса.

В настоящее время в большинстве случаев азидотимидин применяют в качестве составляющего в так называемых «коктейлях» в сочетании с 2-4 другими препаратами [5, 6], воздействующими на другие мишени цикла репродукции вируса. Как правило, это ингибиторы протеазы ВИЧ или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ. Несмотря на эффективность некоторых таких «коктейлей», актуальным остается поиск новых сочетаний-комбинаций азидотимидина с препаратами другой природы и иного механизма действия, достаточно эффективных и дешевых в производстве, пригодных для лечения ВИЧ-инфекции.

Одним из таких доступных и дешевых препаратов является глицирризиновая кислота (ГК), механизм действия которой некоторые авторы связывают с ингибированием протеинкиназы, обеспечивающей фосфорилирование Т4 рецептора, необходимого для связывания вируса [7], другие - с непосредственным блокированием связывания вируса с клеткой [8]. Хотя механизм анти-ВИЧ действия ГК остается невыясненным до конца, ясно одно, что она ингибирует репродукцию вируса на ранних стадиях инфекции [9] в отличие от азидотимидина.

Исследование «лечебного» действия ГК на модели хронической ВИЧ-инфекции в моноцитах человека линии U937 при длительном культивировании в ее присутствии показало, что ГК эффективно ингибирует продукцию вируса на первых 4-х пассажах, а далее до 20-го пассажа лишь на 60% снижает вируспродукцию по сравнению с контролем [10]. Использование комбинации АЗТ и ГК (1:1000) оказалось более эффективным: к 20-му пассажу вирусспецифический белок р24 не выявлялся [10].

Исследование противовирусной активности целого ряда производных ГК продемонстрировало эффективность их анти-ВИЧ действия в культуре клеток [11-13]. Ранее было показано, что моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам) не является антагонистом по отношению к азидотимидину и в сочетании с ним эффективно блокирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток как при острой, так и при хронической инфекции при соотношении АЗТ:глицирам=1:10000 [9, прототип]. Однако эффективные концентрации АЗТ и глицирама являются довольно высокими и неприемлемы на уровне организма.

Технической задачей изобретения является разработка высокоэффективных анти-ВИЧ композиций на основе азидотимидина и производных глицирризиновой кислоты, обладающих синергическим эффектом входящих в него компонентов при физиологически допустимых концентрациях последних в крови.

Поставленная задача решается путем подбора и исследования противовирусной активности различных комбинаций АЗТ и нового отечественного препарата пента-О-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) - эффективного ингибитора ВИЧ [14]. При подборе комбинаций компонентов новой синергической композиции необходимо учитывать фармакокинетику азидотимидина и глицирризиновой кислоты, согласно которой концентрации АЗТ не должны превышать 0,05-0,1 мкг/мл, а ГК - 2-10 мкг/мл, что соответствует реальным концентрациям этих соединений в крови [15].

В результате этого исследования показано, что АЗТ и ниглизин в комбинациях 1:20, 1:50, 1:100, 1:200 и 1:2000 проявляют выраженный синергический эффект (табл.1). Важно отметить, что если для АЗТ 50%-ные ингибирующие дозы в этих комбинациях варьируют незначительно (от 0,0056 до 0,014 мкМ) и мало отличаются от таковой для индивидуального препарата, то в случае ниглизина они существенно снижаются по мере уменьшения его доли в комбинации (от 2,076 до 0,0519 мкМ).

Таблица 1 Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1EVK комбинациями АЗТ и ниглизина
Комбинация	ID50, мкМ		FIC
	АЗТ	Ниглизин
Штамм ВИЧ-1EVK
Индивидуальный препарат	0,0254	9,64	-
АЗТ:ниглизин=1:20	0,0124	0,052	0,491
АЗТ:ниглизин=1:50	0,0142	0,148	0,574
АЗТ:ниглизин=1:200	0,01	0,386	0,614
АЗТ:ниглизин=1:2000	0,0056	2,076	0,435
АЗТ-резистентный мутант ВИЧ-1
Индивидуальный препарат	4,49	0,134	-
АЗТ:ниглизин=1:100	0,0037	0,074	0,553
* - комбинационный индекс (the fractional inhibition concentration), определенный согласно [16].

Таким образом, используя комбинации АЗТ с ниглизином, можно существенно снизить эффективные концентрации индивидуальных препаратов от 0,0254 до 0,0142 мкМ, что соответствует 0,0038 мкг/мл, и ниже (до 0,0037 мкМ) для АЗТ и от 9,64 до 0,052 мкМ (0,07 мкг/мл) для ниглизина, что значительно ниже физиологически достижимых в крови и нетоксичных концентраций этих соединений.

В экспериментах исследовалась противовирусная активность ниглизина и его комбинаций с АЗТ в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1, полученного в культуре клеток и характеризующегося снижением чувствительности к АЗТ в 160 раз и наличием точечных мутаций в гене pol Asp67Asn; Lys70Arg; Leu214Phe, ответственных за резистентность [17].

Ниглизин оказался более эффективным в отношении АЗТ-резистентного мутанта (ID ₅₀=0,134 мкМ), чем в отношении «дикого» штамма (ID ₅₀=9,64 мкМ). Определенный для комбинации АЗТ:ниглизин=1:100 комбинационный индекс FIC составил 0,553 (<1), что свидетельствует о синергическом противовирусном действии этой комбинации в отношении АЗТ-резистентного мутанта. Причем 50%-ные ингибирующие дозы препаратов в смеси были существенно ниже, чем для индивидуальных соединений: для АЗТ - 0,0037 мкМ, а для ниглизина - 0,052 мкМ.

Эффективность сочетанного анти-ВИЧ действия АЗТ и ниглизина как в отношении «дикого» штамма, так и АЗТ-резистентного мутанта свидетельствует о перспективности использования подобных композиций для лечения ВИЧ-инфекции.

Изобретение иллюстрируется следующей диаграммой.

Фиг.1. Эффективность ингибирования ВИЧ_EVK композицией АЗТ и ниглизина 1:50 в культуре клеток МТ-4.

	АЗТ (мкг/мл)	Ниглизин (мкг/мл)	Композиция 1:50 (мкг/мл)
1 -	0,001	0,05	0,001:0,05
2 -	0,01	0,5	0,01:0,5
3 -	0,1	5	0,1:5
4 -	1	50	1:50

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:50.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают стоком вируса (штамм ВИЧ-l_EVK [18]) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37°С в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводят ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, до посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл и вносят в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1,0 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,05 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 1,0 нг/мл до 1,0 мкг/мл, а ниглизина - от 0,05 до 50 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19].

Экпериментальные данные приведены на Фиг.1. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы ((ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем) для индивидуальных соединений и для каждого соединения в смеси. Полученные таким образом количественные характеристики используют далее для расчета комбинационного индекса (FIC), определяемого согласно [16] по формуле:

где А - азидотимидин, В - ниглизин.

Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.2. Комбинационный индекс равен 0,574 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:50.

Таблица 2 Количественные характеристики ингибирования вич-1EVK композицией АЗТ и ниглизина (1:50)
Препарат	ID50, мкМ		FIC
	Индивидуальная	В смеси	0,574
АЗТ	0,0254	0,0142
Ниглизин	9,64	0,148

Пример 2. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:20.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1,0 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,02 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина, в которых от 1,0 нг/мл до 1,0 мкг/мл, а ниглизина - от 0,02 до 20 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.3. Комбинационный индекс равен 0,56 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:20.

Таблица 3 Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1EVK композицией АЗТ и ниглизина (1:20)
Препарат	ID50, мкМ		FIC
	индивидуальная	в смеси	0,491
АЗТ	0,0254	0,01235
Ниглизин	9,64	0,0519

Пример 3. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:100 в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают АЗТ-резистентным мутантом ВИЧ-1 с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37°С в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 0,1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,1 нг/мл до 0,1 мкг/мл, а ниглизина - от 1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО ₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.4. Комбинационный индекс равен 0,553 (<1), что свидетельствует о синергическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в таком соотношении 1:100.

Таблица 4 Количественные характеристики ингибирования АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 комбинацией АЗТ и ниглизина (1:100)
Препарат	ID50, мкМ		FIC
	индивидуальная	в смеси	0,553
АЗТ	4,49	0,0037
Ниглизин	0,134	0,074

Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1 _EVK и АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 композициями АЗТ и ниглизина приведены в итоговой Таблице 1.

Пример 4. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:200.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл, а ниглизина - от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37° и 5% СО ₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.5. Комбинационный индекс равен 0,614 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:200.

Таблица 5 Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1EVK композицией АЗТ и ниглизина (1:200)
Препарат	ID50, мкм		FIC
	индивидуальная	в смеси	0,614
АЗТ	0,0254	0,01
Ниглизин	9,64	0,386

Пример 5. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:2000.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем вносят в лунки аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,5 нг/мл до 0,1 мкг/мл, а ниглизина - от 1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1.

Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.6. Комбинационный индекс равен 0,435 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в таком соотношении 1:2000.

Таблица 6 Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1EVK комбинацией АЗТ и ниглизина (1:2000)
Препарат	ID50 , мкм		FIC
	индивидуальная	в смеси	0,435
АЗТ	0,0254	0,0056
Ниглизин	9,64	2,076

Таким образом впервые показано, что предлагаемые композиции ниглизина с АЗТ способны эффективно подавлять репродукцию как «дикого» штамма, так и АЗТ-устойчивого мутанта ВИЧ-1 в культуре чувствительных к вирусу клеток, проявляя при этом синергический эффект. Учитывая, что ниглизин является эффективным индуктором интерферона-гамма [20], можно надеяться существенно усилить его терапевтический потенциал при лечении ВИЧ-инфекции. Это позволяет рекомендовать такого рода композиции («коктейли») для разработки новых эффективных отечественных средств лечения ВИЧ-инфекции, которые могут существенно (примерно в 50 раз) снизить затраты общества и самих больных на лечение.

Список литературы

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. Т.2. Изд. 14-е, Москва: ООО «Новая волна». - 2000.

2. Larder B.A, Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). // Science. - 1989. - Vol.246. - P.1155-1158.

3. Chiu D.T. & Duesberg P.H. The toxicity of azidothymidine (AZT) on human and animal cells in culture at concentrations used for antiviral therapy.// Genetica. - 1995 - Vol.95 - P.103-109.

4. Brinkman К., Hofstede J.M, Burger D.M. Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway. // AIDS. - 1998. - Vol.12. - P.1735-1744.

5. Schmit J.-C., Weber B. Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring.//Intervirology. - 1997. - Vol.40. - №5/6. - P.304-321.

6. Кравченко А.В. Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2001. - №1.- С.59-62.

7. Ito M., Sato A., Hirabayashi K., Tanabe F., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV) // Antiviral Res. - 1988. - V.10. - P.289-298.

8. Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor // Nature (London). - 1988. - V.333. - P.278-280.

9. Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. Изучение анти-ВИЧ активности (3-глицирризиновой кислоты // Вопр.вирусол. - 1992 - №5-6 - С.235-238.

10. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Гашникова Н.М., Мамаева О.А., Федюк Н.В. Хронически инфицированная ВИЧ-1 культура моноцитов человека U937 как модель для оценки эффективности анти-ВИЧ препаратов // Вопросы вирусологии. - 2001. - №6. - С.38-42.

11. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности // Химия в интересах устойчивого развития. - 2001. - №9. - С.485-491.

12. Патент РФ №2199547, кл. С 07 J 63/00, опубликован БИ №6 за 2003 г.

13. Патент РФ №2198177, кл. С 07 J 63/00, опубликован БИ №4 за 2003 г.

14. Авторское свидетельство СССР №1804848, кл. А 61 К 31/705, опубликовано БИ №12, за 1993 г.

15. Ильичева Т.Н., Олькин С.Е., Федюк Н.В., Абдуллаев С.М., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Фармакокинетика глицирризиновой кислоты и ее производных. // Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". - 2000. - Т.4. - №1. - С.74.

16. Allen L.B., Teepe A.G., Kehoe M.J., Holland C.S., Me Namara D.J. and Cook P.D. Antiviral and cytotoxicity evaluation of 3-nitro-3-deazauridine // Antiviral Res. - 1989. - V.12. - P.259-268.

17. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Киселева Я.Ю., Гашникова Н.М., Федюк Н.В. Сравнительное исследование возникновения резистентности ВИЧ-1 к АЗТ и Н-фосфонату АЗТ в культуре клеток // ДАН. - 2002. - Т.384. - №2. - С.259-252.

18. Карамов Э.В., Богомолов Б.П., Жданов В.М. // Обз. центров, сотрудничающих с ВОЗ, по вирусным инфекциям. - М. - 1986. - С.4-7.

19. Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. // Вопросы вирусологии. - 1992. - №3. - С.135-138.

20. Заявка на патент РФ №2003134868 (037495), приоритет от 01.12.2003 г. "Индуктор гамма-интерферона".