штамм бактерии bacillus macerans bs-04 - продуцент пектиназ, протеазы, ксиланазы и амилазы

Формула изобретения

Штамм Bacillus macerans BS-04 - продуцент пектиназ, протеазы, ксиланазы и амилазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение представляет собой новый штамм Bacillus macerans BS-04 и относится к отрасли микробиологической промышленности, производящей ферментные препараты, и может быть использовано при получении ферментсодержащих лекарственных средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями процессов пищеварения; и при получении препаратов, применяемых с целью увеличения выхода и улучшения качества овощных и фруктовых соков и пюре, плодово-ягодного осветленного вина, эфирных и растительных масел, чая, при обработке трудноусвояемых растительных кормов и получении биологических добавок для сельского хозяйства.

Известен Clostridium pectinofermentas шт. 15 - анаэробный продуцент мацерирующих ферментов, предназначенных для применения в льноперерабатывающей промышленности (1). Clostridium pectinofermentas шт. 15 синтезирует в процессе глубинного культивирования пектат-трансэлиминазу (0,55 ед/мл), экзо-полигалактуроназу (2,5 ед/мл), пектинэстеразу (0,13 ед/мл), ксиланазу (0,96 ед/мл) и не синтезирует эндо-полигалактуроназу и целлюлазу. Существенным недостатком указанного штамма является низкий уровень биосинтеза ферментов.

Известен штамм Bacillus circulans шт.31 ЦМПМ В-1741 - продуцент мацерирующих ферментов (2). Bacillus circulans шт.31 является факультативным анаэробом. Оптимальные условия культивирования: рН среды 8,1-8,3; температура 37-42°С; время культивирования 36 ч. Продуцент синтезирует пектолитические ферменты: пектат-трансэлиминазу от 2 до 10 ед/мл, эндо-полигалактуроназу - 25 ед/мл. Существенными недостатками штамма Bacillus circulans шт.31 являются: низкая активность синтезируемых ферментов и длительный период культивирования продуцента.

Известен штамм бактерии Bacillus circulans ВКМП-В-5622 - продуцент комплекса пектолитических ферментов и ксиланазы (3). Штамм синтезирует ферменты: пектат-трансэлиминазу - на среде, содержащей свекловичный жом, от 3800 до 6700 ед/мл; а на среде, содержащей картофельный крахмал от 10000 до 25000 ед/мл; эндо-полигалактуроназу от 32,57 до 87,7 ед/мл; экзо-полигалактуроназу от 12,0 до 36,77 ед/мл и ксиланазу до 30,8 ед/мл. Штамм культивируют в течение 10-18 ч при рН среды 7,8-8,6 и температуре 36-45°С.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому штамму является штамм Bacillus macerans ЦМПМ В-2692 - продуцент пектолитических ферментов (4), который в условиях глубинного культивирования образует эндо-полигалактуроназу с активностью 6,7 ед/мл, экзо-полигалактуроназу с активностью 5,3 ед/мл и пектат-трансэлиминазу с активностью 9000 ед/мл. Культивирование продуцента осуществляют при температуре 32-35°С, рН 6,8-7,2 в течение 18-20 ч. Существенным недостатком указанного штамма является недостаточно высокая активность пектат-трансэлиминазы и узкий комплекс синтезируемых ферментов.

Целью настоящего изобретения является получение высокоактивного штамма факультативно-анаэробной бактерии Bacillus macerans BS-04 - способного синтезировать широкий комплекс ферментов, обладающего повышенным синтезом пектиназ, а именно, пектат- и пектинлиаз, эндо- и экзо-полигалактуроназ, пектинэстеразы; и дополнительным синтезом протеазы, ксиланазы, амилазы, и характеризующегося коротким циклом роста с повышенным накоплением биомассы.

Заявляемый штамм Bacillus macerans BS-04 выделен в результате многократного рассева исходного штамма Bacillus macerans ЦМПМ В-2692 и выделения моноспоровых вариантов. Штамм Bacillus macerans BS-04 имеет следующие культурально-морфологические и физиологические признаки.

Культурально-морфологические признаки

Клетки прямые, палочковидные, 2,0-5,0×0,9-1,0 мкм, подвижные, грамположительные, встречаются в длинных и коротких цепочках. Споры эллипсоидальные, без экзоспориума, 2,0-2,4×1,0-1,2 мкм, расположены центрально или субтерминально.

На картофельном агаре:

- на первые сутки рост хороший, колонии светло-бежевые, круглые, середина шершавая, матовая, края неровные, блестящие, размер колоний от 1 до 4 мм в диаметре. Пигмент в среду не диффундирует;

- на вторые сутки колонии светло-бежевые, круглые, середина шершавая, матовая, края неровные, блестящие, размер колоний от 1 до 6 мм в диаметре;

- на шестые сутки колонии от светло-бежевого до бежевого цвета, блестящие, однородные, круглые, края неровные, размер колоний от 1 до 6 мм в диаметре.

На сусло-агаре:

- на первые сутки колонии светло-бежевые с более светлой и плотной серединой, матовые, шершавые, края ровные, размер от 0,5 мм до 5 мм;

- на вторые сутки колонии светло-бежевые с более плотной выпуклой, блестящей, непрозрачной серединой, края колонии матовые, шершавые, непрозрачные, неровные, размер колоний от 1 мм до 10 мм;

- на третьи сутки колонии светло-бежевые с более светлой и плотной, чуть выпуклой серединой. Все колонии блестящие, полупрозрачные, края неровные. Размер колоний от 1 мм до 11 мм.

На среде Чапека с глюкозой:

- на первые сутки колонии однородные, выпуклые молочно-белого цвета, блестящие, прозрачные, края ровные, размер колоний от 0,5 мм до 1,5 мм;

- на вторые сутки колонии неоднородные светло-бежевого цвета, середина блестящая в виде пуговки, края неровные, матовые, шершавые, размер колоний от 1 мм до 4 мм;

- на третьи сутки колонии неоднородные светло-бежевого цвета, середина блестящая в виде пуговки, края неровные, матовые, шершавые, размер колоний от 1 мм до 7 мм;

- на шестые сутки колонии неоднородные, края неровные, матовые, шершавые; середина блестящая в виде пуговки, непрозрачная, размер колоний 0,2-1,2 мм, цвет светло-бежевый.

На среде Чапека с крахмалом:

- на первые сутки размер колоний 0,01-0,5 мм, колонии блестящие, непрозрачные, однородные, выпуклые, цвет белый, края неровные;

- на третьи сутки размер колоний 0,5-2,0 мм, колонии блестящие, непрозрачные, однородные, выпуклые, цвет молочно-белый, края неровные;

- на четвертые сутки колонии 0,5-2,5 мм, блестящие, выпуклые, непрозрачные, цвет молочно-белый, центр более плотный (точечное уплотнение), края неровные глубоко изрезанные;

- на шестые сутки колонии от 0,5 до 5 мм, непрозрачные, блестящие, неоднородные с точечным уплотнением в центре, края матовые, неровные.

На мясопептонном агаре:

- рост слабый, колонии точечные, бежевые.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма

Отношение к углеводам: усваивает глюкозу, сахарозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу и маннит с образованием кислоты и газа, гидролизует крахмал.

Образует каталазу, ацетон, кристаллические декстрины. Нитраты редуцирует в нитриты. Фенилаланин не дезаминирует, тирозин не расщепляет. Аммиак и сероводород не образует. Гиппураты не гидролизует. Желатин разжижает на 1 см в верхней части. Молоко пептонизирует с образованием сгустка и газа. Растет на среде с 0,001% лизоцимом, не растет на среде с 5% хлористым натрием.

Хорошо растет на ломтиках моркови, картофеля, репы, капусты белокочанной, кабачка, тыквы, яблока (некислых сортов) и груши с полной мацерацией субстрата.

На среде с 1% азотнокислым натрием в анаэробных условиях отмечается задержка спорообразования.

Отношение к кислороду - факультативный анаэроб. Минимальная температура роста +10°С, максимальная +45°С, оптимальная 37-42°С, рН 7,4-7,8.

Время культивирования в аэробных условиях 10-18 ч, в условно-анаэробных - 18-30 ч.

Продуцент подвержен сезонным влияниям, поэтому в весенний и осенний периоды наблюдается снижение ферментативной активности на 10-15%.

Активность пектин- и пектатлиаз (на соответствующих субстратах) определяли путем спектрофотометрирования ненасыщенных продуктов реакции пектолиза, имеющих максимальную оптическую плотность при длине волны 235 нм по ТУ оп.5800665-2-91. За единицу активности принято такое количество фермента, которое за 1 ч при 40°С вызывает образование ненасыщенных продуктов реакции, увеличивающих оптическую плотность на 0,1.

Эндо-полигалактуроназную активность (эндо-ПГ) определяли вискозиметрическим методом по ГОСТ 20264.3-81, экзо-полигалактуроназную активность (экзо-ПГ) определяли титрометрическим методом по увеличению восстанавливающих групп по ГОСТ 264.3-81, пектинэстеразную активность определяли по ГОСТ 20264.3-81, протеолитическую активность (щелочная протеаза) определяли, используя в качестве субстрата казеинат натрия по ГОСТ 20264.2-74, ксиланазную активность определяли по ТУ 9291-035-34588571-2001, амилазную активность определяли по ГОСТ 20264.4-89. Определение накопления биомассы (титр клеток) определяли методом предельных разведений. Определение мацерирующей способности проводили по тесту, основанному на определении изменения массы растительного субстрата в результате действия ферментов культуральной жидкости заявляемого продуцента. Степень мацерации растительных субстратов определяли по уменьшению массы обработанного ферментом субстрата по сравнению к контрольным вариантам и выражали в процентах.

Примеры культивирования штамма Bacillus macerans BS-04

Пример №1

Культуру выращивали на среде, г/л:

Свекловичный жом молотый	20,0
Кальций хлористый	0,9
Натрий углекислый (сода)	2,0
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный	2,6
Натрий фосфорнокислый однозамещенный	2,2
Кукурузный экстракт	7,4
Вода водопроводная	остальное

Питательную среду разливали по 100 мл в качалочные колбы вместимостью 750 мл и стерилизовали при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 45 мин. В качестве посевного материала использовали споры штамма Bacillus macerans BS-04, которые образуются на поверхности скошенного картофельного агара после инокулирования и выращивания в течение 48 ч при 40°С. Смывом с 1 косяка засевали 3 колбы в количестве 3% к объему питательной среды. Культивирование проводили в аэробных условиях на качалке с частотой вращения 180-200 об/мин при рН среды 7,6, температуре 40°С и в течение 10 ч.

Пример №2

Культивирование проводили на среде в соответствии с примером №1, за исключением аэрации, температуры и рН среды. Выращивание проводили в условно-анаэробных условиях. С этой целью использовали круглые плоские колбы с узким горлом. Питательную среду наливали в количестве 0,5 объема колбы. Культивирование проводили при рН среды 7,8, температуре 42°С, в течение 24 ч без перемешивания.

Пример №3

Культивирование проводили в течение 18 ч в условиях, соответствующих условиям примера №1. Состав питательной среды отличался от состава примера №1 дополнительным содержанием 1% казеина и 1% кормовых дрожжей "Биотрин".

Пример №4

Продуцент выращивали на среде, г/л:

Картофельный крахмал	100,0
Амилосубтилин Г3х с АС 550 ед/г	0,37
Аммоний лимоннокислый двузамещенный	30,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	3,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	2,0
Магний сернокислый	1,5
Кальций сернокислый	1,5
Железо сернокислое закисное	0,02
Марганец сернокислый	0,00125
Медь сернокислая	0,0075
Аминобензойная кислота	0,01
Вода дистиллированная	остальное
рН среды	7,4

Картофельный крахмал, входящий в состав питательной среды, предварительно осахаривали амилосубтилином ГЗх с АС 550 ед/г. Питательную среду по 300 мл разливали в колбы вместимостью 2 л и стерилизовали при 1,5 МПа. Культивирование осуществляли в условно-аэробных условиях при рН 7,4, температуре 37°С без перемешивания в течение 30 ч.

По окончании культивирования продуцента проводили определение активностей ферментов в супернатанте, полученном из культуральной жидкости при центрифугировании при 5000 об/мин в течение 10 мин. Данные по результатам опытов представлены в таблице.

Использование предлагаемого штамма Bacillus macerans BS-04 по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества:

1. Повышенный синтез пектатлиазы до 60000 ед/мл (в прототипе до 9000 ед/мл), пектинлиазы до 25000 ед/мл (в прототипе - отсутствует).

2. Более высокий уровень синтеза эндо-полигалактуроназной активности: при рН субстрата 4,0 - до 9 ед/мл, а при рН субстрата 8,0 до 909 ед/мл (в прототипе - 6,7 ед/мл).

3. Более высокий уровень синтеза экзо-полигалактуроназной активности до 15,1 ед/мл (в прототипе - 5,3 ед/мл).

4. Синтез пектинэстеразной активности достигает 57,84 ед/мл (в прототипе - отсутствует).

5. Кроме вышеуказанных пектиназ штамм дополнительно синтезирует: щелочную протеазу (до 0,76 ед/мл), ксиланазу (до 0,19 ед/мл) и амилазу (до 83,2 ед/мл).

6. Повышенное накопление биомассы (титр клеток) достигает 2,7×10¹⁰ (в прототипе данные отсутствуют).

Таким образом, предлагаемый штамм имеет значительные преимущества по сравнению с прототипом, что позволит при его промышленном использовании получать высокоактивные препараты с широким комплексом ферментов для медицинской и пищевой промышленности, а также для сельского хозяйства.

Список литературы

1. Г.Б. Бравова и др. Труды ферментного отделения ВНИИсинтезбелок, т.1, СЭНТИ, 1972 г.

2. АС СССР №1349250 "Bacillus circulans шт.31 ЦМПМ В-1741 - продуцент мацерирующих ферментов", 1985 г.

3. Патент РФ №2072691 "Штамм бактерий Bacillus circulans - продуцент комплекса пектолитических ферментов и ксиланазы", приоритет 1994 г.

4. АС СССР №1162224 "Штамм Bacillus macerans ЦМПМ В-2692 - продуцент пектолитических ферментов", 1984 г.