способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей

Формула изобретения

Способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, включающий механическую очистку ткани, размельчение, отмывку буферным раствором, обработку ферментом папаином, диализ, осаждение этанолом и центрифугированием, отличающийся тем, что после механической очистки мягкие ткани размельчают до гомогенного состояния, а твердые до мелких кусочков, отмывают 0,1 Н фосфатным буфером, ткань переваривают в растворе активированного 0,125-0,325% папаина при 60°С в течение 24 ч, охлаждают в течение 10 ч при 4°С, фильтруют, перевар заливают в хроматографическую колонку, где в качестве твердого носителя используют коллаген из костной ткани с размерами частиц от 0,1 до 0,5 см³ , инкубируют в течение от 10 до 24 ч, отмывают 0,05-0,2 Н соляной кислотой и элюируют 0,5-1,5 Н хлоридом натрия, диализуют против насыщенного хлорида натрия, осаждают в этаноле, центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом, высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным методом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимии, и может быть использовано для выделения сложных полисахаридов из биологических тканей животного происхождения, богатых этими соединениями, а также изготовления субстанций лекарственных средств - глазных капель для лечения заболеваний и повреждений роговицы, фармацевтических средств для лечения заболеваний костей и суставов, фармацевтических средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, а также ряда биокомпозиционных изделий медицинского назначения, в состав которых входят сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ).

Известен способ получения сГАГ из биоматериала - роговиц свиней, которые механически очищают, проводят гидролиз активированным папаином, после чего гидролизат кипятят в течение 10-15 мин, добавляют трихлоруксусную кислоту, удаляют осадок, осаждают сГАГ этанолом и диализуют его против смеси 1Н раствора хлорида натрия и этанола (Патент РФ №2056851 от 25 июня 1992 г.), который выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Недостатками указанного способа является то, что такая обработка трудоемка, высокозатратна и не обеспечивает полного выхода и освобождение из раствора сГАГ, а также от примеси белковых и других антигенных молекул, которые присутствуют в указанных тканях, что существенно снижает чистоту конечного продукта.

Задачей изобретения является повышение качества выделения сГАГ для использования в биохимии, для получения чистых сложных полисахаридов, а также фармацевтических субстанций путем ферментной обработки биологических тканей и выделение сГАГ на твердом носителе - коллагене из костной ткани и, как результат этого, увеличение выхода конечного продукта, снижение количества белка в препарате, снижение его антигенных характеристик и повышение его биосовместимости.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение высококачественных сГАГ для получения фармацевтических субстанций, которые могут широко использоваться для получения фармацевтических средств и ряда изделий медицинского назначения, в состав которых входят сГАГ.

Технический результат достигается тем, что используют биологические ткани животных или человека, содержащие сГАГ, - роговицу, хрящ, кость, трахею, печень, тонкий кишечник и т.д., которые вначале механически очищают, отмывают буферным раствором, обрабатывают ферментом, диализуют, осаждают этанолом и центрифугированием, отличающиеся тем, что после механической очистки ткань переваривают в растворе активированного 0,125-0,325% палаина при 60°С в течение 24 часов, перевар охлаждают в течение 10 часов при 4°С, заливают в хроматографическую колонку, где в качестве твердого носителя используют коллаген из костной ткани с размерами частиц от 0,1 до 0,5 см³ , инкубируют в течение от 10 до 24 часов, отмывают 0,05-0,2 Н соляной кислотой и элюируют 0,5-1,5 Н хлоридом натрия, диализуют против насыщенного хлорида натрия, сГАГосаждают этанолом, центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом, высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным методом.

Сырьем для получения сГАГ может быть любая ткань сельскохозяйственных животных или при необходимости донорская ткань человека. Эти ткани содержат протегликаны, в состав которых входят сГАГ, такие как хондроитин сульфат, кератан сульфат, гепаран сульфат, дерматан сульфат, гепарин и др. (Стейси М. и Баркер С. Углеводы живой ткани. М.: Мир.,1965. стр-35-38).

Технология получения сГАГ требует начальной механической обработки ткани, когда ткань очищается от остатков мягких тканей и отмывается от крови.

После такой обработки ткань нарезают острым инструментом на полоски или кусочки, а в том случае, когда ткань более плотная (например, трахея), пропускают через мясорубку. При получении костных сГАГ кость распиливают на пластины.

Охлажденную ткань размельчают до получения гомогенной массы и подвергают ферментному гидролизу по известному способу. В качестве фермента, разрушающего важнейшие антигены стромы - гликопротеины и протеогликаны, нами применен фермент дынного дерева папаин, который разрушает эти соединения и другие белки при определенной температуре и времени инкубации. При этом полисахаридные цепи сГАГ полностью сохраняются.

Концентрация папаина и время переваривания определены нами экспериментально в пределах от 0,125 до 0,325% при температуре 60°С в течение 24 часов.

Для большинства типов соединительной ткани - роговица, склера, тонкий кишечник концентрация папаина 0,125% является оптимальной при температурном режиме переваривания 60°С и времени 24 часа. Однако при обработке более твердых и плотных тканей, таких как трахея или кость, эта концентрация должна быть увеличена до 0,325% при аналогичных условиях переваривания.

Полученный перевар охлаждают при 4°С в течение 10 часов. При этой температуре и в течение этого времени происходит первичное осаждение тканевых остатков.

Данный этап необходим для первичного удаления большей части непереваренных остатков и жиров. Качество ферментной обработки материала определяли по выходу свободных сГАГ спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.

Существенным признаком изобретения является то, что полученный перевар заливают в хроматографическую колонку, где в качестве твердого носителя используют коллаген из костной ткани с размерами частиц от 0,1 до 0,5 см³.

Нами было установлено, что костный коллаген аффинно (по сродству) способен связывать сГАГ и ряд других биологически активных веществ. Именно на этом принципе базируется применение его в качестве носителя, действующего как хроматографический субстрат.

Коллаген из костной ткани удовлетворяет всем основным требованиям, предъявляемым к носителям (матрицам), применяемым для аффинной хроматографии, особенно при аффинном разделении, концентрировании и очистке биологически активных веществ. Так, он содержит большое число групп, способных связываться с лигандом афинно (по сродству); не разрушается при связывании с лигандом и не утрачивает своих свойств при элюции с него биомолекул растворами кислот или щелочей; слабо или совсем не реагирует с другими макромолекулами; обеспечивает быстрое и равномерное протекание раствора.

К достоинствам коллагена из костной ткани как носителя следует отнести его достаточную жесткость и устойчивость к действию слабых растворов кислот, щелочей и других элюэнтов. Его пористо-волокнистая структура, обеспечивающая большую реакционную поверхность и высокую способность связывания, возможность концентрирования лиганда и, как следствие, повышение выхода конечного очищенного продукта.

Материалом для получения твердого носителя является, как правило, губчатая кость свиней или, при необходимости, донорская кость человека. Коллаген этой ткани в основном состоит из коллагена I типа и характеризуется очень слабой растворимостью в растворах кислот или щелочей и высокой устойчивостью к действию коллагенолитических ферментов.

Размеры кусочков коллагена установлены экспериментально при выделении на них сГАГ. При этом минимальный размер кусочка равен 0,1 см, так как он обеспечивает минимально необходимые рабочие объем и поверхность связывания.

Максимальный размер установлен в 0,5 см³, так как превышение данного размера затрудняет прохождение в поры коллагена циркулирующих растворов.

Технология приготовления такого носителя (матрицы) описана в Патенте РФ №2161976 от 20 января 2001. Способ получения коллагена из костной ткани.

Кусочками коллагена, полученными с помощью данного способа, заполняют колонку и заливают в нее перевар на 10-24 часа.

При высокой концентрации сГАГ в переваре (которую предварительно определяют в переваре по методу Farndel) инкубацию раствора перевара проводят в течение 10 часов, а при более низкой в течение 24 часов. Время инкубации установлено нами экспериментально по определению сГАГ в переваре. При низкой концентрации сГАГ они не определяются уже через 10 часов инкубации в смывах с колонки. Аналогично при высокой концентрации сГАГ в отмыве они не определяются через 24 часа инкубации.

Затем колонку отмывают от не специфически налипших остатков белков и других веществ с помощью 0,05-0,2 Н соляной кислоты. Здесь концентрация кислоты подбирается опытным путем. При концентрации соляной кислоты ниже 0,05 Н часть неспецифически связанных белков остается на коллагеновом субстрате и впоследствии загрязняет основной продукт. При концентрации соляной кислоты выше 0,2 Н происходит частичное снятие с коллагенового субстрата сГАГ. Отмывание от неспецифически связанных белков и других веществ ведут до полного исчезновения белка в элюате.

Выход белка в элюат определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и методом определения оксипролина по Кьельдалю.

После этого начинают элюцию сГАГ, пропуская через нее 0,5-1,5 Н раствор хлорида натрия.

Концентрация солевого раствора установлена нами экспериментально и является оптимальной для снятия сГАГ из различных тканей с коллагена. При концентрации хлорида натрия ниже 0,5 Н не все сГАГ сходят с колонки и время их выхода существенно увеличивается. При концентрации хлорида натрия выше 1,5 Н увеличивается содержание белка в элюате как за счет снятия белков с носителя, так и за счет частичного разрушения коллагенового субстрата.

Элюцию продолжают до тех пор, пока выход сГАГ с колонки не прекратится, что контролируется наличием их в растворе по методу Farndel.

Следующим этапом выделения является диализ против насыщенного раствора хлорида натрия. Этот этап обеспечивает очистку сГАГ от неспецифически связанных с ними молекул белкового и минерального просхождения, а также всех других низкомолекулярных примесей.

Далее в раствор сГАГ добавляют этанол и осаждают их из раствора.

Для более полного осаждения всех сГАГ из раствора проводят его центрифугирование в течение 15 минут при 1500 об/мин при 4°С. При данной скорости и данном времени происходит осаждение всех сГАГ. При этом наилучшее осаждение и их сохранность достигаются при температуре 4°С.

После центрифугирования осадок вновь отмывают этанолом для удаления из него остатков соли и влаги.

С целью элиминации возможного бактериального загрязнения порошок сГАГ сразу после высушивания упаковывается в стерильные флаконы.

Полученный таким образом порошок сГАГ стерилизуют радиационным методом. Данный метод стерилизации отработан экспериментально и не приводит к деградации препарата, не снижает его биологическую активность.

Сравнительный анализ количественного и качественного выхода полученного продукта показал, что содержание сГАГ в образцах составляет 99%, а содержание белка либо не определяется или не превышает 1,5-2%, что значительно улучшает данные характеристики продукта по сравнению с прототипом (3-6%). Последнее особенно важно при промышленном способе производства сГАГ.

Биологическую активность полученных сГАГ определяли в условиях клеточных культур и в модельных экспериментах на животных с помощью методик, описанных нами ранее (Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани. Научно-практическая ревматология. 2000. №2, стр.46-55).

Краткая технология получения сГАГ.

Биологическую ткань - 1 кг роговиц свиней очищают от механических примесей, отмывают холодной водой от крови, проворачивают через мясорубку, отмывают в 0,1 Н фосфатном буфере при рН 5.8-6.0 и помещают в раствор активированного 0,125% папаина при 60°С на 24 часа. После переваривания раствор охлаждают в течение 10 часов при 4°С, фильтруют, заливают в колонку с костным коллагеном с размерами частиц 0,1-0,5 см³, инкубируют в течение 10 часов, затем отмывают 0,1 Н соляной кислотой от неспецифически налипших частиц и затем элюируют 0,5 Н хлоридом натрия, помещают элюат в диализные мешки и диализуют против насыщенного хлорида натрия, после диализа осаждают в этаноле, осадок центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, отмывают этанолом и высушивают, упаковывают и стерилизуют радиационным методом.

Действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Таким образом, предлагаемый способ обработки ткани позволяет получать 99% выхода сГАГ и снизить антигенность субстанции за счет удаления остаточных комплексов белков и коровых протеинов, входящих в состав протеогликанов, что позволяет повысить биосовместимость данного материала и уменьшить число осложнений при его применении в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1.

Получение сГАГ из роговиц глаз свиней.

1 килограмм роговиц выделяют из глазных яблок свиней, очищают от механических примесей, отмывают от крови в 0,1 Н фосфатном буфере при рН 5,8-6,0 и нарезают на кусочки нужного размера. Ткань гомогенизируют до однородной массы, затем гомогенат заливают 0,125% раствором активированного папаина и инкубируют в течение 24 часов при 60°С, после переваривания раствор перевара охлаждают в течение 10 часов при 4°С, фильтруют, заливают в колонку с губчатым коллагеном из костной ткани свиней с размерами частиц 0,1-0,5 см³ , инкубируют в течение 10 часов, затем отмывают 0,05 Н соляной кислотой от неспецифически налипших частиц и затем элюируют 0,5 Н хлоридом натрия, помещают элюат в диализные мешки и диализуют против насыщенного хлорида натрия, после диализа осаждают в этаноле, осадок центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, отмывают этанолом, высушивают, упаковывают и стерилизуют радиационным методом.

Количественный анализ сГАГ, проведенный спектрофотометрически по Farndel, показал, что содержание сГАГ в препарате 99,9%.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 0,01%.

Концентрация выделенных сГАГ -4,9 мг/г сырой ткани.

Концентрация выделенных сГАГ (по прототипу) - 4,23 мг/г сырой ткани.

Действия приводят к повышению выхода конечного продукта, повышению его качества и снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Пример 2. Получение сГАГ из легкого свиней.

1 килограмм легкого свиней нарезают на полоски, очищают от механических примесей, отмывают от крови в 0,1 Н фосфатном буфере при рН 5,8-6,0 и нарезают на кусочки нужного размера, гомогенизируют до однородной массы, затем гомогенат заливают 0,225% раствором активированного папаина и инкубируют в течение 24 часов при 60°С, после переваривания раствор перевара охлаждают в течение 10 часов при 4°С, фильтруют, заливают в колонку с губчатым коллагеном из костной ткани свиней с размерами частиц 0,3-0,5 см³, инкубируют в течение 16 часов, затем отмывают 0,15 Н соляной кислотой от неспецифически налипших частиц и затем элюируют 0,9 Н хлоридом натрия, помещают элюат в диализные мешки и диализуют против насыщенного хлорида натрия, после диализа осаждают в этаноле, центрифугируя 15 минут при 1500 об/мин при 4°С. осадок отмывают этанолом, высушивают, упаковывают и стерилизуют радиационным методом дозой 0,5 Мрад.

Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98-99%.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 1,5%.

Действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Пример 3. Получение сГАГ из свиных костей.

Кости свиней очищают от мышц и хряща, отмывают холодной водой и распиливают на кусочки нужного размера, отмывают от крови в 0,1 Н фосфатном буфере рН 5,8-6,0 и заливают 0,325% раствором активированного папаина, инкубируют в течение 24 часов при 60°С, после переваривания раствор перевара охлаждают в течение 10 часов при 4°С, фильтруют, заливают в колонку с коллагеном из костной ткани свиней с размерами частиц 0,1-0,5 см³, инкубируют в течение 24 часов, затем отмывают 0,2 Н соляной кислотой от неспецифически налипших частиц и затем элюируют 1,5 Н хлоридом натрия, помещают элюат в диализные мешки и диализуют против насыщенного хлорида натрия, после диализа осаждают в этаноле, осадок центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, отмывают этанолом, высушивают, упаковывают и стерилизуют радиационным методом дозой 0,5 Мрад.

Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98-99%.

Концентрация выделенных сГАГ -1,8 г /кг сырой ткани.

Концентрация выделенных сГАГ (по прототипу) - 1,5 г/кг сырой ткани.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 0,02%.

Действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Таким образом видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет повысить выход сГАГ, довести их чистоту до 99% и снизить антигенность за счет удаления белковых компонентов, входящих в состав данной ткани.

Последнее обеспечивает высокую биосовместимость сГАГ и резко снижает число осложнений при применении данного препарата в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения.