способ анализа опосредованной катионами гибридизации тройных комплексов

Формула изобретения

1. Тройной комплекс Уотсона-Крика, предназначенный для анализа связывания между двухцепочечной нуклеиновой кислотой и зондом, образованный последовательностью-мишенью, содержащейся в двухцепочечной нуклеиновой кислоте и имеющей как минимум одно пуриновое и как минимум одно пиримидиновое основание, которая связана с нуклеотидной последовательностью или последовательностью аналога нуклеиновой кислоты, содержащейся в одноцепочечном зонде, причем все тройки соседних оснований указанного тройного комплекса, где первое и второе основания являются комплементарными основаниями двухцепочечной нуклеиновой кислоты - мишени, а третье основание принадлежит связанному одноцепочечному зонду, являются выбранными из группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C.

2. Комплекс по п.1, в котором значение рН среды, в которой находится этот комплекс, больше 7,6.

3. Комплекс по п.1, в котором одноцепочечная нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты имеет длину от 5 до 30 оснований, а двухцепочечная нуклеиновая кислота-мишень имеет длину от 8 до 3,3·10 ⁹ пар оснований.

4. Комплекс по п.1, в котором последовательность-мишень содержит от 25% до 75% пуриновых оснований и от 75% до 25% пиримидиновых оснований в любом порядке.

5. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с агентом, расщепляющим двухцепочечные нуклеиновые кислоты.

6. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с химиотерапевтическим средством.

7. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с меткой.

8. Комплекс по п.7, в котором метка представляет собой мультимолекулярный сигнальный комплекс, окислительно-восстановительную пару, хемилюминесцентный агент или электрохемилюминесцентный агент.

9. Комплекс по п.7, в котором метка представляет собой флуорофор.

10. Комплекс по п.9, в котором интенсивность флуоресценции указанного комплекса прямо коррелируют со сродством связывания между указанным зондом и последовательностью-мишенью.

11. Способ анализа связывания между двухцепочечной нуклеиновой кислотой и зондом, включающий обеспечение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность-мишень, которая содержит как минимум одно пуриновое основание и как минимум одно пиримидиновое основание; обеспечение зонда, включающего нуклеотидную последовательность или последовательность аналога нуклеиновой кислоты и флуорофор; обеспечение катиона, являющегося по меньшей мере одним из представителей группы, состоящей из катионов щелочных металлов, катионов щелочноземельных металлов, катионов переходных металлов, Со(NH₃) ₆ ³⁺, трехвалентного спермидина, четырехвалентного спермина; получение тестируемого образца, содержащего тройной комплекс по п.1, путем добавления указанных зонда, двухцепочечной нуклеиновой кислоты и катиона к гибридизационной среде с последующей инкубацией в условиях, подходящих для гибридизации; облучение тестируемого образца возбуждающим излучением, чтобы вызвать испускание флуоресценции тестируемым образцом; регистрацию интенсивности флуоресцентного излучения; калибровку указанной интенсивности относительно интенсивностей, демонстрируемых образцами, полученными гибридизацией указанной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность-мишень, с другими зондами, которые совместно с указанным зондом образуют группу, состоящую из олигонуклеотида, последовательность которого полностью комплементарна последовательности-мишени, содержащейся в нуклеиновой кислоте, и олигонуклеотидов, последовательность которых отличается от последовательности указанного олигонуклеотида либо наличием делеции одного, двух или трех оснований, либо заменой оснований в одном, двух, или трех положениях; определение на основании калибровки степени соответствия между указанными зондом и последовательностью-мишенью, содержащейся в нуклеиновой кислоте.

12. Способ по п.11, дополнительно включающий количественное определение сродства связывания.

13. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без обеспечения тушителя сигнала на последовательности-мишени или зонде.

14. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без предварительной денатурации указанной последовательности-мишени.

15. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без ПЦР-амплификации последовательности-мишени.

16. Способ по п.11, в котором указанная последовательность-мишень представляет собой двухцепочечную ДНК и указанный зонд специфически связывается с указанной последовательностью-мишенью с образованием тройного комплекса.

17. Способ по п.16, в котором указанный зонд представляет собой одноцепочечную ДНК или РНК.

18. Способ по п.11, в котором зонд имеет частично заряженный остов.

19. Способ по п.11, в котором зонд имеет незаряженный остов.

20. Способ по п.19, в котором зонд включает последовательность ПНК.

21. Способ по п.11, в котором указанный зонд представляет собой оцДНК, полученную путем параллельного синтеза.

22. Способ по п.21, в котором указанные зонд и последовательность-мишень имеют одинаковую длину.

23. Способ по п.11, в котором зонд имеет длину от 5 до 30 нуклеотидов.

24. Способ по п.11, в котором возбуждающее излучение исходит от аргонового лазера при длине волны от 200 нм до 100 нм.

25. Способ по п.11, осуществляемый при температурах в диапазоне от 5 до 85°С.

26. Способ по п.11, осуществляемый при температурах ниже 25°С.

27. Способ по п.11, в котором надежность указанного метода не зависит от последовательности оснований зонда, последовательности оснований мишени, содержания гуанина в указанных зонде и последовательности-мишени и содержания цитозина в указанных зонде и последовательности-мишени.

28. Способ по п.11, в котором тестируемый образец имеет объем около 20 мкл и содержит около 10 фемтомоль последовательности-мишени и около 10 фемтомоль зонда.

29. Способ по п.11, в котором концентрация указанной последовательности-мишени в образце составляет не более 5·10^-10 М.

30. Способ по п.29, в котором концентрация указанного зонда в указанном образце составляет не более 5·10^-10 М.

31. Способ по п.11, осуществляемый на биочипе.

32. Способ по п.11, в котором указанный зонд ковалентно мечен неинтеркалирующим флуорофором, а указанная интенсивность обратно коррелирует с указанным сродством связывания.

33. Способ по п.32, в котором указанный неинтеркалирующий флуорофор является представителем группы, состоящей из биотина, родамина и флуоресцеина.

34. Способ по п.11, в котором один цитозин в каждом из троек оснований C-G-C и G-C-G положительно заряжен.

35. Способ по п.11, в котором указанным катионом является Na⁺, находящийся в концентрации от 50 мМ до 125 мМ.

36. Способ по п.11, в котором указанным катионом является Mn²⁺, находящийся в концентрации от 10 мМ до 30 мМ, Mg²⁺ в концентрации от 15 мМ до 20 мМ, или Ni²⁺ в концентрации 20 мМ.

37. Способ по п.11, в котором указанный катион включает Mg²⁺ и Mn ²⁺, находящиеся в концентрации по 10 мМ, по 15 мМ или по 20 мМ каждого.

38. Способ анализа связывания между двухцепочечной нуклеиновой кислотой и зондом, включающий обеспечение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность-мишень, которая содержит как минимум одно пуриновое основание и как минимум одно пиримидиновое основание; обеспечение зонда, включающего нуклеотидную последовательность или последовательность аналога нуклеиновой кислоты; обеспечение интеркалирующего флуорофора;

получение тестируемого образца, содержащего тройной комплекс по п.1, путем добавления указанных зонда, двухцепочечной нуклеиновой кислоты и флуорофора к гибридизационной среде с последующей инкубацией в условиях, подходящих для гибридизации; облучение тестируемого образца возбуждающим излучением, чтобы вызвать испускание флуоресценции тестируемым образцом; регистрацию интенсивности флуоресцентного излучения;

калибровку указанной интенсивности относительно интенсивностей, демонстрируемых образцами, полученными гибридизацией указанной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность-мишень, с другими зондами, которые совместно с указанным зондом образуют группу, состоящую из олигонуклеотида, последовательность которого полностью комплементарна последовательности-мишени, содержащейся в нуклеиновой кислоте, и олигонуклеотидов, последовательность которых отличается от последовательности указанного олигонуклеотида либо наличием делеции одного, двух или трех оснований, либо заменой оснований в одном, двух, или трех положениях;

определение на основании калибровки степени соответствия между указанными зондом и последовательностью-мишенью, содержащейся в нуклеиновой кислоте.

39. Способ по п.38, дополнительно включающий количественное определение сродства связывания.

40. Способ по п.38, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без обеспечения тушителя сигнала на последовательности-мишени или зонде.

41. Способ по п.38, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без предварительной денатурации указанной последовательности-мишени.

42. Способ по п.38, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без ПЦР-амплификации последовательности-мишени.

43. Способ по п.38, в котором указанная последовательность-мишень представляет собой двухцепочечную ДНК и указанный зонд специфически связывается с указанной последовательностью-мишенью с образованием тройного комплекса.

44. Способ по п.43, в котором указанный зонд представляет собой одноцепочечную ДНК или РНК.

45. Способ по п.38, в котором зонд имеет частично заряженный остов.

46. Способ по п.38, в котором зонд имеет незаряженный остов.

47. Способ по п.46, в котором зонд включает последовательность ПНК.

48. Способ по п.38, в котором указанный зонд представляет собой оцДНК, полученную путем параллельного синтеза.

49. Способ по п.48, в котором указанные зонд и последовательность-мишень имеют одинаковую длину.

50. Способ по п.38, в котором зонд имеет длину от 5 до 30 нуклеотидов.

51. Способ по п.38, в котором возбуждающее излучение исходит от аргонового лазера при длине волны от 200 нм до 1000 нм.

52. Способ по п.38, осуществляемый при температурах в диапазоне от 5 до 85°С.

53. Способ по п.38, осуществляемый при температурах ниже 25°С.

54. Способ по п.38, в котором надежность указанного метода не зависит от последовательности оснований зонда, последовательности оснований мишени, содержания гуанина в указанных зонде и последовательности-мишени и содержания цитозина в указанных зонде и последовательности-мишени.

55. Способ по п.38, в котором тестируемый образец имеет объем около 20 мкл и содержит около 10 фемтомоль последовательности-мишени и около 10 фемтомоль зонда.

56. Способ по п.38, в котором концентрация указанной последовательности-мишени в образце составляет не более 5·10^-10 М.

57. Способ по п.56 в котором концентрация указанного зонда в указанном образце составляет не более 5·10^-10 М.

58. Способ по п.38, осуществляемый по биочипе.

59. Способ по п.38, в котором указанный интеркалирующий флуорофор представляет собой катион и указанная интенсивность прямо коррелирует с указанным сродством связывания.

60. Способ по п.59, в котором указанный интеркалирующий флуорофор ковалентно связан с указанным зондом.

61. Способ по п.59, в котором указанный интеркалирующий флуорофор добавляют в указанную среду в виде, свободном от указанного зонда и свободном от указанной последовательности-мишени.

62. Способ по п.59, в котором указанный интеркалирующий флуорофор является представителем группы, состоящей из YOYO-1, TOTO-1, бромида этидия, гомодимера-1 этидия, гомодимера-2 этидия и акридина.

63. Способ по п.59, в котором длина волны, на которой флуоресцирует указанный интеркалирующий флуорофор, сдвигается на другую длину волны при интеркаляции, причем разность между этой указанной длиной волны и второй указанной длиной волны показывает, является ли комплекс между указанным зондом и мишенью двойным или тройным и что представляет собой указанная мишень - ДНК или РНК.

64. Способ по п.38, в котором один цитозин в каждом из троек оснований C-G-C и G-C-G положительно заряжен.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение касается тройных комплексов нуклеиновых кислот, в частности, способов точного определения тройных комплексов нуклеиновых кислот с применением измерения интенсивности флуоресценции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Флуоресцентные красители десятилетиями применялись для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот. В наиболее простой форме измерения, основанные на определении интенсивности флуоресценции, в типичном случае включают обработку мишени содержащим флуорофор зондом, удаление несвязавшейся части зонда от связавшегося зонда и определение флуоресценции в отмытом образце. Способы измерения в гомогенной системе являются усовершенствованным вариантом в том смысле, что они не требуют стадии отмывки или наличия носителя на основе нежидкой фазы.

Например, в US Patents Nos. 5538848, на имя Livak et al. и 4220450, на имя Maggio раскрыты гомогенные флуоресцентные методы анализа нуклеотидных последовательностей с применением олигонуклеотидных зондов в растворе. Однако в данных патентах требуется использование агентов, являющихся тушителями флуоресценции, в сочетании с агентом-репортером, чтобы различать сигналы, исходящие от гибридизованных зондов и негибридизованных зондов. В способе Livak et al. также необходимо применение ферментов. Тушители флуоресценции и ферменты усложняют эти методы и удорожают их.

В US Patent No.5332659, на имя Kidwell раскрыт способ выявления нуклеотидных последовательностей в растворе с помощью зондов, содержащих по меньшей мере две флуорофорные группы. Флуорофоры необходимо выбирать так, чтобы они при сближении на достаточно близкое расстояние взаимодействовали друг с другом на электронном уровне так, чтобы изменялись их спектральные характеристики. Негибридизованные зонды намного более подвижны, чем зонды, гибридизованные с последовательностью мишени, поэтому вероятность того, что флуорофорные группы на двух зондах окажутся на близком расстоянии друг от друга, более высока в случае негибридизованного зонда, чем в случае гибридизованного зонда. При этом изменения длины волны излучения коррелирующие со свободным зондом, можно регистрировать как меру количества свободного зонда в образце.

В US Patent No.5846729, на имя Wu et al. также раскрыт гомогенный флуоресцентный способ обнаружения нуклеиновых кислот.

Наряду с вышеуказанными разработками, в которых измеряется интенсивность флуоресценции, обсуждаются преимущества методов на основе измерения поляризации флуоресценции. Однако методы на основе поляризации имеют значительные недостатки. Степень изменения поляризации может зависеть от связывания непредсказуемым образом, и интерпретация данных для увязки противоречивых данных с теоретическими предсказаниями может требовать больших усилий, чем хотелось бы для аналитического метода, особенно когда метод нужно автоматизировать. К тому же имеются ограничения, вытекающие из молекулярного веса тех молекул, подвижность которых измеряется при определении поляризации флуоресценции.

Традиционные методы определения нуклеиновых кислот обычно основываются на модели гибридизации двойного комплекса, в которой одноцепочечный зонд специфически связывается с комплементарной одноцепочечной последовательностью мишени. Гибридизация тройного комплекса нуклеиновых кислот была ранее описана, однако считается, что гибридизация между тремя нитями в основном ограничивается лишь очень узким кругом нуклеиновых кислот (например, полипуринами или полипиримидинами). См., например, Floris et al., "Effect of cations on purine-purine-pyrimidine triple helix formation in mixed-valence salt solutions", 260 Eur. J.Biochem. 801-809 (1999). Кроме того, образование или гибридизация таких тройных комплексов основывается на связывании по Хугстину (Hoogsteen) между ограниченным набором соседних оснований, а не на комплементарности оснований по Уотсону-Крику. См., например, Floris et al. и US Patent No.5874555, на имя Dervan et al.

Несмотря на предшествующие разработки, в данной области продолжает существовать потребность в дополнительных простых, высокочувствительных, эффективных и быстрых методах анализа взаимодействий между нуклеиновыми кислотами и/или аналогами нуклеиновых кислот.

Все цитируемые ссылки включены в настоящее изобретение в виде ссылок во всей полноте.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение предусматривает тройные комплексы, включающие одноцепочечный зонд, связанный с двухцепочечной нуклеиновой кислотой-мишенью, причем зонд представляет собой гетерополимерную нуклеиновую кислоту или аналог гетерополимерной нуклеиновой кислоты, а все триплеты оснований этого комплекса являются представителями группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C.

Также предусматривается способ анализа связывания, включающий:

обеспечение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность-мишень, которая содержит как минимум одно пуриновое основание и как минимум одно пиримидиновое основание;

обеспечение зонда, включающего последовательность нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты;

обеспечение катиона;

внесение упомянутых зонда, последовательности мишени и катиона в среду с целью получения тестируемого образца, содержащего тройной комплекс, включающий упомянутый зонд, связанный с упомянутой последовательностью-мишенью, причем все триплеты оснований этого комплекса являются представителями группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C;

облучение образца возбуждающим излучением, чтобы вызвать испускание флуоресценции образцом;

детектирование интенсивности указанного флуоресцентного излучения, причем упомянутая интенсивность коррелирует со сродством связывания между зондом и последовательностью-мишенью;

определение по этой интенсивности степени соответствия между указанными зондом и последовательностью-мишенью.

ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР

Изобретение будет описано в сочетании со следующими чертежами, на которых одинаковыми цифрами обозначены одинаковые элементы.

Фиг.1А, 1В, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С, 4А, 4В, 4С, 5А, 5В, 5С, 5D и 5Е являются составными графиками, на которых представлена зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны для каждого из проанализованных образцов.

Фиг.6 иллюстрирует связывание 15-мерной антипараллельной оцДНК с 50-мерной дцДНК в присутствии катионного интеркалирующего флуорофора YOYO-1 без предварительной денатурации дцДНК

ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение предусматривает тройные комплексы, включающие одноцепочечный зонд, связанный с двухцепочечной нуклеиновой кислотой-мишенью, причем зонд включает гетерополимерную нуклеиновую кислоту или аналог гетерополимерной нуклеиновой кислоты, а все триплеты оснований этого комплекса являются представителями группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C.

В отличие от определенных тройных комплексов Хугстина, известных из предшествующего уровня техники, тройные комплексы по настоящему изобретению стабильны при значениях рН более 7,6. Кроме того, тройные комплексы по изобретению не требуют присутствия гомопиримидиновых или гомопуриновых последовательностей, как в некоторых тройных комплексах, известных из предшествующих работ. Например, последовательность-мишень может содержать от 25% до 75% пуриновых оснований и от 75% до 25% пиримидиновых оснований в любом порядке.

Предпочтительно одноцепочечная нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты в тройном комплексе имеет длину от 5 до 30 оснований, а двухцепочечная нуклеиновая кислота-мишень имеет длину от 8 до 3,3×10 ⁹ пар оснований (п.о.).

Образование тройного комплекса согласно изобретению подходит для многих применений. Например, зонды, ковалентно связанные с агентом, расщепляющим двухцепочечные нуклеиновые кислоты, можно использовать для специфического расщепления последовательностей-мишеней, являющихся двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. Зонды, ковалентно связанные с химиотерапевтическим средством, можно использовать для специфической обработки последовательностей-мишеней, являющихся двухцепочечными нуклеиновыми кислотами.

В предпочтительных воплощениях изобретения предусматривается быстрый, чувствительный, экологически дружественный и безопасный способ анализа связывания между двухцепочечной мишенью и одноцепочечным зондом, в котором мишень включает нуклеотидную последовательность или последовательность аналога нуклеиновой кислоты и зонд включает нуклеотидную последовательность или последовательность аналога нуклеиновой кислоты.

В отличие от некоторых предшествующих методов изобретение не только выявляет наличие специфического связывания зонда и мишени, но и дает качественную и количественную информацию о природе взаимодействия между зондом и мишенью. Так, изобретение позволяет профессионалу различить совершенную комплементарность, мисматчи по одной паре оснований, по двум парам оснований, по трем парам оснований, делеции одной пары оснований, двух пар оснований, трех пар оснований, возникающие между последовательностью оснований зонда и цепи двухцепочечной мишени.

Воплощения изобретения включают калибровку измеряемого сигнала (например, интенсивности флуоресценции) для первой смеси зонда с мишенью относительно сигнала того же типа, присущего другим зондам в комплексе с той же самой мишенью, при этом каждый из остальных зондов отличается от первого зонда по меньшей мере по одному основанию.

Можно построить калибровочную кривую, у которой величина измеряемого сигнала (например, интенсивность флуоресценции) является функцией сродства связывания между мишенью и зондом. Поскольку сродство связывания между мишенью и набором различных зондов варьирует в зависимости от числа некомплементарных оснований, природы мисматчей (A-G против А-С против T-G против Т-С и т.д.), локализации мисматчей в тройном комплексе и т.п., способ изобретения может применяться для секвенирования мишени.

В воплощениях измеряемый сигнал может представлять собой интенсивность флуоресценции флуорофора, включенного в тестируемый образец. В таких воплощениях сродство связывания между зондом и мишенью может прямо или обратно коррелировать с интенсивностью, в зависимости от того, сигнализирует флуорофор о гибридизации тушением сигнала или усилением сигнала. В определенных условиях интенсивность флуоресценции, создаваемой интеркалирующими агентами, может прямо коррелировать со сродством связывания между зондом и мишенью, тогда как в предпочтительных воплощениях с применением неинтеркалирующих флуорофоров, ковалентно связанных с зондом, интенсивность может обратно коррелировать со сродством связывания между зондом и мишенью. У неинтеркалирующих флуорофоров интенсивность флуоресценции снижается при повышении степени комплементарности между зондом и мишенью, предпочтительно в пределах от 0 до 2 мисматчей и/или делеций включительно, более предпочтительно в пределах от 0 до 3 мисматчей и/или делеций включительно.

Изобретение дает возможность количественно определять сродство связывания между зондом и мишенью. Такая информация может представлять ценность для многих применений, включая разработку антисмысловых лекарств с оптимизированными характеристиками связывания.

В отличие от предшествующих методов способ изобретения предпочтительно является гомогенным. Анализ может проводиться без отделения комплекса зонд-мишень от свободных зонда и мишени перед определением величины измеряемого сигнала. Способ не требует разделения в геле, что позволяет сильно повысить производительность тестирования. Количественный анализ отличается простотой и точностью. Вследствие этого при анализе связывания экономится много времени и денег, и он легко поддается автоматизации. Более того, он позволяет быстро выбрать такие параметры связывания, как буфер, рН, концентрация ионов, температура, продолжительность инкубации, относительные концентрации зонда и мишени, концентрация интеркалирующего агента, длина последовательности мишени, длина последовательности зонда и возможная потребность в кофакторах.

Анализ может проводиться, к примеру, в растворе в лунке, на непроницаемой поверхности или на биочипе.

Более того, анализ по изобретению предпочтительно проводится без обеспечения тушителя сигнала на мишени или зонде.

Авторы изобретения ранее описали преимущества анализа гибридизации по интенсивности флуоресценции (см. US Patent Application No.09/224505 от 31 декабря 1998 г.), однако анализ в соответствии с настоящим изобретением специфически выявляет тройные комплексы зонда и двухцепочечной мишени, что устраняет необходимость в денатурировании мишени. Хотя и было известно, что зонды на основе нуклеиновых кислот (или аналогов нуклеиновых кислот) образуют тройные комплексы с определенными ограниченными классами мишеней (см., например, Floris et al., см. выше, Dervan et al., см. выше, Egholm et al., 365 Nature 566 (1993), Tomac et al., 118 J. Am. Chem. Soc. 5544 (1996)), удивительно, что авторы смогли специфически анализировать тройные комплексы между зондами на основе одноцепочечных нуклеиновых кислот (оцДНК и РНК) и мишенями из двухцепочечных нуклеиновых кислот (дцДНК), в которых взаимодействие между зондом и мишенью основывается на комплементарности оснований по Уотсону-Крику (по крайней мере в том смысле, что А связывается с Т, а в случае РНК - с U), а не на очень ограниченной модели гибридизации тройных комплексов Хугстина, как, например, у Dervan et al. Термин "тройной комплекс Уотсона-Крика", используемый в настоящем изобретении, служит для четкого определения этих отличий, ограничивая возможность спаривания между основаниями одноцепочечного зонда и двухцепочечной мишени комбинациями А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и/или C-G-C (включая C⁺-G-C и/или любые другие ионизованные формы основания). Эти трехчленные группы в дальнейшем именуются триплетами оснований Уотсона-Крика, а образующиеся структуры - тройными комплексами Уотсона-Крика.

Подходящие зонды для способа анализа по изобретению включают оцДНК, РНК, ПНК (пептидо-нуклеиновые кислоты) и другие аналоги с незаряженными или частично заряженными остовами. Предпочтительны зонды длиной от 8 до 20 оснований, так как именно в эти пределы попадают наименьшие уникальные последовательности у прокариот и эукариот. Зонды длиной от 12 до 18 оснований особенно предпочтительны, так как именно такова длина наименьших уникальных последовательностей в геноме человека. В воплощениях наиболее предпочтительны зонды длиной от 5 до 30 оснований. Однако для выявления нуклеотидной последовательности, содержащей множество неуникальных последовательностей-мишеней, можно использовать и набор более коротких зондов, которые будут связываться, позволяя однозначно идентифицировать данную последовательность. Длину зонда можно выбрать так, чтобы она соответствовала длине мишени.

В первоначальной заявке US Application Serial No.09/468,679 авторы изобретения раскрыли неожиданные результаты разработки, состоящие в том, что они способны специфически анализировать широкий круг тройных комплексов, образуемых по принципу комплементарности оснований Уотсона-Крика зондами из одноцепочечных нуклеиновых кислот (оцДНК, РНК, оцПНК и других аналогов ДНК или РНК) и мишенями из двухцепочечных нуклеиновых кислот (дцДНК). Авторы раскрыли, что образование и/или стабилизация тройных комплексов усиливается в присутствии в тестируемом образце интеркалирующего агента.

Настоящее описание дополняет предыдущее, раскрывая, что образование и/или стабилизация тройных комплексов усиливается в присутствии катионов в тестируемом образце. К подходящим катионам относятся одновалентные катионы, такие как Na⁺ (предпочтительно в концентрации от 50 до 125 мМ), К⁺ и другие ионы щелочных металлов; двухвалентные катионы, такие как ионы щелочноземельных металлов (Mg²⁺ и Са²⁺) и двухвалентные ионы переходных металлов (Mn²⁺, Ni²⁺, Cd ²⁺, Со²⁺ и Zn²⁺); и катионы с положительным зарядом не менее 3, такие как Co(NH₃ )₆ ³⁺, трехвалентный спермидин и четырехвалентный спермин. Mn²⁺ предпочтительно используется в концентрации от 10 до 30 мМ. Mg²⁺ предпочтительно используется в концентрации от 15 до 20 мМ. Ni²⁺ предпочтительно используется в концентрации около 20 мМ. В воплощениях Mg ²⁺ и Mn²⁺ добавляют в комбинации при концентрации по 10 мМ, по 15 мМ или по 20 мМ каждого (то есть по 10-20 мМ каждого).

Количество катиона, добавляемого в ту среду, в которой образуется тройной комплекс, зависит от ряда факторов, включая природу катиона, концентрацию зонда, концентрацию мишени, присутствие других катионов и содержание различных оснований в зонде и мишени. Предпочтительные концентрации катионов и смесей обычно можно установить экспериментально.

Настоящее изобретение не требует применения радиоактивных зондов, которые небезопасны и трудоемки в применении и должны постоянно возобновляться. Зонды по изобретению предпочтительно безопасны в применении и стабильны в течение многих лет. Соответственно, зонды можно изготовить или заказать в большом количестве и хранить.

В воплощениях зонд метят различными мультимолекулярным сигнальным комплексом, окислительно-восстановительной парой или меткой, обладающей хемилюминесцентными или электрохемилюминесцентными свойствами.

Предпочтительно зонд или мишень (предпочтительно зонд) несет ковалентно связанную флуоресцентную метку. Меткой предпочтительно служит неинтеркалирующий флуорофор. В таких воплощениях флуорофор предпочтительно связан с меткой на любом из концов. К предпочтительным флуоресцентным маркерам относятся биотин, родамин и флуоресцеин, а также другие маркеры, флуоресцирующие при облучении возбуждающей энергией.

Длину волны возбуждения выбирают (экспериментально и/или исходя из известных сведений) так, чтобы она соответствовала максимуму возбуждения используемого флуорофора, предпочтительно от 200 до 1000 нм. Предпочтительно выбирают флуорофоры с длиной волны испускания от 200 до 1000 нм. В предпочтительных воплощениях для облучения флуорофора светом используют аргоновый лазер с длиной волны в пределах от 400 до 540 нм, а испускаемую флуоресценцию детектируют в пределах от 500 до 750 нм.

Анализ по изобретению можно проводить в широком диапазоне температур, например, от 5 до 85°С. Некоторые предшествующие способы требуют повышенной температуры, что увеличивает стоимость и время проведения анализа. С другой стороны, изобретение может осуществляться при комнатной температуре и ниже (при температуре ниже 25°С).

Надежность изобретения не зависит от содержания гуанина и цитозина в мишени. Поскольку пары оснований G-C образуют три водородные связи, тогда как пары А-Т образуют только две, то мишени и зонды с высоким содержанием G или С более устойчивы и обладают более высокой температурой плавления. Вследствие этого наличие мисматчей, повышающих содержание GC в области гибридизации зонда и мишени выше того уровня, что имеется в полностью комплементарных гибридах, может компенсировать ослабление связывания, вызванное неполной комплементарностью зонда. Тройные комплексы, содержащие все возможные мисматчи между зондом и мишенью, оказались менее устойчивыми, чем полностью комплементарные комплексы, что всегда вело к снижению интенсивности флуоресценции по сравнению с полностью комплементарными гибридами при использовании интеркалирующего флуорофора.

Анализ по изобретению чрезвычайно чувствителен, что устраняет необходимость в проведении ПЦР-амплификации мишени. Например, можно анализировать образцы объемом в 20 мкл, содержащие 10 фемтомоль мишени и 10 фемтомоль зонда. Воплощения изобретения достаточно чувствительны для анализа мишеней в концентрации 5×10^-9 М, предпочтительно в концентрации не более 5×10^-10 М. Воплощения изобретения достаточно чувствительны для применения зондов в концентрации 5×10^-9 М, предпочтительно в концентрации не более 5×10^-10 М. Разумеется, вышеуказанные значения не следует понимать так, будто этим способом нельзя обнаружить более высокие концентрации.

Среда, в которой образуются тройные комплексы, может быть любой стандартной средой, пригодной для хранения нуклеотидов. См., например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Lab Manual", vol. 2 (1989). Например, жидкая среда может содержать нуклеотиды, воду, буферы и соли в стандартных концентрациях. Если применяются только двухвалентные катионы для усиления образования тройных комплексов, то не следует включать хелаторы типа ЭДТА или ЭГТА в реакционную смесь.

Специфическое связывание между комплементарными основаниями происходит в широком диапазоне условий, отличающихся температурой, концентрацией соли, ионной силой и составом буферов. Примеры таких условий и способов их применения известны в данной области.

В отличие от многих тройных комплексов Хугстина, которые неустойчивы или не существуют при значениях рН выше 7,6, тройные комплексы Уотсона-Крика по изобретению стабильны в широком диапазоне значений рН, предпочтительно от рН 5 до р Н9.

Предпочтительно тройные комплексы образуются при температуре от 5°С до 25°С в течение 1 часа или меньше. Большая продолжительность реакции не требуется, но в большинстве случаев инкубация вплоть до 24 часов не оказывает неблагоприятного действия на тройные комплексы. Быстрое связывание тройных комплексов Уотсона-Крика по изобретению контрастирует со значительно более медленным связыванием при определении тройных комплексов Хугстина.

Хотя в этом и нет нужды, однако образование тройных комплексов в растворе можно облегчить, используя определенные реагенты вдобавок к катионам. Предпочтительные примеры таких реагентов включают белки, связывающие одноцепочечные НК, такие как белок Rec А, белок гена 32 фага Т4, связывающий одноцепочечные НК белок Е.coli, белки, связывающиеся в области малой или большой бороздок нуклеиновой кислоты, виологен и такие интеркалирующие вещества, как бромид этидия, актиномицин D, псорален, ангелицин. Такие способствующие реагенты могут оказаться полезными при экстремальных рабочих условиях, например при необычных значениях рН или чрезвычайно высоких температурах.

Анализ по изобретению может применяться для идентификации доступных участков в свернутых нуклеотидных последовательностях, для определения числа некомплементарных пар оснований в гибридизационном комплексе, для картирования генома.

В настоящем изобретении авторы могут иногда утверждать, что тройные комплексы Уотсона-Крика образуются при гибридизации зонда с двойной спиралью мишени. Хотя флуорофоры, присоединенные к зонду, и проявляют тушение флуоресценции при контакте с мишенями типа двойной спирали, содержащими цепочку комплементарных по Уотсону-Крику оснований, что указывает на наличие какого-то связывания, авторы не уверены, что то, что происходит в тройном комплексе Уотсона-Крика, лучше всего описывается как гибридизация в том смысле, который традиционно ассоциируется с образованием двойной спирали Уотсона-Крика. Хотя образование тройного комплекса Уотсона-Крика в настоящем изобретении иногда и называется гибридизацией, но это сделано лишь для удобства и не может служить причиной для ограничения объема изобретения в отношении того, каким образом можно лучше всего описать образование тройного комплекса Уотсона-Крика.

Изобретение будет раскрыто более подробно на нижеследующих Примерах, однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только ими.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Смысловую и антисмысловую 50-мерные последовательности оцДНК-мишени, происходящей из экзона 10 гена кистозного фиброза человека (Nature 380, 207 (1996)), синтезировали на ДНК-синтезаторе (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems) и очищали методом ВЭЖХ. Эквимолярные количества комплементарных олигонуклеотидов денатурировали при 95°С в течение 10 мин и постепенно отжигали по мере понижения температуры до 21°С в течение более 1,5 часов. Двухцепочечную ДНК (дцДНК) растворяли в бидистиллированной воде при концентрации 1 пмоль/мкл.

Последовательность смысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.1): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC СТА TGA TGA ATA TA-3'.

Последовательность антисмысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.1): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID No.2 - это 50-мерная последовательность из мутантной дцДНК-мишени, идентичная ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.1) за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто) в положении аминокислоты 507, в которой последовательность CAT дикого типа была изменена на CGT.

Последовательность смысловой цепи SEQ ID No.2: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC СТА TGA TGA ATA TA-3'.

Последовательность антисмысловой цепи SEQ ID No.2: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID No.3 - это 47-мерная последовательность мутантной дцДНК-мишени, идентичная ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.1) за исключением делеции трех последовательных пар оснований (показанных в виде пропуска) в положении аминокислот 507 и 508, в которой последовательность CTT дикого типа была делегирована.

Последовательность смысловой цепи SEQ ID No.3: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT...TGG TGT TTC СТА TGA TGA ATA TA-3'.

Последовательность антисмысловой цепи SEQ ID No.3: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA...A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Зонд №1 (SEQ ID No.4), представляющий собой 15-мерный оцДНК-зонд с присоединенной флуоресцентной группой в 5'-положении, был сконструирован так, что он полностью комплементарен отрезку в 15 нуклеотидов смысловой цепи 50-мерной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.1), перекрывая положения аминокислот 505-510 (Nature 380, 207 (1996)). Зонд №1 синтезировали на ДНК-синтезаторе, очищали методом ВЭЖХ и растворяли в бидистиллированной воде при концентрации 1 пмоль/мкл.

Последовательность SEQ ID No.4: 5'-Flu-CAC CAA AGA TGA TAT-3'.

Реакционная смесь для гибридизации (40 мкл) имела следующий состав: 0,4 пмоль дцДНК-мишени, 4 пмоль 5'-меченной флуоресцеином оцДНК зонда №1, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, а также 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125 или 150 мМ NaCl. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре (21°С) в течение 1 часа без предварительной денатурации. Образцы помещали в кварцевую кювету, облучали лучом аргонового лазера при длине волны 488 нм и регистрировали интенсивность флуоресценции. Максимум флуоресценции наблюдался при длине волны 525 нм, на которой излучает флуоресцеин. Строили график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны для каждого анализируемого образца.

В отсутствие NaCl или в присутствии 10 мМ или 25 мМ NaCl гибридизация между дцДНК-мишеней и оцДНК-F зонда не обнаруживалась, что выражалось в одинаковой интенсивности флуоресценции как при смешивании мишени дикого типа SEQ ID No.1 или мутантной мишени SEQ ID No.2 с зондом №1 (SEQ ID No.4), так и в присутствии одного зонда №1 (данные не представлены).

После инкубации в течение 1 часа при 21°С в присутствии 50 мМ NaCl легко образовывались тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F, состоящие из полностью комплементарных последовательностей (SEQ ID No.1 + зонд №1), что приводило к снижению интенсивности флуоресценции на 49% по сравнению с флуоресценцией зонда №1 (меченная оцДНК-F) (Фиг.1А). Напротив, неполностью комплементарные тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F, содержащие мисматч по одной паре оснований G-T (SEQ ID No.2 + зонд №1), были менее устойчивы при этих условиях реакции, проявляя снижение интенсивности флуоресценции только на 11% по сравнению с флуоресценцией зонда №1.

Инкубация в течение 1 часа в присутствии 75 мМ NaCl была слегка менее благоприятна для образования тройных комплексов, приводя к снижению интенсивности флуоресценции на 30% для полностью комплементарного тройного комплекса дцДНК:оцДНК-Р (Фиг.1В). При мисматче по 1 паре оснований G-T наблюдалось минимальное образование тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, что вызывало снижение флуоресценции лишь на 0,4%.

Присутствие 100 мМ и 125 мМ NaCl также способствовало максимальному образованию тройных комплексов ДНК между полностью комплементарными мишенью SEQ ID No.1 и зондом №1, и образованию менее стабильного тройного комплекса ДНК между SEQ ID No.2 и зондом №1 с мисматчем по 1 паре оснований G-T (данные не представлены). В присутствии 150 мМ NaCl образования тройного комплекса ДНК не наблюдалось.

Таким образом, включение одновалентных катионов, таких как Na⁺ и К⁺ в определенных концентрациях, было достаточным для выявления образования тройных комплексов между дцДНК-мишенями и меченным флуоресцеином оцДНК-зондом без предварительной денатурации. Более того, реакция проходила при комнатной температуре всего лишь за 1 час инкубации при соотношении зонда к мишени 10 к 1, с использованием нативной дцДНК. Использовавшиеся в данном примере дцДНК-мишени и оцДНК-зонд содержали 33% GC и не содержали протяженных участков ДНК из гомопуринов или гомопиримидинов. Несмотря на присутствие 6 пиримидиновых оснований, распределенных между 15 нуклеотидами из оцДНК-зонда, тройные комплексы ДНК легко образовывались. Важно, что анализ гибридизации по изобретению позволяет выявить разницу между полностью комплементарными последовательностями ДНК и последовательностями ДНК с мисматчем по 1 паре оснований при использовании нативной ДНК.

Пример 2

Чтобы удостовериться, что анализ гибридизации, в котором используются 5'-меченные флуоресцеином оцДНК-зонды и дцДНК-мишени без предварительной денатурации, применим к зондам и мишеням, сильно различающимся по содержанию GC в ДНК (и потенциально отличающимся по предпочтительным условиям отжига), были синтезированы новые 15-мерные оцДНК-F-зонды и 50-мерные дцДНК-мишени, которые очищали и отжигали, как описано выше. оцДНК-F-зонды и дцДНК-мишени растворяли в бидистиллированной воде при концентрации 1 пмоль/мкл.

SEQ ID No.5 - это последовательность 50-мерной дцДНК-мишени, представляющая собой модификацию последовательности SEQ ID No.1, в которой содержание GC было изменено с 30% на 52%.

Последовательность смысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.5): 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.5): 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.6 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CTC была изменена на СТТ.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.6: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTT TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.6: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAA AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.7 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CAT была изменена на CGT.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ Ю No.7: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.7: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.8 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CAT была изменена на СТТ.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.8: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.8: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG AGA AGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.9 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CTC была изменена на ССС.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.9: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.9: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG GGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.10 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CTC была изменена на CGC.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.10: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CGC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.10: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG CGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.11 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.5 за исключением мутации по двум соседним парам оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CAT была изменена на ACT.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.11: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC СТА CGA TGA CTC TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.11: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG АСА CAC CAG AGA GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.12 - это последовательность 50-мерной дцДНК-мишени, представляющей собой модификацию последовательности SEQ ID No.1, в которой содержание GC было изменено с 30% на 72%.

Последовательность смысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.12):

5'-GAC CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.12): 5'-CAG GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.

SEQ ID No.13 - это последовательность 50-мерной мутантной дцДНК-мишени, идентичная SEQ ID No.12 за исключением мутации по одной паре оснований (подчеркнуто), в которой последовательность CGT была изменена на CAT.

Последовательность смысловой цепи мутантной SEQ ID No.13: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.

Последовательность антисмысловой цепи мутантной SEQ ID No.13: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA TGA CCG TGC CTC GGA GGG TGC TC-3'.

Зонд №2 (SEQ ID No.14), представляющий собой 15-мерную оцДНК с присоединенной флуоресцентной группой в 5'-положении, был сконструирован таким образом, чтобы он был полностью комплементарен отрезку в 15 нуклеотидов смысловой цепи 50-мерной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.5).

Последовательность SEQ ID No.14: 5'-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3'.

Зонд №3 (SEQ ID No.15), представляющий собой 15-мерную оцДНК с присоединенной флуоресцентной группой в 5'-положении, был сконструирован таким образом, чтобы он был полностью комплементарен отрезку в 15 нуклеотидов смысловой цепи 50-мерной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID No.12).

Последовательность SEQ ID No.15: 5'-Flu-CAC CAG GGA CGA CCG-3'.

Анализу гибридизации тройного комплекса ДНК, представленному в Примере 1, способствовало добавление одновалентных катионов в реакционную смесь. Далее исследовали специфичность гибридизационного анализа, используя двухвалентные катионы (вместо одновалентных катионов) для усиления образования тройного комплекса ДНК между дцДНК-мишенями и оцДНК-F-зондами с различным содержанием GC.

Реакционная смесь для гибридизации (40 мкл) имела следующий состав: 0,4 пмоль дцДНК-мишени, 4 пмоль 5'-меченного флуоресцеином оцДНК-зонда, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, а также от 5 до 30 мМ MnCl₂ или от 5 до 30 мМ MgCl₂ или от 5 до 30 мМ NiCl ₂. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре (21°С) в течение 1 часа без предварительной денатурации. Образцы помещали в кварцевую кювету, облучали лучом аргонового лазера при длине волны 488 нм и регистрировали интенсивность флуоресценции. Образцы сохраняли и оставляли на ночь инкубироваться при комнатной температуре в целом на 22 часа, после чего повторно измеряли интенсивность флуоресценции при облучении лучом аргонового лазера. Строили график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны для каждого анализируемого образца.

При инкубации оцДНК-F зонда №2 (содержание GC=53%) с 50-мерной дцДНК-мишенью дикого типа (SEQ ID No.5) и дцДНК мутантных мишеней (последовательностей от SEQ ID No.6 до SEQ ID No.11) в присутствии 10 мМ MnCl ₂ образовывались тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F при комнатной температуре в неденатурирующих условиях. В то время, как полностью комплементарные тройные комплексы ДНК давали максимальное снижение интенсивности флуоресценции (снижение на 43% после 1 часа инкубации), у менее стабильных тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих мисматч по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + зонд №2), интенсивность флуоресценции была на 20% ниже, чем у одного зонда №2 после 1 часа инкубации (Фиг.2А). Тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F с мисматчами по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.7 + зонд №2), Т-Т (SEQ ID No.8 + зонд №2), C-A (SEQ ID No.9 + зонд №2), и мисматчем по 2 парам следующих друг за другом оснований A-G и С-Т (SEQ ID No.11 + зонд №2), все были менее стабильными, чем полностью комплементарные тройные комплексы ДНК (SEQ ID No.5 + зонд №2), и давали интенсивности флуоресценции, промежуточные между теми, что наблюдались для одного зонда №2 и для полностью комплементарного тройного комплекса ДНК (данные не представлены). За исключением тройного комплекса ДНК с мисматчем по 1 паре оснований Т-Т, который был наименее стабильным (снижение флуоресценции через 1 час инкубации составило только 5%), все другие тройные комплексы ДНК с мисматчами давали очень близкие интенсивности флуоресценции. Только у тройного комплекса дцДНК:оцДНК-F, содержащего мисматч по 1 паре G-A (SEQ ID No.10 + зонд №2), интенсивность флуоресценции была ниже, чем у полностью комплементарного тройного комплекса ДНК (данные не представлены).

Образование тройного комплекса ДНК было более эффективным после 22 часов инкубации в присутствии 10 мМ MnCl₂. Тем не менее, достигалась более выраженная дискриминация между тройными комплексами ДНК с полностью комплементарными последовательностями и с последовательностями, содержащими некомплементарные пары оснований. Как видно из Фиг.2В, интенсивность флуоресценции тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих полностью комплементарные последовательности (SEQ ID No.5 + зонд №2) или мисматчи по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + зонд №2), была на 92% и на 66% ниже, соответственно, чем интенсивность флуоресценции одного зонда №2 после 22 часов инкубации в присутствии 10 мМ MnCl ₂. Аналогично, инкубация в присутствии 30 мМ MnCl₂ в течение 22 часов приводила к снижению интенсивности флуоресценции на 90% и 57% для полностью комплементарных тройных комплексов ДНК и некомплементарных по 1 паре оснований T-G, соответственно (Фиг.2С).

Добавление 20 мМ MgCl₂, 20 мМ MnCl ₂ или 20 мМ NiCl₂ также способствовало образованию тройных комплексов дцДНК:оцДНК-Р при реакции оцДНК-F зонда №3 (содержание GC=73%) с соответствующей 50-мерной дцДНК-мишенью дикого типа (SEQ ID No.12) и мутантной дцДНК-мишенью (SEQ ID No.13), проводимой в течение 1 часа (данные не представлены). Как и ожидалось, полностью комплементарные тройные комплексы ДНК давали максимальное уменьшение интенсивности флуоресценции, тогда как менее стабильные тройные комплексы ДНК с мисматчем по 1 паре оснований А-С (SEQ ID No.13 + зонд №3) давали промежуточные уровни интенсивности флуоресценции (данные не представлены). Полностью комплементарные тройные комплексы ДНК образовывались очень эффективно в присутствии 10 мМ MnCl₂ после 22 часов инкубации, вызывая снижение интенсивности флуоресценции на 89%. При этих условиях реакции тройные комплексы ДНК с мисматчем по 1 паре оснований А-С образовывались с равной эффективностью, давая снижение флуоресценции на 90% по сравнению с таковой одного зонда №3 (данные не представлены). Более четкое разрешение между полностью комплементарными и некомплементарными по 1 паре оснований тройными комплексами ДНК, содержащими 73% GC, таким образом, достигалось после короткой инкубации в течение 1 часа в присутствии 20 мМ двухвалентных катионов.

Полностью комплементарные тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F (содержание GC=33%) (SEQ ID No.1 + зонд №1) легко образовывались в течение 1 часа в присутствии 10 мМ MnCl₂, давая снижение интенсивности флуоресценции на 57% по сравнению с таковой одного зонда №1 (данные не представлены). Такие условия реакции были крайне неблагоприятны для тройных комплексов ДНК, содержащих мисматч по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.2 + зонд №1), что вело к увеличению флуоресценции по сравнению с таковой одного зонда №1 (данные не представлены). Близкие результаты получали после 22 часов инкубации в присутствии 15 мМ MgCl ₂.

Независимо от содержания GC в дцДНК-мишеней и оцДНК-зондах, добавление таких двухвалентных катионов, как Mn ⁺², Mg⁺² или Ni⁺² способствовало образованию тройных комплексов ДНК в неденатурирующих условиях, что давало возможность точно отличать полностью комплементарные последовательности от последовательностей с мутациями по 1 паре оснований.

Пример 3

Анализ гибридизации тройных комплексов ДНК в Примерах 1 и 2 проводили в присутствии одного типа одновалентных или двухвалентных катионов. Следующие примеры демонстрируют надежность способа по изобретению при определении различий между полностью комплементарными и некомплементарными по 1 паре оснований тройными комплексами ДНК, когда в реакционной смеси присутствуют комбинации двухвалентных катионов.

Реакционная смесь для гибридизации (40 мкл) имела следующий состав: 0,4 пмоль дцДНК-мишени, 4 пмоль 5'-меченного флуоресцеином оцДНК зонда, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, а также 5 мМ MgCI₂ и 5 мМ MnCl₂, или 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂, или 15 мМ MgCl ₂ и 15 мМ MnCl₂, или 20 мМ MgCl₂ и 20 мМ MnCl₂. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре (21°С) в течение 1 часа без предварительной денатурации. Образцы помещали в кварцевую кювету, облучали лучом аргонового лазера при длине волны 488 нм и регистрировали интенсивность флуоресценции. Образцы сохраняли и оставляли на ночь инкубироваться при комнатной температуре в целом на 22 часа, после чего повторно измеряли интенсивность флуоресценции при облучении лучом аргонового лазера. Строили график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны для каждого анализируемого образца.

Во всех смесях дцДНК-мишени и оцДНК-F зонда добавление 5 мМ MgCl ₂ и 5 мМ MnCl₂ было недостаточным для выявления образования тройного комплекса ДНК (данные не представлены). Тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F образовывались с равной эффективностью при инкубации оцДНК-F зонда №3 (содержание GC=73%) в течение 1 часа с 50-мерной дцДНК-мишенью дикого типа (SEQ ID No.12) в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂ или 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, давая снижение интенсивности флуоресценции на 20% по сравнению с таковой одного зонда №3. Условия реакции в обоих случаях были весьма неблагоприятными для тройных комплексов ДНК с мисматчем по 1 паре оснований А-С (SEQ ID No.13 + зонд №3), вызывая снижение интенсивности флуоресценции на 14% по сравнению с таковой одного зонда №3. Спектры флуоресценции, снятые после 1 часа инкубации в присутствии 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, показаны на Фиг.3А.

Инкубация в течение 22 часов приводила к образованию большего количества тройных комплексов ДНК. У тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F с полностью комплементарными последовательностями (SEQ ID No.12 + зонд №3) или с мисматчем по 1 паре оснований А-С (SEQ ID No.13 + зонд №3) интенсивность флуоресценции была на 62% и 21% ниже, соответственно, чем у одного зонда №3, после 22 часов инкубации в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂ (Фиг.3В). Очень близкие результаты были получены с образцами, содержащими 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, после 22 часов (данные не представлены).

Обработка 20 мМ MgCl₂ и 20 мМ MnCl₂ в течение всего лишь 1 часа приводила к снижению флуоресценции на 46% и 3% у полностью комплементарных тройных комплексов ДНК и тройных комплексов ДНК с мисматчем по 1 паре оснований А-С, соответственно (Фиг.3С). В этом случае дальнейшая инкубация образцов в течение 22 часов не давала никаких преимуществ (данные не представлены).

При тестировании дцДНК-мишеней, содержащих 73% G-C, гибридизационным анализом по изобретению оказалось, что обработка в течение 1 часа в присутствии 20 мМ MgCl₂ и 20 мМ MnCl₂ обеспечивает максимальные различия в стабильности и флуоресценции между полностью комплементарными тройными комплексами ДНК и тройными комплексами ДНК с мисматчем по 1 паре оснований.

Пример 4

При инкубации оцДНК-F зонда №1 (содержание GC=33%) с дцДНК-мишенью дикого типа (SEQ ID No.1) или мутантными дцДНК-мишенями (SEQ ID No.2 и SEQ ID No.3) в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂ наблюдается минимальное образование тройных комплексов ДНК (данные не представлены). Однако инкубация в присутствии 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂ в течение 1 часа способствовала образованию полностью комплементарных тройных комплексов ДНК, о чем свидетельствует снижение интенсивности флуоресценции на 49% по сравнению с таковой зонда №1 (Фиг.4А). Тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F, содержащие мисматч по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.2 + зонд №1) или делецию по 3 парам оснований (SEQ ID No.3 + зонд №1), были очень неустойчивы в присутствии 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, что вело к снижению интенсивности флуоресценции на 2% и увеличению флуоресценции на 5%, соответственно, по сравнению с флуоресценцией одного зонда №1 (Фиг.4А).

Обработка 20 мМ MgCl₂ и 20 мМ MnCl ₂ в течение 1 часа приводила к снижению флуоресценции на 68%, 48% и 6% у полностью комплементарных тройных комплексов ДНК и у тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих мисматч по 1 паре оснований G-T или делецию по 3 парам оснований, соответственно, по сравнению с таковой одного зонда №1 (Фиг.4В). Оптимальная дискриминация между тройными комплексами ДНК с 33% G-C, содержащими последовательности дикого типа или некомплементарные пары оснований, достигалось при инкубации образцов в течение 22 часов. Полностью комплементарные тройные комплексы ДНК (SEQ ID No.1 + зонд №1) оставались стабильными на протяжении 22 часов, давая снижение интенсивности флуоресценции на 62% по сравнению с таковой одного зонда №1 (Фиг.4С). Напротив, тройные комплексы дцДНК:оцЦНК-F с мисматчем по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.2 + зонд №1) или с делецией по 3 парам оснований (SEQ ID No.3 + зонд №1), оказались очень нестабильными при 22-часовой инкубации, давая увеличение флуоресценции на 1% и 13%, соответственно, по сравнению с таковой одного зонда №1 (Фиг.4С).

Пример 5

Полностью комплементарные тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F (содержание GC=53%) (SEQ ID No.5 + зонд №2) легко образовывались за 1 час в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂, давая снижение флуоресценции на 68% по сравнению с таковой одного зонда №2 (Фиг.5А). Тройные комплексы ДНК, содержащие мисматч по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + Проба No.2), были менее устойчивы, давая снижение интенсивности флуоресценции на 20% по сравнению с таковой одного зонда №2 (Фиг.5А).

Инкубация тех же самых образцов в течение 22 часов приводила к еще более резкому различию во флуоресценции у полностью комплементарных или неполностью комплементарных тройных комплексов ДНК. Как видно из Фиг.5В, интенсивность флуоресценции тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих полностью комплементарные последовательности (SEQ ID No.5 + зонд №2) или мисматч по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + зонд №2), была на 92% и 33% ниже, соответственно, чем флуоресценция одного зонда №2, в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂.

В аналогичном эксперименте, в то время, как интенсивность флуоресценции полностью комплементарного тройного комплекса ДНК (SEQ ID No.5 + зонд №2) снижалась на 85% по сравнению с таковой одного зонда №2 после 22 часов инкубации в присутствии 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂ , интенсивность флуоресценции у тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих мисматч по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.7 + зонд №2), С-А (SEQ ID No.9 + зонд №2) или по 2 соседним парам оснований A-G и С-Т (SEQ ID No.11 + зонд №2), снижалась на 43%, 69% и 32%, соответственно (Фиг.5С). Только у тройного комплекса дцДНК:оцДНК-F, содержащего мисматч по 1 паре оснований G-A (SEQ ID No.10 + зонд №2), интенсивность флуоресценции снижалась лишь немного по сравнению с таковой у полностью комплементарного тройного комплекса ДНК (данные не представлены).

Оптимальная дискриминация между тройными комплексами ДНК с 53% G-C, содержащими полностью комплементарные последовательности или некомплементарные пары оснований, достигалась при инкубации образцов в течение 1 часа в присутствии 15 мМ MgCl ₂ и 15 мМ MnCl₂. Такие условия реакции сильно способствуют образованию тройных комплексов ДНК с полностью комплементарными последовательностями ДНК (SEQ ID No.5 + зонд №2), вызывая снижение флуоресценции на 74% по сравнению с таковой одного зонда №2 (Фиг.5D). Напротив, тройные комплексы дцДНК:оцДНК-F, содержащие мисматч по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + зонд №2), были менее устойчивы в присутствии 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, давая снижение флуоресценции на 15% по сравнению с таковой одного зонда №2 после 1 часа инкубации (Фиг.5D).

Аналогично, тройные комплексы ДНК с 1 мисматчами по 1 паре оснований G-T (SEQ ID No.7 + зонд №2), 1 паре оснований С-А (SEQ ID No.9 + зонд №2) 1 паре оснований G-A (SEQ ID No.10 + зонд №2) и двум соседним парам оснований A-G и С-Т (SEQ ID No.11 + зонд №2), все были намного менее устойчивы, чем полностью комплементарный тройной комплекс ДНК (данные не представлены). Тройной комплекс ДНК с мисматчем по 1 паре оснований G-A, довольно легко образовывавшийся в присутствии 10 мМ MnCl₂ или 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MnCl₂, разрушался в присутствии 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂, давая снижение флуоресценции лишь на 7% по сравнению с таковой одного зонда №2 (данные не представлены). При реакции зонда №2 (содержание GC=53%) с дцДНК-мишенью SEQ ID No.3 (содержание GC=33%) наблюдалось повышение флуоресценции на 3% по сравнению с таковой одного зонда №2 (Фиг.5D), указывая, что тройной комплекс ДНК не образуется. Этот результат ожидался, учитывая, что эта комбинация зонда и мишени ведет к некомплементарности по 5 парам оснований.

Обработка 15 мМ MgCl₂ и 15 мМ MnCl₂ в течение 22 часов вызывала снижение интенсивности флуоресценции тройных комплексов дцДНК:оцДНК-F, содержащих полностью комплементарные последовательности (SEQ ID No.5 + зонд №2) и мисматч по 1 паре оснований T-G (SEQ ID No.6 + зонд №2), на 76% и 44%, соответственно, по сравнению с одним зондом №2 (Фиг.5Е).

В совокупности приведенные примеры показывают, что добавление по меньшей мере одного типа катиона в среду для гибридизации усиливает образование тройного комплекса между дцДНК-мишенью и оцДНК флуоресцентно меченных зондов с весьма различным содержанием GC, что позволяет точно и надежно отличить полностью комплементарные последовательности от тех, что содержат различные мутации.

Пример 6

Пример 6 демонстрирует, что анализ данного изобретения может различать между точно комплементарными комплексами дцДНК:оцДНК и комплексами дцДНК:оцДНК, содержащими ошибочные спаривания или делеции 1 пары оснований, 2 пар оснований и 3 пар оснований в присутствии катионного интеркалятора ДНК, YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Спектроскопические ЯМР-анализы механизма взаимодействия между YOYO-1 и дцДНК показали, что интеркаляция YOYO-1 приводит к локалализованной деконденсации спирали дцДНК на 106°, создавая общий спиральной повтор из 13 пар оснований в отличие от нормального спирального повтора из 10 пар оснований в неконденсированной В-конформации дцДНК [J.Biomolec. Struct, and Dynamics 16, 205-222 (1998)].

Комплементарные смысловые и антисмысловые 50-мерные последовательности-мишени оцДНК, происходящие из экзона 10 гена муковисцидоза человека [Nature 380,207 (1996)], синтезировали на ДНК-синтезаторе (Expedite 8909, PerSeptive Biosystem) и очищали при помощи ВЖХ. Эквимолярные количества комплементарных олигонуклеотидов нагревали при 95°С в течение 10 минут и давали им отжигаться постепенно по мере снижения температуры до 21°С на протяжении 1,5 часов. дцДНК-олигонуклеотиды растворяли в ддН₂ O при концентрации 1 пмоль/мкл.

Последовательность для смысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1) была:

5'-TGG CAC CAT TAA AGA ААА TAT CAT CTT TGG TGT TTC СТА TGA TGA АТАТА-3'.

Последовательность для антисмысловой цепи ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1) была:

5'-ТАТ АТТ CAT CAT AGG ААА CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID NO:2 была 50-мерной мутантной последовательностью-мишенью дцЦНК, идентичной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1), за исключением мутации одной пары оснований (подчеркнутой) в положении аминокислоты 507, в котором CAT последовательности смысловой цепи дикого типа был заменен на CGT.

Последовательность для смысловой цепи SEQ ID NO:2 была:

5'-TGG CAC CAT TAA AGA ААА TAT CGT CTT TGG TGT TTC СТА TGA TGA ATATA-3'.

Последовательность для антисмысловой цепи (SEQ ID NO:2) была:

5'-TAT АТТ CAT CAT AGG ААА CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID NO:16 была 50-мерной мутантной последовательностью-мишенью дцДНК, идентичной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1), за исключением мутации последовательных двух пар оснований (подчеркнутых) в положениях аминокислот 506 и 507, в которых CAT последовательности смысловой цепи дикого типа был заменен на ACT.

Последовательность для смысловой цепи SEQ ID NO:16 была:

5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT ТТС СТА TGA TGA АТАТА-3'.

Последовательность для антисмысловой цепи SEQ ID NO:16 была:

5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID NO:17 была 50-мерной мутантной последовательностью-мишенью дцДНК, идентичной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1), за исключением мутации последовательных трех пар оснований (подчеркнутых) в положениях аминокислот 506 и 507, в которых CAT последовательности смысловой цепи дикого типа был заменен на ACG.

Последовательность для смысловой цепи SEQ ID NO:17 была:

5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACG CTT TGG TGT ТТС СТА TGA TGA ATATA-3'.

Последовательность для антисмысловой цепи SEQ ID NO:17 была:

5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGC GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

SEQ ID NO:18 была 47-мерной мутантной последовательностью-мишенью дцДНК, идентичной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1), за исключением делеции последовательных трех пар оснований (показанных тремя точками) в положениях аминокислот 507 и 508, в которых CTT последовательности смысловой цепи дикого типа был делегирован.

Последовательность для смысловой цепи SEQ ID NO:18 была:

5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT...TGG TGT TTC СТА TGA TGA АТАТА-3'.

Последовательность для антисмысловой цепи SEQ ID NO:18 была:

5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA...A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Зонд №1 был 15-мерным оцДНК-зондом, сконструированным таким образом, что он является полностью комплементарным 15-нуклеотидному сегменту смысловой цепи 50-мерной ДНК-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1), охватывающим положения аминокислот 505-510 [(Nature 380, 207 (1996)]. Хиральность этого зонда была противоположной или антипараллельной моральности смысловой цепи в мишени. Зонд №1 синтезировали на ДНК-синтезаторе, очищали при помощи ВЖХ и растворяли в ддН₂O при концентрации 1 пмоль/мкл.

Последовательность для зонда №1 была:

5'-САС САА AGA TGA ТАТ-3'.

Гибридизационная реакционная смесь (120 мкл) содержала следующее: 6 пмоль дцДНК-мишени, 6 пмоль оцДНК-зонда, 0,5×ТВЕ и 500 нМ интеркалятора ДНК YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре (21°С) в течение 5 минут, помещали в кварцевую кювету, облучали лучом аргонового ионного лазера, имеющим длину волны 488 нм, и наблюдали периодически в отношении флуоресцентного излучения по мере увеличения температуры со временем в нагреваемой камере. Одновременные измерения температуры этих проб достигались при помощи регулируемого программным обеспечением датчика температуры, помещенного непосредственно в каждую пробу. Максимальные интенсивности флуоресценции строили в виде графика как функции температуры для каждой анализируемой пробы.

Фиг.6 показывает, что наивысшая интенсивность флуоресценции достигалась при взаимодействии 50-мерной неденатурированной дцДНК-последовательности-мишени дикого типа (SEQ ID NO:1) с 15-мерным оцДНК-зондом №1 при температуре от 30°С до 85°С. При температурах ниже 65°С, Т _m 50-мерной дцДНК дикого типа образовывались комплексы дцДНК:оцДНК, усиленные интеркалятором ДНК YOYO-1. Когда температура увеличивалась выше 65°С, комплексы дцДНК:оцДНК превращались в комплексы оцДНК:оцДНК. Ясно, что YOYO-1 был способен интеркалироваться и флуоресцировать эффективно в обоих типах комплексов.

В противоположность этому неполностью комплементарные комбинации зонда и мишени, генерирующие ошибочное основание 1 пары оснований (SEQ ID NO:2 + зонд №1), ошибочное спаривание последовательных 2 пар оснований (SEQ ID NO:16 + зонд №1), ошибочное спаривание последовательных 3 пар оснований (SEQ ID NO:17 + зонд №1) и делецию 3 пар оснований (SEQ ID NO:18 + зонд №1) приводили к интенсивности флуоресценции, которая была на 57%, 94%, 97% и на 98% более низкой при 30°С и на 47%, 79%, 92% и 91% более низкой при 65°С, соответственно, чем наблюдаемые с точно спаренными последовательностями (фиг.1). Контрольные пробы, содержащие 50-мерные дцДНК-мишени плюс 500 нМ YOYO-1, обнаруживали уровни флуоресценции, которые были равными или более низкими, чем уровень флуоресценции, наблюдаемый с комплексами с 3 ошибочно спаренными основаниями при 30°С (данные не показаны). Уровень флуоресценции, испускаемой пробой оцДНК-зонд №1 плюс 500 нМ YOYO-1, был идентичен уровню флуоресценции, испускаемой одним YOYO-1 (данные не показаны). Когда температура повышалась выше 65°С, степень дискриминации между точным спариванием и ошибочными спариваниями пар оснований уменьшалась, что указывало на постепенный распад структуры дцДНК:оцДНК. При 85°С интенсивность флуоресценции, достигаемая ошибочным спариванием 1 пары оснований, ошибочным спариванием 2 пар оснований, ошибочным спариванием 3 пар оснований и делецией 3 пар оснований, была на 40%, 63%, 92% и 83% более низкой, чем получаемая с точным спариванием (фиг.6). При любой конкретной температуре характерный уровень флуоресценции, испускаемой каждым комплексом, наблюдали на протяжении времени, и он был стабильным между 5 минутами и 24 часами.

Присутствие агента деконденсации ДНК, YOYO-1 позволяло использовать оцДНК-зонд для различения между точно комплементарньми комплексами дцДНК:оцДНК и комплексами, содержащими ошибочные спаривания 1 пары оснований, 2 пар оснований или 3 пар оснований или делеций без необходимости предварительной денатурации дцДНК-мишеней.

Хотя изобретение описано подробно и с привлечением конкретных примеров, однако любой специалист в данной области должен понимать, что в нем можно производить различные изменения и модификации, не отходящие от его сущности и не выходящие за его рамки.