способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157

Формула изобретения

Способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157, включающий смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции, отличающийся тем, что в качестве панкреатического гидролизата рыбного сырья используют панкреатический гидролизат кильки при следующем соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат кильки	22,0-27,0
Натрия хлорид	4,0-6,0
Агар	14,5-15,5
Сорбит	9,0-11,0
Дистиллированная вода	Остальное

после нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,0-7,4, а индикатор, состоящий из кислого фуксина, бромтимолового синего, 1%-ного раствора гидроксида натрия и дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, г/л:

Кислый фуксин	4,5-5,5
Бромтимоловый синий	3,5-4,5
1%-ный раствор гидроксида натрия	150,0-170,0 мл
Дистиллированная вода	Остальное

добавляют в полученную среду в количестве 18-22 мл, при этом предварительно кислый фуксин растворяют в 1%-ном растворе гидроксида натрия и к полученному раствору добавляют бромтимоловый синий и дистиллированную воду.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для клинических и эпидемиологических исследований.

Известен способ приготовления питательней среды (Среды бактериологические для клинических и эпидемиологических исследований. Каталог. М., 2001. - С.54), которая готовится по следующей схеме: смешиваются панкреатический гидролизат казеина, панкреатический гидролизат мясной муки, желчная соль, натрий хлористый, сорбит, нейтральный красный, фиолетовый красный, агар, полученная смесь добавляется в дистиллированную воду, кипятится 2-3 мин до расплавления, фильтруется, охлаждается до температуры 45-50°С и разливается в чашки Петри. Среда используется в течение 24-48 ч после приготовления.

Также известен способ приготовления питательной среды (Энтеробактерии: Руководство для врачей / Авт. И.В.Голубева, В.А.Килессо, Б.С.Киселева и др.; Под ред. В.И.Покровского. - М., Медицина, 1985. - С.265 - прототип), включающий смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции. Среда используется в день приготовления.

Известные способы приготовления питательных сред имеют ряд недостатков:

1) они являются сложными и для их приготовления необходимы дорогостоящие и дефицитные компоненты;

2) полученные среды чувствительны к свету и теплу и сами по себе могут изменять свой цвет, в результате чего в одинаково красный цвет окрашиваются как сорбитположительные, так и сорбитотрицательные колонии эшерихий, что ставит диагностику Е. coli 0157 недостоверной;

3) ввиду цветовой нестабильности готовые среды рекомендуется использовать в день приготовления;

4) бактерии со слабой ферментативной активностью могут ошибочно быть учтены как сорбит(-), т.к. для этих вариантов требуется более продолжительная инкубация, в процессе которой изменяется цвет самой среды.

Техническим решением задачи является обеспечение доступности, упрощение приготовления среды, повышение четкости изменения цвета колоний на дифференциальной среде, сокращение срока инкубации и более длительный срок хранения готовой для употребления среды.

Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157, включающем смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции, в качестве панкреатического гидролизата рыбного сырья используют панкреатический гидролизат кильки при следующем соотношении компонентов, г/л:

панкреатический гидролизат кильки	22,0-27,0
натрия хлорид	4,0-6,0
агар	14,5-15,5
сорбит	9,0-11,0
дистиллированная вода	остальное

после нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,0-7,4, а индикатор, состоящий из кислого фуксина, бромтимолового синего, 1%-ного раствора гидроксида натрия и дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, г/л:

кислый фуксин	4,5-5,5
бромтимоловый синий	3,5-4,5
1%-ный раствор гидроксида натрия	150,0-170,0 мл
дистиллированная вода	остальное

добавляют в полученную среду в количестве 18-22 мл, при этом предварительно кислый фуксин растворяют в 1 %-ном растворе гидроксида натрия и к полученному раствору добавляют бромтимоловый синий и дистиллированную воду.

Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработан способ приготовления дифференциально-диагностической среды. Полученная данным способом среда стабильна при воздействии солнечного или электрического света, обладает четким дифференцирующим свойством, позволяющим достоверно различать сорбит(-) и сорбит(+) бактерии. Вследствие чего полученная среда может использоваться для первичной дифференциации Е.coli 0157 от других серотипов кишечной палочки, поскольку в 70-80% случаев является сорбит(-).

Способ приготовления питательной среды для выявления E.coli 0157 осуществляется следующим образом.

Первоначально сухие ингредиенты среды разводят в воде и доводят до кипения, фильтруют, после чего устанавливается рН 7,0-7,4, вводится индикатор, затем готовая среда разливается по флаконам и автоклавируется при 0,5 атм в течение 20 мин. Расплавленную и охлажденную до 45-50°С среду разливают в чашки Петри. Готовая среда имеет оливково-зеленый цвет, прозрачная на просвете. На данной среде штаммы кишечной палочки расщепляющие сорбит уже через 15-18 ч после посева, образуют непрозрачные желтого или оранжевого цвета колонии с изменением цвета среды вокруг колоний из оливково-зеленого в желто-оранжевую. Сорбит(-) E.coli (0157) к тому же сроку образует непрозрачные зеленовато-голубые колонии на фоне неизмененной, оливково-зеленого цвета среды.

Пример конкретного осуществления способа приготовления питательной среды для выявления E.coli 0157

25 г Панкреатического гидролизата кильки, 5 г натрия хлорида, 13,5 г агара, 10 г сорбита перемешивают, добавляют до 1000 мл дистиллированной воды и нагревают до кипения и расплавления агара. После чего полученную массу фильтруют, контролируют рН (7,0-7,4) и добавляют 20 мл предварительно приготовленного индикатора. Затем масса разливается по колбам или флаконам и автоклавируется при 0,5 атм в течение 20 мин.

Индикатор готовится по прописи: 0,5 г кислого фуксина растворяется в 16 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют 84 мл дистиллированной воды и 0,4 г бромтимолового синего.

Количественные значения ввода в среду сорбита, кислого фуксина и бромтимолового синего подобраны экспериментально. При вводе сорбита в количестве 0,5-0,7% - реакция нечеткая (слабо отличаются сорбит(+) колонии от сорбит(-), не происходит изменения окраски среды вокруг колоний). При применении кислого фуксина меньше 0,5% - все колонии Е.coli бледные и не отличаются друг от друга, а в случае увеличения свыше 0,5% - все колонии, напротив, приобретают окраску от светло-красного до интенсивно-красного цвета. При введении бромтимолового синего ниже 0,4% - среда имеет слегка зеленоватую окраску и не меняет своего цвета в процессе роста на ней колоний, поэтому разницы между Е.coli, усваивающими и не усваивающими сорбит, практически установить не удается. В случае добавления бромтимолового синего больше 0,4% - среда приобретает очень темный сине-зеленый цвет, колонии Е.coli, выросшие в данных условиях, трудно различаются.

Готовая для употребления среда может храниться без изменения своих свойств в течение 7 дней, в то время как среды, приготовленные по известным способам, - 1-2 дня, т.к. при более длительном хранении самопроизвольно меняют свой цвет.

Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации ввода в базовую питательную среду необходимого объема углевода (сорбита) и объема индикаторов, не влияющих на рост бактерий, но позволяющих дифференцировать выросшие колонии Е.coli по заданному признаку. Цвет полученной среды - оливково-зеленый. При положительной реакции (утилизация сорбита) - колонии окрашиваются в цвет в диапазоне от желтого до оранжевого (в зависимости от биохимической активности штамма), при этом среда вокруг них также желтеет. При отрицательной реакции, когда сорбит не ферментируется (E.coli 0157), - колонии окрашиваются в зеленовато-голубой цвет, среда вокруг них не изменяется, т.е. остается оливково-зеленого цвета. Кроме того, цветовую дифференциацию сорбит(+) от сорбит(-) кишечных палочек, осуществляемую предлагаемым способом, можно осуществлять уже спустя 15-18 ч после посева материала, в то время как известными способами только через 24-26 ч и даже более.