способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Формула изобретения

Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты, включающий гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавление этилового спирта, отделение осадка фильтрованием, разделение смеси олигонуклеотидов ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, осаждение олигонуклеотидов этиловым спиртом, приготовление раствора сухой смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, фильтрацию и стерилизацию полученного раствора, отличающийся тем, что перед проведением ультрафильтрации к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и состоит в совершенствовании технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты, находящего применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний: тапеторетинальных абиотрофий; нервно-мышечных заболеваний: болезни Шегрена и др.

Известен способ получения рибонуклеотидов [Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 - Jun. 154, 1982] путем гидролиза раствора дрожжевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) панкреатической рибонуклеазой. В этом способе раствор гидролизованной дрожжевой рибонуклеиновой кислоты центрифугируют, разделяют на фракции на колонке с сефадексом G 25 и лиофилизируют. Недостатком данного способа являются невысокий выход продукта и наличие большого количества высокомолекулярной РНК.

Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому эффекту является способ [Fux В.В., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture ofribonu-cleotides. USA Patent Number 5064758 Nov. 12, 1991], который выбран за прототип. Согласно этому способу проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой при температуре 62-65°C в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этанол, отделяют осадок фильтрованием, а фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 45-51%.

Задачей изобретения является увеличение выхода продукта. Поставленная задача решается тем, что гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой проводят при температуре 62-65°С в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этиловый спирт в количестве 15-30% по объему, отделяют осадок фильтрованием, к фильтрату добавляют миндальную кислоту до концентрации 0,10-0,12 мг/л. Миндальная кислота добавляется в качестве ингибитора рибонуклеаз. Способностью ингибировать рибонуклеазы обладает достаточно большой ряд веществ [McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436], но преимуществом миндальной кислоты является то, что она не ухудшает качество готового продукта, так как сама является лекарственным препаратом [Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988]. Применение миндальной кислоты имеет следствием унификацию целевого продукта, что обеспечивается ингибированием посторонней рибонуклеазной активности. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0°-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов, осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 57-63%.

Проведение способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу)

70 г дрожжевой РНК растворяют в 430 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,1 2н. раствором гидроксида натрия. Добавляют 140 мг панкреатической рибонуклеазы и гидролизуют в течение 5 ч при температуре 65°С. Общий объем гидролизата 465 мл. Гидролизат охлаждают до температуры 25-35°С, добавляют 120 мл этанола, осадок отделяют на фильтре, а фильтрат подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану с диаметром пор 100 Å при давлении 0,4 МПа и температуре 30°С. Получают 360 мл пермеата. К ретанту добавляют дважды по 70 мл воды и дополнительно получают еще 140 мл пермеата. В объединенный пермеат объемом 500 мл добавляют 5 л этилового спирта (10-кратный объем). Суспензию охлаждают до 0-4°С, выдерживают при такой температуре в течение 4 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 0,36 л этилового спирта и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 36 г сухой смеси.

36 г сухой смеси олигопуклеотидов и 6 г хлористого натрия растворяют в 958 г дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор желтого цвета фильтруют через фильтр с величиной пор 2000 Å при давлении 98 кПа. Раствор рибонуклеотидов в стерильных условиях разливают в ампулы из нейтрального стекла по 3 мл и подвергают обработке в автоклаве при 119°С в течение 34 мин. Концентрация нуклеотидов в препарате 3,3%. Проведение всех указанных операций обеспечивает получение нетоксичного, стерильного, апирогенного препарата с выходом 51%.

Удельное поглощение E_см =240 при =260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,15
А 260/280	1,60

Состав препарата, вес.%:

нуклеозиды	1,5
мононуклеотиды	25,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	72,9

Пример 2

Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,056 мг миндальной кислоты (концентрация 0,10 мг/л).

Выход продукта составляет 57%.

Удельное поглощение E_см=240 при =260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,85
А 260/280	1,69

Состав препарата, вес.% :

мононуклеотиды	24,1
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	75,9

Пример 3

Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,07 мг миндальной кислоты (концентрация 0,12 мг/л).

Выход препарата составляет 63%.

Удельное поглощение E_см=240 при =260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,9
А 260/280	1,62

Состав препарата, вес.% :

мононуклеотиды	15,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	84,4

Разработанный метод предназначен для промышленного применения. Преимущество предлагаемого способа получения панкреатического гидролизата РНК заключается в увеличении выхода продукта в 1,2 раза при сохранении его нетоксичности и апирогенности.

Литература:

1. Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of luecocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 -Jun. 154, 1982.

2. Fux B.B., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture of ribonucleotides. USA Patent Number 5064758 -Nov. 12, 1991.

3. McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436.

4. Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988.