способы и композиции для ингибирования размножения вич-1

Формула изобретения

1. Композиция, содержащая по меньшей мере два варианта пептида или полипептида формулы

R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X ₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 SEQ ID NO:8,

где Y ₇ выбран из группы, состоящей из Arg, Lys, Ser и Asn;

X₉ выбран из группы, состоящей из Glu и Asp;

Z₁₂ выбран из группы, состоящей из Lys и Asn;

R1 выбран из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, низшего алканоила и последовательности примерно из 1-5 аминокислот, необязательно замещенной низшим алкилом или низшим алканоилом;

R2 выбран из группы, состоящей из свободного гидроксила, амида и последовательности примерно из 1-5 дополнительных аминокислот, необязательно замещенной амидом, и

где по крайней мере в одном из двух указанных вариантов Y₇ представляет собой Arg, и Z₁₂ представляет собой Lys; и по меньшей мере во втором из двух указанных вариантов Y₇ представляет собой Asn и Z₁₂ представляет собой Asn,

указанная композиция способна индуцировать выработку антител против Tat ВИЧ-1, что может ингибировать размножение ВИЧ-1.

2. Композиция по п.1, где R1 представляет собой Val, в результате чего образуется последовательность

Val-Asp-Pro-Y₇-Leu-X ₉-Pro-Trp-Z₁₂ SEQ ID NO:37.

3. Композиция по п.1, где R1 представляет X₂-Pro-Val, где Х ₂ выбран из группы, включающей Glu и Asp, в результате чего образуется последовательность X₂-Pro-Val-Asp-Pro-Y ₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂ (SEQ ID NO:38), необязательно замещенная низшим алкилом или низшим алканоилом.

4. Композиция по п.1, где R2 представляет последовательность -His-Pro-Gly-Ser-(SEQ ID NO:16), необязательно замещенную амидом.

5. Композиция по п.1, где указанный вариант последовательности выбран из группы состоящей из:

R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:17,
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Asp-Pro-Trp-Lys-R2
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:19
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Asp-Pro-Trp-Lys-R2
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:22
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:20
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Asp-Pro-Trp-Lys-R2
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:24
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:21

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Lys-R2
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:18
и
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:23.

6. Композиция по п.1, содержащая

R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:17
и
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:18

и одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, включающей:

R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:19
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:22
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:20
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:24
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2	SEQ ID NO:21
и
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2	SEQ ID NO:23.

7. Композиция по п.1, содержащая по меньшей мере семь указанных вариантов аминокислотных последовательностей SEQ ID No:8.

8. Композиция по п.6, содержащая по меньшей мере восемь указанных последовательностей.

9. Композиция по п.1, которая, кроме того, содержит по меньшей мере один пептид или полипептид формулы R3-Lys-X₄₂ -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 SEQ ID No:5, где Х₄₂ выбран из группы, включающей Gly или Ala; R3 выбран из группы, включающей водород, низший алкил, низший алканоил и последовательность из 1-5 аминокислот, необязательно замещенную низшим алкилом или низшим алканоилом; R4 выбран из группы, включающей свободный гидроксил, амид и последовательность, состоящую из одного или до 5 дополнительных аминокислот, исключая основные аминокислоты -Lys-Arg-Arg-, необязательно замещенные амидом.

10. Композиция по любому из пп.1-9, где указанные пептиды или полипептиды получены рекомбинантным или синтетическим путем.

11. Композиция по любому из пп.1-9, где один или несколько указанных пептидов экспрессируются как синтетические пептиды, связанные с белком-носителем.

12. Композиция по любому из пп.1-9, где один или несколько указанных пептидов экспрессируются как множественный антигенный пептид, необязательно связанный с белком-носителем.

13. Композиция по любому из пп.1-9, где один или несколько указанных пептидов экспрессируются в белке, получаемом рекомбинантными технологиями, необязательно слитую с белком-носителем в той же самой рамке считывания.

14. Композиция по п.11, где указанный белок-носитель выбран из группы, включающей белок DnaK E.coli, белок GST, микобактериальный белок теплового шока 70, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, галактокиназу, убиквитин, -фактора скрещивания, -галактозидазу и белок NS-1 гриппа.

15. Композиция по п.12, где указанный белок-носитель выбран из группы, включающей белок DnaK Е.coli, белок GST, микобактериальный белок теплового шока 70, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, галактокиназу, убиквитин, -фактора скрещивания, -галактозидазу и белок NS-1 гриппа.

16. Композиция по п.13, где указанный белок-носитель выбран из группы, включающей белок DnaK E.coli, белок GST, микобактериальный белок теплового шока 70, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, галактокиназу, убиквитин, -фактора скрещивания, -галактозидазу и белок NS-1 гриппа.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп.1-9, фармацевтически приемлемый носитель и необязательно адъювант, указанная композиция способна индуцировать выработку антител против Tat ВИЧ-1, что может ингибировать размножение ВИЧ-1.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, где один или несколько указанных пептидов связаны с белком-носителем.

19. Способ индукции антитела против Tat ВИЧ-1, где указанный способ включает стадию

введения индивидууму эффективного количества композиции по п.1, которая активно индуцирует выработку антител, взаимодействующих с белками Tat ВИЧ-1 различных штаммов или подтипов ВИЧ-1.

20. In vitro способ определения присутствия и титра антител, индуцированных путем иммунизации иммуногеном Tat, где указанный способ включает:

(A) контактирование биологического образца, взятого у иммунизированного индивидуума, с пептидной или полипептидной композицией по п.1, связанной с твердым носителем;

(B) промывку указанного носителя для удаления из указанного биологического образца любого материала, не связанного с указанными последовательностями;

(С) контактирование указанного носителя с реагентом, ассоциированным с обнаруживаемой меткой, где указанный реагент выявляет связывание между указанными последовательностями на указанном твердом носителе и антителом в указанном биологическом образце и где указанная метка продуцирует обнаруживаемый сигнал.

21. Композиция антитела, содержащая множественные антитела, где каждое антитело связано с пептидом или полипептидом композиции по любому из пп.1-9, где композиция взаимодействует с белком Tat ВИЧ-1 различных штаммов и подтипов ВИЧ-1 и ингибирует размножение ВИЧ-1.

22. Композиция антитела по п.21, где каждое антитело выбрано из группы, включающей выделенное поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека, антитело, получаемое путем скрининга фагового дисплея, одноцепочечного антитела и фрагмент антитела.

23. Композиция антитела по п.21, содержащая антитело, которое связано с эпитопом R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asp-R2 (SEQ ID NO:18) или R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 (SEQ ID NO:23).

24. Композиция антитела по п.21, содержащая антитело, которое специфически связывается с эпитопом с аминокислотной последовательностью Lys-X₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys SEQ ID No:10, где Х₄₂ выбран из группы, включающей Gly и Ala.

25. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или композицию антитела по п.21, и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция ингибирует размножение ВИЧ-1.

26. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или композицию антитела по п.22, и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция ингибирует размножение ВИЧ-1.

27. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или композицию антитела по п.23, и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция ингибирует размножение ВИЧ-1.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или композицию антитела по п.24, и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция ингибирует размножение ВИЧ-1.

29. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или композицию антитела по п.25, и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция ингибирует размножение ВИЧ-1.

30. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.21.

31. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.22.

32. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.23.

33. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.24.

34. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.25.

35. Способ снижения уровней вируса ВИЧ-1, где указанный способ включает стадии введения человеку антитела или композиции антитела по п.26.

36. Синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид или полипептид композиции по пп.1-9, где указанный пептид или полипептид индуцирует выработку антител, ингибирующих размножение ВИЧ-1.

37. Синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты по п.36, которая введена в клетку-хозяина млекопитающего.

38. Фармацевтическая композиция, содержащая синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты по п.36, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант, где указанная композиция способна индуцировать выработку антител против Tat ВИЧ-1, что может ингибировать размножение ВИЧ-1.

39. Синтетическая молекула, экспрессирующая пептиды и полипептиды, которые способны индуцировать выработку антител против Tat ВИЧ-1, что может ингибировать размножение ВИЧ-1, содержащая синтетическую последовательность нуклеиновую кислоту по п.36, эффективно связанную с регуляторными последовательностями нуклеиновой кислоты, которые осуществляют и контролируют экспрессию продукта, указанного синтетического гена в клетке-хозяине.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые могут быть использованы для ингибирования размножения вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) у инфицированных пациентов с симптомами или без симптомов и для ослабления размножения ВИЧ-1 после первичного заражения у ранее неинфицированных индивидуумов в целях минимизации прогрессирования СПИДа.

Предпосылки создания изобретения

Различные методы лечения инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), направлены на трансактивирующий ген (tat) ВИЧ-1, который продуцирует белок (Tat), играющий важную роль в транскрипции этого вируса. Ген tat и его белок были секвенированы и исследованы на предполагаемую возможность их использования для лечения ВИЧ-инфекций [см., например, патенты США №№5158877, 5238882 и 5110802; Международные патентные заявки №№ WO 92/07871, WO 91/10453, WO 91/09958 и WO 87/02989, опубликованные 14 мая 1992, 25 июля 1991, 11 июля 1991 и 21 мая 1987, соответственно]. Белок Tat высвобождается из клетки, что делает возможным его поглощение другими инфицированными клетками с усилением транскрипции ВИЧ-1 в этих клетках и неинфицированными клетками с изменением активации генов клетки-хозяина. Tat сообщает этим клеткам восприимчивость к инфицированию указанным вирусом. Уровень поглощения Tat клетками очень высок и, как сообщалось, опосредуется короткой основной последовательностью указанного белка [S.Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:664-668 (1994)].

Ведутся интенсивные исследования по иммунизации с использованием белка Tat ВИЧ-1 в качестве потенциальной вакцины против СПИДа. В опубликованных исследованиях последовательность Tat ВИЧ-1 HXB/LAV была использована в качестве иммуногена или в качестве рекомбинантного белка [A.Cafaro et al., Nat. Med., 5:643-650 (1999)], ДНК-вакцины [S.Calarota et al., Lancet. 351:1320-5 (1998)], инактивированного белка (Tat-токсоида) [S.S. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96(19):10842-10847 (1999)], A. Gringeri et al., J. Hum. Virol. 1:293-8 (1998)] или ДНК-вакцины, экспрессирующей неактивный Tat [E.Caselli et al., J.Immunol., 162:5631-5638 (1999)]. Иммуннизация полноразмерной последовательностью Tat индуцировала как клеточный, так и гуморальный иммунитет. См. также M.C. Rhe et al., J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Virol. 10:408-416 (1995); C.J. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8116-8120 (1997) и другие].

Международная патентная заявка № WO 92/14755, опубликованная 3 сентября 1992, относится к белку Tat и к рецептору клеточной поверхности - интегрину, способному связываться с белком Tat. Были идентифицированы две последовательности Tat, связывающиеся с интегрином: -Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- [SEQ ID NO: 1], а также Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro- [SEQ ID NO: 2]. Эти последовательности представляют собой основную область или домен, который является доминантным сайтом связывания с интегрином. В описании указанной заявки продемонстрировано, что ряд пептидов, соответствующих этим последовательностям Tat, и соответствующие интегрины блокируют in vitro-связывание клеток с Tat-сенсибилизированными планшетами так же, как и антитела против соответствующих интегринов. Однако в указанном описании также показано, что эти реагенты не блокируют поглощение функционального Tat клетками (см., пример 9 в WO92/14755), что делает неэффективным предложенный механизм действия для терапевтического лечения ВИЧ-инфекции. Последовательности Tat, описанные в указанной Международной заявке, отличаются от пептидных иммуногенов настоящего изобретения.

Как моноклональные, так и поликлональные антитела против белка Tat, были легко продуцированы у животных и было показано, что они блокируют поглощение белка Tat in vitro [см., например, работы D.Brake et al., J.Virol., 64:962 (1990); D.Mann et al., EMBO J. 10, 1733 (1991); J. Abraham et al.; P.Auron et al.; работу M.Jaye et al.; G.Zauli et al., цитируемые выше]. В более поздних работах было показано, что моноклональные или поликлональные антитела против белка Tat, добавленные в среду с тканевой культурой, ослабляли ВИЧ-1-инфекцию in vitro [работа L.Steinaa et al., Arch. Virol. 139:263 (1994); М.Re et al., цитируемая выше; и G.Zauli et al., J. Acq. Imm. Def. Syndr. Hum. Retrovirol., 10:306 (1995)].

В публикациях авторов настоящей заявки [G. Goldstein, Nature Med. 2:960 (1996) и Международная патентная заявка №WO95/31999, опубликованная 30 ноября 1995] приводятся данные, свидетельствующие о том, что секреция белка Tat ВИЧ-1 из инфицированных клеток и его поглощение как инфицированными, так и неинфицированными клетками играет важную роль в инфекционности ВИЧ-1. Предшествующие исследования также показали, что антитела против белка Tat блокировали in vitro поглощение Tat и ингибировали инфекционность in vitro. Было высказано предположение, что активная иммунизация животных индуцирует образование антител против белка Tat ВИЧ-1, используемого в качестве потенциальной вакцины против СПИДа. См. также G. Goldstein et al., «Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus (SHIV₃₃ )», Vaccine, 18:2789 (2000).

В других публикациях автора настоящего изобретения (Международная патентная заявка №WO99/02185, опубликованная 21 января 1999, и патент США №5891994, выданный 6 апреля 1999 (обе эти работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки)) была предложена новая концепция лечения и предупреждения ВИЧ-1-инфекции, предусматривающая использование последовательностей Tat, которые распознавались иммунной системой кроликов как эпитопы. В отличие от предшествующих работ, обсуждаемых выше, эти публикации относятся к терапевтическим и иммуногенным комбинациям, требующим присутствия, по крайней мере, двух, а предпочтительно, всех четырех пептидов или полипептидов Tat, включающих последовательности «эпитопа I», охватывающие следующие аминокислотные остатки 4 (или 5) - 10 Tat: -Asp-Pro-Х₇-Leu-Glu-Pro- [SEQ ID NO: 3] или R1-Val-Asp-Pro-Х₇-Leu-Glu-Pro-R² [SEQ ID NO: 4], где Х₇ представляет Arg, Lys, Ser или Asn. Такие композиции индуцируют антитела, реагирующие с большинством белков Tat ВИЧ-1, и ингибируют размножение ВИЧ-1. В соответствии с указанной публикацией, в эту композицию могут быть добавлены некоторые другие последовательности Tat, которые включают пептид или полипептид «эпитопа II», охватывающего аминокислотные остатки 41-50 Tat формулы R3-Lys-Х₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID NO: 5], где Х₄₂ выбран из группы, состоящей из Gly или Ala. Альтернативно, в эту композицию могут быть добавлены пептид или полипептид «эпитопа III», охватывающего аминокислотные остатки 56-62 Tat формулы R5-Arg-Arg-Х₅₈-Z₅₉ -A₆₀-Y₆₁-Ser-R6 [SEQ ID NO: 6], где Х ₅₈ выбран из группы, состоящей из Ala, Pro, Ser и Gln; Y₆₁ выбран из группы, состоящей из Asp, Asn, Gly и Ser; Z₅₉ выбран из группы, состоящей из Pro и His; а A₆₀ выбран из группы, состоящей из Gln и Pro. Кроме того, альтернативно, в эту композицию могут быть добавлены пептид или полипептид «эпитопа IV», охватывающего аминокислотные остатки 62-73 Tat формулы R7-Ser-Gln-Х₆₄-His-Gln-Y₆₇ -Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID NO: 7], где Х₆₄ выбран из группы, состоящей из Asn и Thr; Y₆₇ выбран из группы, состоящей из Ala и Val. Сама эта композиция может быть использована для индуцирования антител против большого числа последовательностей Tat, характеризующих множественные варианты ВИЧ-1. Указанные композиции или генерированные антитела используют в качестве вакцины или для профилактического лечения, направленного против указанных множественных вариантов.

Несмотря на накопленные знания о распространении заболеваний, ассоциированных с ВИЧ-1, необходимость в разработке композиций и способов как для профилактического, так и для терапевтического лечения ВИЧ-1-инфекций, которые позволяли бы снижать уровни вируса ВИЧ-1 в целях лечения и возможного предупреждения последующего, в основном, смертельного заболевания СПИДа, остается актуальной.

Краткое описание изобретения

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композиции, включающей, по крайней мере, два варианта пептида или полипептида эпитопа I формулы R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z ₁₂-R2 [SEQ ID NO: 8], где Y₇ выбран из группы, состоящей из Arg, Lys, Ser и Asn; Х₉ выбран из группы, состоящей из Glu и Asp; Z₁₂ выбран из группы, состоящей из Lys и Asn; R1 выбран из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, низшего алканоила и последовательности примерно из 1-5 аминокислот, необязательно замещенной низшим алкилом или низшим алканоилом; R2 выбран из группы, состоящей из свободного гидроксила, амида и последовательности примерно из 1-5 дополнительных аминокислот, необязательно замещенной амидом. В этой композиции, по крайней мере, один из двух вариантов должен иметь формулу, где Y ₇ представляет Arg, а Z₁₂ представляет Lys, а, по крайней мере, второй из двух вариантов должен иметь формулу, где Y₇ представляет Asn и Z₁₂ представляет Asn. Каждый пептид этой композиции распознается иммунной системой приматов как эпитоп I Tat ВИЧ-1. Эта формула позволяет конструировать и использовать ряд пептидных комбинаций.

В другом аспекте настоящего изобретения вышеописанная композиция, кроме того, содержит один или несколько дополнительных пептидов или полипептидов, которые представляют собой другие аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотным остаткам 5-12 Tat ВИЧ-1. Эти необязательные аминокислотные последовательности подробно описаны ниже. Эти последовательности, предпочтительно, происходят от штамма ВИЧ-1, имеющего вариантный белок Tat в указанной области.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к описанной выше композиции, содержащей пептиды или полипептиды, которая содержит, по крайней мере, два необходимых пептида эпитопа I, распознаваемых иммунной системой приматов (а предпочтительно, другие пептиды эпитопа I) в комбинации с одним или несколькими эпитопами II, III и/или IV Tat ВИЧ-1. Эпитопы II, III и IV представляют собой пептиды Tat ВИЧ-1, формулы которых представлены в публикации Международной патентной заявки №WO99/02185, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Такие композиции могут объединять соответствующие пептиды Tat ВИЧ-1, так чтобы эти композиции индуцировали образование антител, реагирующих примерно более чем с 95% всех известных белков Tat ВИЧ-1.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции антител, включающей, по крайней мере, одно антитело, предпочтительно генерированное у примата, которое специфически связывается с пептидом или полипептидом формулы R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z ₁₂-R2 [SEQ ID NO: 8], где Y₇ выбран из группы, состоящей из Arg, Lys, Ser и Asn; Х₉ выбран из группы, состоящей из Glu и Asp; Z₁₂ выбран из группы, состоящей из Lys и Asn; R1 выбран из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, низшего алканоила и последовательности примерно из 1-5 аминокислот, необязательно замещенной низшим алкилом или низшим алканоилом; R2 выбран из группы, состоящей из свободного гидроксила, амида и последовательности примерно из 1-5 дополнительных аминокислот, необязательно замещенной амидом. Указанная композиция антител предпочтительно содержит, по крайней мере, два антитела, то есть одно антитело, которое связывается с вариантом эпитопа I, где Y₇ представляет собой Arg, а Z₁₂ представляет собой Lys, и, по крайней мере, второе антитело, которое связывается со вторым вариантом эпитопа I, где Y₇ представляет собой Asn и Z₁₂ представляет собой Asn. В эту композицию могут быть также включены другие антитела, направленные не на указанные два конкретных варианта, а на другие варианты. Такие антитела в указанной композиции связываются с последовательностями эпитопа I, распознаваемыми иммунной системой приматов, где указанный эпитоп присутствует на множестве вариантов белков Tat ВИЧ-1. Эти антитела включают ряд конструкций антител, таких как моноклональные антитела, которые более подробно описаны ниже.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, в частности к моноклональному антителу, которое специфически связывается с распознаваемым иммунной системой приматов эпитопом белка Tat ВИЧ-1, причем указанный эпитоп включает аминокислотную последовательность -Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z₁₂ - [SEQ ID NO: 9], где Y₇, Х₉ и Z₁₂ определены выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции антител, содержащей, по крайней мере, одно антитело, распознающее пептидную последовательность эпитопа II -Lys-Х₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys [SEQ ID NO: 10], где Х₄₂ представляет собой Gly или Ala и где указанный эпитоп отличается от эпитопа -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys [SEQ ID NO: 11], распознаваемого ранее описанными антителами. Предпочтительно, указанные композиции включают одно антитело, которое распознает пептид, где Х₄₂ представляет собой Gly, и пептид, где Х₄₂ представляет собой Ala. Указанные антитела вырабатываются предпочтительно у приматов. Эти антитела в указанной композиции связываются с последовательностями эпитопа II, распознаваемыми иммунной системой приматов, где указанный эпитоп присутствует на множестве вариантов белков Tat ВИЧ-1. Эти антитела включают ряд конструкций антител, которые более подробно описаны ниже.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, а предпочтительно, к моноклональному антителу, которое распознает пептидную последовательность эпитопа II -Lys-Х₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SEQ ID NO: 10], где Х₄₂ представляет Gly или Ala и где указанный эпитоп отличается от эпитопа -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SEQ ID NO: 11], распознаваемого ранее описанными антителами.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному или синтетическому гену, который последовательно кодирует пептид или полипептид, содержащий, по крайней мере, два варианта пептида или полипептида эпитопа I формулы R1-Asp-Pro-Y ₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NO: 8], определенной выше. В этом синтетическом гене, по крайней мере, один из двух вариантов должен иметь формулу, где Y ₇ представляет собой Arg и Z₁₂ представляет собой Lys, а, по крайней мере, второй из двух вариантов должен иметь формулу, где Y₇ представляет собой Asn и Z ₁₂ представляет собой Asn. Этот синтетический ген необязательно содержит карбокси-концевой пептид эпитопа II, распознаваемый иммунной системой приматов. Альтернативно, рекомбинантный или синтетический ген содержит семь или восемь предпочтительных аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемых иммунной системой приматов и идентифицированных ниже. Синтетический ген может содержать каждую аминокислотную последовательность, отделенную спейсерной последовательностью, либо он может экспрессировать каждый пептид/полипептид считывания вместе с белком-носителем с сохранением открытой рамки считывания. Указанный синтетический ген может быть отделен от белка-носителя спейсером в том случае, если этот спейсер присоединен к последовательности эпитопа I, распознаваемой иммунной системой приматов, в результате чего последовательность эпитопа II будет находиться у карбокси-конца рекомбинантного белка. Другие варианты осуществления изобретения включают множество пептидов эпитопа I вышеуказанных формул, присоединенных друг к другу и к белку-носителю.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к синтетической молекуле, например к вектору, содержащему вышеописанный синтетический ген, функционально присоединенный к регуляторным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые направляют и регулируют экспрессию продукта синтетического гена в клетке-хозяине.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму, например к вирусу или бактерии-комменсалу, которые содержат вышеописанный синтетический ген или синтетическую молекулу. Указанный микроорганизм способен экспрессировать в хозяине множество копий продукта указанного гена или указанной молекулы.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, используемой для индукции выработки антител, которые реагируют с большим числом известных белков Tat ВИЧ-1, например, с более чем 95%, а предпочтительно, с более чем 99% известных белков Tat. Эти индуцированные антитела могут ингибировать размножение ВИЧ-1. Указанная фармацевтическая композиция включает, по крайней мере, одну из композиций, содержащих рекомбинантные или синтетические пептиды/полипептиды, описанные выше; или синтетический ген/синтетическую молекулу, описанные выше; или рекомбинантный микроорганизм, описанный выше, в фармацевтически приемлемом носителе.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая может быть использована для ингибирования размножения ВИЧ-1, где указанная композиция содержит вышеописанную композицию антител или композицию моноклональных антител.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения уровней вируса ВИЧ-1, предусматривающему введение человеку или другому примату антитело-индуцирующих фармацевтических композиций, описанных выше и активно индуцирующих выработку антител, которые реагируют с большинством белков Tat ВИЧ-1, и ингибирующих размножения указанного вируса in vivo. Этот способ может быть применен к ВИЧ-1-инфицированному индивидууму с компетентной иммунной системой или к неинфицированному или хронически инфицированному индивидууму, но не имеющему симптомов заболевания. Указанный способ позволяет индуцировать выработку антител, которые реагируют с белками Tat ВИЧ-1 и уменьшают размножение вируса во время любого начального острого заражения вирусом ВИЧ-1 и которые, кроме того, минимизируют хроническую виремию, приводящую к СПИДу.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения уровней вируса ВИЧ-1 путем введения фармацевтической композиции, содержащей вышеописанные композиции антител, человеку, не способному вырабатывать эффективный или быстрый иммунный ответ на ВИЧ-1-инфекцию. Этот способ может предусматривать постоянное введение указанной композиции.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способам продуцирования композиций, описанных выше, а также к клеткам-хозяевам, трансфецированным указанными композициями.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к набору для измерения и детекции титров и специфичностей антител, индуцированных путем иммунизации композициями, описанными выше. Набор настоящего изобретения, предпочтительно, включает два необходимых пептида эпитопа I, описанных выше, а также дополнительные пептиды эпитопа I, распознаваемые иммунной системой приматов, и возможно дополнительные пептиды эпитопов II-IV, и сенсибилизированные твердые носители, меченый реагент для детекции связывания антител с этими пептидами, разнообразные субстраты и устройство для стимуляции или детекции сигналов, вырабатываемых метками, а также стандартное устройство для взятия проб крови, соответствующие сосуды и другие компоненты диагностического анализа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции титров и оценки картины реактивности антител у индивидуумов, иммунизованных композициями настоящего изобретения. Указанный способ включает стадии инкубирования разведений биологической жидкости индивидуума, например, сыворотки, с плоскостями или сферами, на которых связываются один или несколько пептидов последовательностей эпитопа I настоящего изобретения, и необязательно эпитопов II-IV, отмывки несвязанных биологических материалов, и измерения уровня связывания любого антитела с пептидами с использованием меченого реагента, например античеловеческого иммуноглобулина, с которым ассоциируется данный фермент. В зависимости от типа используемой метки сигнал, продуцируемый этой меткой, может быть индуцирован путем последующего добавления субстрата, который реагирует с данным ферментом, например может быть индуцировано изменение окраски. В этот аналитический набор могут быть также введены и другие стандартные метки.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения представлены ниже в более подробном описании предпочтительных вариантов его осуществления.

Краткое описание графического материала

На фиг.1А представлен график ELISA-титров кроличьей антисыворотки против более крупных линейных пептидов эпитопа I на усеченных детекторных пептидах, где указанные титры выражены как процент максимального связывания с более крупными пептидами. N- или С-концевые аминокислоты соответствующих детекторных пептидов указаны ниже каждого столбца однобуквенным кодом.

На фиг.1В представлен график ELISA-титров антисыворотки приматов против более крупных линейных пептидов эпитопа I на усеченных детекторных пептидах, где указанные титры выражены как процент максимального связывания с более крупными пептидами. N- или С-концевые аминокислоты соответствующих детекторных пептидов указаны ниже каждого столбца однобуквенным кодом.

На фиг.2А представлен график ELISA-титров кроличьей антисыворотки против линейных пептидов эпитопа II на усеченных детекторных пептидах, где указанные титры выражены как процент максимального связывания с более крупными пептидами. N- или С-концевые аминокислоты соответствующих детекторных пептидов указаны ниже каждого столбца однобуквенным кодом.

На фиг.2В представлен график ELISA-титров антисыворотки приматов против линейных пептидов эпитопа II на усеченных детекторных пептидах, где указанные титры выражены как процент максимального связывания с более крупными пептидами. N- или С-концевые аминокислоты соответствующих детекторных пептидов указаны ниже каждого столбца однобуквенным кодом.

На фиг.3А проиллюстрировано конструирование пятивалентной иммуногенной конструкции эпитоп I/эпитоп II. Tat ВИЧ-1, где аминокислоты обозначены трехбуквенным кодом [SEQ ID NO: 12].

На фиг.3В проиллюстрировано конструирование восьмивалентного универсального эпитопа I, где аминокислоты обозначены трехбуквенным кодом [SEQ ID NO: 13].

На фиг.3С проиллюстрировано конструирование иммуногенной одновалентной универсальной конструкции эпитопа II, где аминокислоты обозначены трехбуквенным кодом [SEQ ID NO:14].

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к решению вышеуказанной проблемы путем получения дополнительных композиций, которые индуцируют выработку антител у неинфицированных индивидуумов или индивидуумов с ранней стадией ВИЧ-1-инфекции, которые еще способны вырабатывать иммунный ответ на иммуноген, причем указанные антитела реагируют с большим числом (то есть более чем с 95%, а предпочтительно более чем с 99%) известных вариантов белка Tat ВИЧ-1. Термин «вариант последовательности (или белка) Tat» означает полипептид или пептид, содержащий аминокислотные остатки белка Tat или последовательность другого белка Tat штамма ВИЧ-1, которая, в основном, сходна с консенсусной последовательностью, представленной в таблице I [SEQ ID NO: 15]. Каждый вариант может отличаться от консенсусной последовательности и/или от другого варианта, по крайней мере, одной аминокислотной заменой в остатках, которые являются важными для эпитопов I-IV. При введении в данную композицию настоящего изобретения эта замена может давать ту же самую или другую антигенную специфичность для конкретного эпитопа Tat.

Антитела, индуцированные композициями настоящего изобретения, могут ингибировать размножение ВИЧ-1, и, тем самым, предупреждать последующее развитие болезни в СПИД. Антитело-содержащие композиции также предназначены для введения инфицированным или неинфицированным индивидуумам, которые не способны вырабатывать эффективный или быстрый иммунный ответ на ВИЧ-1-инфекцию. Эти композиции обладают способностью реагировать с большим числом белков Tat, что, тем самым, приводит к снижению уровней вируса ВИЧ-1. Эти антитела могут быть использованы как в терапевтических, так и в профилактических целях для предупреждения развития СПИДа у большого числа людей, контактировавших со штаммами ВИЧ-1 или инфицированных штаммами ВИЧ-1, которые после инфицирования клетки продуцируют иммунологически отличающиеся белки Tat.

Композиции настоящего изобретения включают пептиды или белки, состоящие из пептидов, составляющих эпитоп белка Tat ВИЧ-1, против которых у приматов вырабатываются антитела, или последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют пептиды и полипептиды, индуцирующие выработку у приматов антител против Tat. Эти индуцированные антитела, в свою очередь, ингибируют размножение ВИЧ-1.

Белок Tat ВИЧ-1 продуцируется из двух экзонов: экзона 1, кодирующего белок из 72 аминокислот (АА), который может экспрессироваться без сплайсинга или который может быть сплайсирован с приблизительно 15-32 аминокислотами, кодируемыми экзоном 2. Последовательность экзона I Tat ВИЧ-1 показана в таблице I и представляет собой консенсусную последовательность на основе последовательностей белка Tat от 31 известных штаммов ВИЧ-1, объединенных в общий подтип В [база данных NIH Los Alamos]. Положения аминокислот, в которых имеются вариации, обозначены строчными буквами. В таблице I [SEQ ID NO: 15] аминокислотный остаток в положении 73 представляет собой первый Pro экзона 2 Tat ВИЧ-1. Поскольку продукт экзона I из 72 аминокислот сам по себе может поглощаться клеткой и активировать, то важно, чтобы антитела реагировали с указанным пептидом из 72 аминокислот и тем самым предотвращали межклеточный транспорт этого пептида. Tat ВИЧ-1 содержит богатую цистеином область между положениями аминокислот 22 и 37 экзона I [SEQ ID NO: 15] с одной ковалентной связью между Cys₂₁ и Cys₃₇, образуя, тем самым, сложную третичную структуру. В научной литературе указывается, что эта область, очевидно, не является иммуногеннной. Преобладающие антитела против Tat представляют собой антитела к линейной N-концевой Pro-богатой области (АА1-21) и к линейной основной области (АА44-65), при этом сообщалось о дополнительном антителе против области АА62-73.

Авторы настоящего изобретения ранее идентифицировали эпитопы, то есть области связывания, распознаваемые кроличьими антителами (антигенные последовательности) в N-концевой линейной последовательности 1-21 (22 АА) экзона I [SEQ ID NO: 15] вариантов Tat, и определили четыре В-клеточных эпитопа в Tat ВИЧ-1. Как было ранее описано в публикации Международной патентной заявки № WO 99/02185, иммуногенные области этой более крупной последовательности распознавались иммунной системой кроликов. Эти области были идентифицированы в консенсусной последовательности экзона 1 в таблице I, представленной ниже. Эпитоп I был идентифицирован кроличьими антителами как последовательность из девяти аминокислот в положениях 2-10 экзона 1. Эпитоп II был идентифицирован как последовательность из восьми аминокислот в положениях 43-50 экзона 1. Эпитоп III был идентифицирован как последовательность из 7 аминокислот в положениях 56-62 экзона 1. Эпитоп IV был идентифицирован как последовательность из двенадцати аминокислот в положениях 62-73 Tat, включающая первый Pro (АА73) экзона 2 и перекрывающаяся с Ser62 эпитопа III.

Однако автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил сдвиг в аминокислотных последовательностях, в частности эпитопа I, распознаваемого В-клетками приматов. В таблице I последовательности эпитопов I и II, распознаваемые клетками приматов, подчеркнуты. Распознаваемый клетками приматов эпитоп I охватывает аминокислотные остатки 5-12 Tat. Последовательность эпитопа II, распознаваемого В-клетками приматов, охватывает аминокислоты 41-50. Эпитопы III и IV являются теми же эпитопами, которые распознаются иммунной системой кроликов и которые описаны в работе WO99/02185, вводимой в настоящее описание посредством ссылки.

А. Иммуногенные композиции, содержащие эпитоп I, распознаваемый иммунной системой приматов

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей, по крайней мере, два варианта пептида или полипептида, распознаваемых иммунной системой приматов и стимулирующих специфический гуморальный иммунный ответ (соответствующий целям настоящего изобретения) у приматов, подвергнутых воздействию in vivo указанными последовательностями. Эти распознаваемые иммунной системой приматов аминокислотные последовательности эпитопа I соответствуют аминокислотным остаткам 5-12 консенсусной последовательности Tat [SEQ ID NO: 15], указанной в таблице I, происходящей от ряда «вариантов последовательности Tat». Распознаваемый иммунной системой приматов эпитоп I определяет пептиды общей формулы R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉ -Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NO: 8], где Y₇ представляет собой Arg, Lys, Ser или Asn; Х₉ представляет собой Glu или Asp, а Z₁₂ представляет собой Lys или Asn. Эта формула позволяет определить множество вариантных пептидов эпитопа I млекопитающих. Композиция настоящего изобретения должна содержать, по крайней мере, один пептидный вариант, где Y ₇ представляет собой Arg, а Z₁₂ представляет собой Lys, и по крайней мере, второй пептидный вариант, где Y ₇ представляет собой Asn и Z₁₂ представляет собой Asn.

Конкретно определенные аминокислоты, присутствующие в формуле эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов и описанного выше, представляют собой минимальную реактивную последовательность эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов. Каждый иммуноген, определенной указанной формулой и используемый в способах настоящего изобретения для выработки антител против минимальной последовательности эпитопа I, может представлять собой более крупную аминокислотную последовательность. Так, например, минимальная аминокислотная последовательность эпитопа I фланкируется другими аминокислотными последовательностями, так, что вся иммуногенная последовательность эпитопа I имеет длину примерно от 8 до 25 аминокислот. Тип фланкирующих аминокислот не играет важной роли в биологической функции иммуногена эпитопа I. В частности, дополнительные аминокислоты на N-конце последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, не влияют на иммуногенность. Таким образом, для каждого пептида эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, N-концевым R1 может быть свободный водород на немодифицированной N-концевой аминокислоте или низшая алкильная (то есть С1-С10-алкильная) или низшая С1-С10-алканоильная группа, такая как ацетильная группа. R1 может также включать последовательность примерно от 1 до приблизительно 5 аминокислот, необязательно замещенную низшим алкилом или низшим алканоилом. Предпочтительно, R1 представляет собой 2 аминокислоты. В одном из вариантов осуществления изобретения R1 представляет собой Val, в результате чего образуется последовательность Val-Asp-Pro-Y ₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z₁₂ [SEQ ID NO: 37], где Y₇, Х₉ и Z₁₂ определены выше. В другом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Х₂-Pro-Val-, в результате чего образуется последовательность Х₂-Pro-Val-Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉ -Pro-Trp-Z₁₂ [SEQ ID NO: 38], где Х₂ представляет собой Glu или Asp и где Y₇, Х₉ и Z ₁₂ определены выше. Предпочтительно, R1 представляет собой 3 аминокислоты.

Дополнительные аминокислоты на С-конце минимальной последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, могут повышать титр антитела. Хотя С-концевой R2 может представлять собой простую свободную гидроксильную группу на С-концевой аминокислоте, однако, он может также представлять собой С-концевой амид. Однако для повышения титра R2 предпочтительно представляет собой последовательность примерно от 1 до 14, а предпочтительно примерно 4 дополнительные аминокислоты, амидированные у карбокси-конца. В предпочтительном варианте осуществления изобретения R2 представляет His-Pro-Gly-Ser-амид, в результате чего образуется последовательность Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z ₁₂-His-Pro-Gly-Ser [SEQ ID NO: 16], где Y₇, Х₉ и Z₁₂ определены выше.

Предпочтительно, композиция настоящего изобретения, помимо двух нужных пептидов, идентифицированных выше, включает, по крайней мере, пять или шесть других аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов. Более предпочтительно, указанная композиция включает семь или восемь вариантных аминокислотных последовательностей, идентифицированных непосредственно ниже. Эта композиция может также содержать другие пептидные или полипептидные последовательности, каждая из которых включает различные комбинации Х₉, Y₇ и Z₁₂. Как продемонстрировано в нижепривиденных примерах, где описан распознаваемый иммунной системой приматов эпитоп I с тремя сайтами антигенной вариабельности, предпочтительная композиция настоящего изобретения может включать достаточное число пептидов эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, так что эта композиция содержит 95% от всех известных вариантов В-кладотипа и не-В-кладотипа Tat ВИЧ-1 благодаря включению двух «необходимых» пептидов:

R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 17] и

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 18],

а также один из пяти следующих дополнительных пептидов эпитопа I:

R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 19],

R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 20],

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 21],

R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 22] и

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO:23],

а также необязательно редкий вариант

R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 24].

Композиция эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, может включать ряд дополнительных пептидов или полипептидов, которые содержат другие последовательности, соответствующие аминокислотным остаткам АА5-АА12 SEQ ID NO: 15, но происходящим от других вариантов Tat, которые не способны перекрестно реагировать с антителами против композиций эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов. Композиции эпитопа I настоящего изобретения могут содержать множество копий пяти или нескольких различных пептидов эпитопа I в любом порядке. В одном из вариантов осуществления изобретения в композиции присутствует, по крайней мере, одна копия семи или всех восьми аминокислотных последовательностей, описанных выше [SEQ ID NO: 17-24].

Указанные пептиды или полипептиды настоящего изобретения продуцируют синтетическими или рекомбинантнымм способами. Для связывания этих пептидов между собой или с носителем в концы этих пептидов могут быть включены необязательные аминокислоты (например, -Gly-Ser-) или другие аминокислоты или химические соединения - спейсеры. Эта композиция может иметь форму, состоящую из одного или нескольких вышеописанных пептидов, экспрессируемых в виде синтетического пептида, присоединенного к белку-носителю. Альтернативно, композиция может содержать множество пептидов эпитопа I, каждый из которых экспрессируется в виде множественного антигенного пептида, необязательно присоединенного к белку-носителю. Альтернативно, отобранные пептиды могут быть последовательно присоединены и экспрессированы в рекомбинантно продуцированном белке. В одном из вариантов осуществления изобретения восемь последовательностей, конкретно идентифицированных выше, последовательно соединены друг с другом непосредственно или через спейсерные аминокислоты с образованием более крупного рекомбинантного белка. Альтернативно, рекомбинантный белок может быть слит с сохранением рамки считывания с белком-носителем. Такие композиции эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, предназначены для индукции выработки антител, реагирующих более чем с 95% известных вариантов белка Tat ВИЧ-1, включая белки Tat ВИЧ-1 В- и не-В-кладотипов.

Композиции эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, обнаруживают биологическую активность, направленную на индуцирование у иммунизованного иммунокомпетентного примата, то есть неинфицированного человека или у инфицированного человека без симптомов заболевания, активного гуморального иммунного ответа (то есть вырабатывания антител), который направлен против более чем 95%, а предпочтительно более чем 99% известных вариантов белков Tat ВИЧ-1. Конечным результатом такого лечения является ингибирование размножения ВИЧ-1 после острого инфицирования. Такое ингибирование предотвращает высокие уровни ВИЧ-1 в плазме после сероконверсии, ассоциированные с развитием СПИДа. Активное индуцирование выработки антител в асимптотической фазе ВИЧ-инфекции может приводить к снижению размножения вируса, к снижению вирусной нагрузки в плазме и к снижению вероятности развития СПИДа. Композиция, которая содержит, по крайней мере, два необходимых иммуногена эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, а предпочтительно семь или восемь последовательностей эпитопа I [например, SEQ ID NO: 17-24], может стимулировать иммунный ответ примерно на 95% из 294 известных последовательностей Tat общих В-подтипов ВИЧ-1 и на белки Tat для всех 56 не-В-подтипов ВИЧ-1, которые были секвенированы [с разрешения Dr. Esther Guzman, база данных NIAID HIV Los Alamos, база данных Genbank].

В. Иммуногенные композиции, содержащие дополнительные эпитопы

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к другим композициям, в которых используются две или несколько последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, объединенных, по крайней мере, с одной последовательностью эпитопа II и, необязательно, с одним или несколькими пептидами эпитопа III или IV. Эти эпитопы II, III и IV Tat ВИЧ-1, распознаваемые иммунной системой кролика, подробно описаны в Международной патентной заявке №WO99/02185, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Вкратце, последовательность эпитопа II стимулирует специфический гуморальный иммунный ответ у примата, подвергнутого воздействию in vivo последовательностью эпитопа II. Эпитоп II, распознаваемый иммунной системой приматов, определяет пептиды формулы R3-Lys-Х ₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID NO: 5], где Х₄₂ представляет собой Gly или Ala. Минимальным эпитопом, распознаваемым иммунной системой приматов, является эпитоп с конкретно идентифицированными аминокислотами этой формулы, т.е. -Lys-Gly-Leu-Gly-IIe-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- (аминокислоты 41-50 SEQ ID NO: 15). Эта последовательность также представляет собой последовательность предпочтительного иммуногена настоящего изобретения для эпитопа II. Иммуноген, в котором Х₄₂ представляет собой Gly, индуцирует выработку антител, перекрестно-реагирующих с последовательностью, в которой Х₄₂ представляет собой Ala. Эта последовательность должна реагировать/перекрестно реагировать более чем с 95% известных белков Tat ВИЧ-1. Последовательность эпитопа II не имеет антигенной вариабельности у большого числа известных вариантов Tat ВИЧ-1. N-концевой R3 может представлять собой водород на немодифицированной N-концевой аминокислоте Lys, либо R3 может представлять собой низшую алкильную или низшую алканоильную группу, такую как ацетильная группа, которая является заместителем на Lys. R3 может также представлять последовательность примерно из 1-5 аминокислот, необязательно замещенную низшим алкилом или низшим алканоилом. С-концевой R4 может представлять собой свободный гидроксил на С-концевой аминокислоте, либо R4 может представлять собой амид на этой С-концевой аминокислоте. R4 может включать дополнительные неполярные аминокислоты, такие как спейсер. Может быть использован иллюстративный спейсер gly-ser-gly-ser с получением последовательности -Lys-Х₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser [SEQ ID NO: 25], где Х₄₂ представляет собой Gly или Ala. Однако R4 не может представлять последовательность из основных аминокислот -Lys-Arg-Arg, которые обычно присутствуют в последовательности Tat после последней аминокислоты в формуле эпитопа II. Эта последовательность эпитопа II, обнаруженная в 294 вариантах Tat В-кладотипа, распознается иммунной системой приматов (как сообщалось в WO 99/02185, иммунная система кроликов распознает эпитоп из аминокислот 43-50 SEQ ID NO: 15).

Эпитоп II, если он присутствует в других последовательностях, обладает слабой иммуногенностью. Таким образом, для обеспечения оптимальной иммуногенности эту последовательность получают в виде синтетического пептида, слитого с белком-носителем или присоединенного к нему, либо в виде множественного антигенного пептида, необязательно присоединенного к белку-носителю. Альтернативно, эпитоп II может быть экспрессирован в виде С-концевой последовательности рекомбинантного белка, который необязательно присоединен в той же рамке считывания к белку-носителю у его амино-концевой последовательности. В композиции настоящего изобретения пептид эпитопа II присутствует предпочтительно отдельно или в комбинации с одним или несколькими пептидами эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов.

Эпитоп III, кратко описанный и идентифицированный в WO 99/02185, определяет пептиды формулы R5-Arg-Arg-Х₅₈-Z₅₉-A ₆₀-Y₆₁-Ser-R6 [SEQ ID NO: 6], где Х₅₈ может представлять собой Ala, Pro, Ser или Gln; Y₆₁ может представлять собой Asp, Asn, Gly или Ser; Z₅₉ может представлять собой Pro или His; а A₆₀ может представлять собой Gln или Pro. Эпитоп IV определяет пептиды формулы R7-Ser-Gln-Х₆₄-His-Gln-Y₆₇-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID NO: 7], где Х₆₄ может представлять собой Asn или Thr; а Y₆₇ может представлять собой Ala или Val.

Таким образом, композиции настоящего изобретения, то есть пептиды/полипетиды, содержащие идентифицированные выше аминокислотные последовательности, предназначенные для введения человеку, могут быть использованы для иммунологического надзора за продуцированием внеклеточных белков Tat большинства штаммов ВИЧ-1. Действие этих композиций направлено на резкое снижение непрерывного размножения вируса и позволяет осуществлять эффективный иммунный контроль за распространением этого вируса.

Иммуногены для каждого эпитопа были сконструированы, предпочтительно, для индуцирования антител, реагирующих с большинством природных вариантов каждого эпитопа. Что касается эпитопа, такого как распознаваемый иммунной системой приматов эпитоп I, то для повышения иммуногенности и продуцирования антител с более высоким титром в синтетический или рекомбинантный иммуноген может быть включено множество копий иммуногена. Кроме того, иммуногены для двух или нескольких эпитопов могут быть объединены для расширения зоны действия, поскольку изменения в последовательности каждого эпитопа происходят независимо друг от друга. Таким образом, в качестве одного из примеров может служить композиция настоящего изобретения, которая содержит два необходимых пептида эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, а также четыре или пять других конкретно идентифицированных выше пептидов эпитопа I с Cys на конце, который связан с белком-носителем. Альтернативно, могут быть получены множественные антигенные пептиды, необязательно присоединенные к белку-носителю и объединенные вместе с получением композиции настоящего изобретения. Альтернативно, могут быть использованы смеси двух или нескольких иммуногенов.

Могут быть получены иммуногены распознаваемого иммунной системой приматов эпитопа I настоящего изобретения вместе с любым эпитопом II, III или IV или без них, или с другими необязательными иммуногенами, и эти иммуногены могут быть использованы в иммуногенных композициях в различных формах, например в виде химически синтезированных или рекомбинантных пептидов, полипептидов, белков, гибридных белков или гибридных пептидов.

1. Рекомбинантные или синтетические пептиды/белки, присоединенные к носителю

В одном из вариантов осуществления изобретения, композиция настоящего изобретения может представлять собой синтетически или рекомбинантно продуцированный пептид, содержащий, по крайней мере, две необходимые иммуногенные аминокислотные последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов (а также дополнительные другие последовательности эпитопа I), и, кроме того, содержащий одну или несколько иммуногенных аминокислотных последовательностей эпитопа II/III/IV, присоединенных к выбранному белку-носителю. В этом варианте композиции настоящего изобретения множество вышеупомянутых аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, с фланкирующими последовательностями или без них, могут быть последовательно объединены в полипептид и присоединены к тому же самому белку-носителю. Альтернативно, иммуногены эпитопа I, II, III или IV могут быть по отдельности в виде пептидов присоединены к тому же самому белку-носителю или к другим белкам-носителям, и полученные конструкции «иммуноген-носитель» смешивают вместе с образованием одной композиции. Такие последовательности могут быть получены синтетически стандартными методами химического синтеза или рекомбинантно путем экспрессии в выбранной клетке-хозяине, осуществляемой также стандартными методами.

В этом варианте осуществления изобретения белком-носителем является предпочтительно белок или другая молекула, которая может повышать иммуногенность выбранного иммуногена. Такой носитель может представлять собой более крупную молекулу, которая действует как адъювант. Примерами стандартных белков-носителей являются, но не ограничиваются ими, белок DnaK E.coli, галактокиназа (galK, которая катализирует первую стадию метаболизма галактозы в бактериях), убихитин, -фактор скрещивания, -галактозидаза и белок NS-1 гриппа. В качестве носителей могут быть также использованы токсоиды (т.е. последовательности, которые кодируют природный токсин с достаточными модификациями для элиминации его токсической активности), такие как дифтерийный токсоид и столбнячный токсоид. Аналогично, может быть использован ряд бактериальных белков теплового шока, например микобактериальный hsp-70. Другим подходящим носителем является глутатион-редуктаза (GST). Каждый специалист может легко выбрать подходящий носитель.

В конкретной необходимой конструкции «иммуноген - белок-носитель» два необходимых иммуногена эпитопа I и от трех до шести дополнительных иммуногенов эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, а также необязательные иммуногенные пептиды/полипептиды могут быть ковалентно связаны с микобактериальным белком теплового шока 70 E.coli (hsp70) [K.Suzue et al., J. Immunol.156:873 (1996)]. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную композицию получают путем ковалентного связывания иммуноген-содержащих пептидных или полипептидных последовательностей с дифтерийным токсоидом.

2. Множественный антигенный пептид

В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуногены пептидных или полипептидных эпитопов и любые выбранные необязательные иммуногены могут иметь форму конструкции множественного антигенного пептида («МАР», также называемого октамерным пептидом с лизиновой сердцевиной). Такая конструкция может быть сконструирована с использованием системы МАР, описанной Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413 (1988). Эта система позволяет использовать коровый матрикс из лизиновых остатков, на котором синтезируется множество копий того же самого распознаваемого иммунной системой приматов эпитопа I настоящего изобретения, как было описано [D. Posnett et al., J. Biol. Chem. 263(4):1719-1725 (1988); J. Tam, «Chemically Defined Synthetic Immunogenes and Vaccine by the Multiple Antigen Peptide Approach», Vaccine Research and Developments, Vol.1 ed. W. Koff & H.Six, pp. 51-87 (Marcel Deblau, Inc. New York 1992)]. Каждый МАР содержит множество копий только одного пептида. Поэтому композиция, содержащая МАР, включает, по крайней мере, два, а предпочтительно, примерно семь МАР. Один МАР имеет первый необходимый иммуноген пептидного или полипептидного эпитопа I, присоединенный к каждой лизиновой сердцевине, а второй МАР имеет второй необходимый иммуноген пептидного или полипептидного эпитопа I, присоединенный к каждой лизиновой сердцевине. Могут быть включены и другие МАР, каждый из которых имеет различные идентифицированные выше аминокислотные последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов. Множество различных МАР могут быть использованы для получения любой нужной комбинации последовательностей эпитопа I, II, III или IV. Предпочтительно, чтобы эти МАР-конструкции были ассоциированы с другими последовательностями, стимулирующими Т-клетки, либо они были изготовлены в виде фармацевтических композиций, вводимых в сочетании с агентами, стимулирующими Т-клетки, такими как известные адъюванты.

3. Спейсеры

В любой из вышеуказанных композиций, например, полученной в виде конструкций «пептид/полипептид - носитель» или МАР, каждый пептидный/полипептидный иммуноген или каждая аминокислотная последовательность в данном иммуногене может быть, но необязательно, разделена необязательной аминокислотной последовательностью, называемой «спейсером». Спейсеры представляют собой последовательности, имеющие примерно от 1 до 4 аминокислот, которые встроены между двумя последовательностями, что позволяет присоединять их, не оказывая какого-либо негативного влияния на трехмерную структуру данного иммуногена. При необходимости спейсеры могут также содержать сайты расщепления рестриктирующей эндонуклеазой для разделения этих последовательностей. Подходящие спейсеры или линкеры известны и могут быть легко сконструированы и выбраны любым специалистом. Предпочтительными спейсерами являются последовательности, содержащие аминокислоты Gly и/или Ser.

F. Композиции нуклеиновых кислот настоящего изобретения, включающие синтетически или рекомбинантно продуцированный ген

В других вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим вышеописанные композиции пептидов/полипептидов распознаваемого иммунной системой приматов эпитопа I, включающие пептидные и полипептидные иммуногены вышеописанных композиций и включающие те пептиды и полипептиды, которые были присоединены к белкам-носителям. Последовательности нуклеиновых кислот могут также включать последовательности, кодирующие белки-носители.

Таким образом, один из предпочтительных вариантов осуществления изобретения относится к «синтетическому гену», который последовательно кодирует, по крайней мере, два необходимых иммуногенных пептида или полипептида эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов. Следует отметить, что хотя этот ген и называется "синтетическим", однако, при необходимости, он может быть сконструирован методом химического синтеза или рекомбинантными методами. Этот синтетический ген, предпочтительно, кодирует семь или все восемь конкретно идентифицированных аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов [SEQ ID NO: 17-24]. Указанный синтетический ген может также кодировать любой выбранный иммуноген эпитопа II или III при условии, что пептид эпитопа II или III присоединен к С-концу последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, и не является дополнительно модифицированным на своем С-конце. Указанный синтетический ген может кодировать множество копий двух необходимых аминокислотных последовательностей эпитопа I или копии дополнительных многих других иммуногенов или аминокислотных последовательностей или множество копий многих других иммуногенов или аминокислотных последовательностей. Указанный синтетический ген может кодировать выбранные аминокислотные последовательности в одной рамке считывания или, являясь слитым, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-носитель. Другая особенность синтетического гена заключается в том, что он кодирует спейсер, расположенный между каждой из последовательностей, кодирующей иммуноген, и/или между последовательностью, кодирующей иммуноген, и последовательностью, кодирующей белок-носитель.

Указанный синтетический ген настоящего изобретения может быть также частью синтетической или рекомбинантной молекулы. Указанной синтетической молекулой может быть конструкция нуклеиновой кислоты, такая как вектор или плазмида, которые содержат синтетический ген, кодирующий белок, пептид, полипептид, гибридный белок или гибридный пептид, и находящийся под функциональным контролем последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей регуляторные элементы, такие как промоторы, сигналы терминации и т.п. Такие синтетические молекулы могут быть использованы для рекомбинантного продуцирования иммуногенных полипетидных/пептидных композиций. Указанные синтетический ген или синтетическая молекула могут быть получены методами химического синтеза или рекомбинантными методами. Так, например, указанный синтетический ген или молекула могут содержать определенные предпочтительные кодоны для определенного вида указанной клетки-хозяина.

Синтетический ген или молекула, предпочтительно, в форме ДНК могут быть использованы в ряде способов. Так, например, эти синтетические последовательности нуклеиновой кислоты могут быть использованы для экспрессии пептидов/полипептидов настоящего изобретения in vitro в культуре клетки-хозяина. Экспрессированные иммуногены после подходящей очистки могут быть затем включены в фармацевтический реагент или вакцину. Альтернативно, синтетический ген или синтетическая молекула настоящего изобретения могут быть введены непосредственно млекопитающему, а предпочтительно человеку, в виде так называемой «голой ДНК» для in vivo-экспрессии белкового/пептидного иммуногена у пациента. См. например, работы J. Cohen, Science, 259:1691-1692 (March 19, 1993) и E. Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11478-11842 (Dec. 1993) и J.A. Wolff et al., Biotechniques, 11:474-485 (1991), каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Указанная синтетическая молекула, например вектор или плазмида, могут быть введены непосредственно млекопитающему-хозяину. Это приведет к экспрессии белка клетками-хозяевами и к последующей его презентации иммунной системе для индуцирования образования антител in vivo.

G. Микроорганизмы, экспрессирующие указанный синтетический ген

В другом аспекте настоящего изобретения указанные синтетические гены или молекулы настоящего изобретения могут быть включены в непатогенный микроорганизм. Полученный микроорганизм при его введении млекопитающему-хозяину экспрессирует и умножает in vivo экспрессированные композиции настоящего изобретения для индуцирования образования специфических антител. Так, например, непатогенные рекомбинантные вирусы или бактерия-комменсал, которые несут композиции или синтетические гены настоящего изобретения и которые могут быть использованы для введения пациенту-млекопитающему, могут быть получены с использованием стандартной методики и отобраны из известных непатогенных микроорганизмов.

Бактериями-комменсалами, которые могут быть использованы для экзогенной доставки синтетической молекулы пациенту и/или для введения синтетического гена пациенту in vivo, являются, но не ограничиваются ими, различные штаммы Streptococcus, например S. gordonii, или E.coli, Bacillus, Streptomyces и Saccharomyces.

Подходящими непатогенными вирусами, которые могут быть сконструированы так, чтобы они доставляли синтетический ген в клетки данного хозяина, являются поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы, аденовирус, адено-ассоциированные вирусы, вирусы оспы канареек, ретровирусы и т.п. Ряд таких непатогенных вирусов обычно используются для генной терапии человека, а также в качестве носителей для других вакцинных агентов и являются известными и могут быть выбраны любым специалистом.

Н. Получение или изготовление композиций настоящего изобретения

Композиции настоящего изобретения и отдельные полипептиды/пептиды, содержащие иммуногены распознаваемого иммунной системой приматов эпитопа I настоящего изобретения и необязательно один или несколько эпитопов II, III или IV, синтетические гены и синтетические молекулы настоящего изобретения могут быть получены стандартными способами в соответствии с известными методами химического синтеза, такими как описанные Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). Альтернативно, композиции настоящего изобретения могут быть получены известными методами рекомбинантных ДНК путем клонирования и экспрессии в микроорганизме-хозяине или в клетке ДНК-фрагмента, несущего последовательность, кодирующую пептид/полипетид, содержащий, по крайней мере, две необходимые последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, необязательно вместе с другими иммуногенами и необязательно вместе с белками-носителями. Кодирующие последовательности для эпитопа I и необязательных иммуногенов могут быть получены методом синтеза [W.P.C. Stemmer et al., Gene, 164:49 (1995)], либо они могут быть получены из вирусной РНК известными методами, либо они могут быть получены из имеющихся кДНК-содержащих плазмид.

Могут быть использованы комбинации этих методов. Так, например, для продуцирования синтетического гена может быть осуществлена сборка следующих друг за другом иммуногенов стандартными методами молекулярной биологии, и сайт-направленный мутагенез может быть использован для получения нужных последовательностей иммуногенов. Затем осуществляют рекомбинантное продуцирование продукта синтетического гена. Все эти манипуляции могут быть осуществлены стандартными методами.

Системы клонирования и экспрессии пептидных/полипептидных композиций настоящего изобретения с использованием синтетических генов или молекул включают использование различных микроорганизмов и клеток, хорошо известных в технике рекомбинантных ДНК. Такими микроорганизмами являются, например, различные штаммы E.coli, Bacillus, Streptomyces и Saccharomyces, а также клетки млекопитающих, дрожжей и насекомых. Подходящие векторы для них известны специалистам и могут быть получены из частных и государственных лабораторий и депозитариев или у коммерческих поставщиков. В настоящее время наиболее предпочтительными хозяевами являются клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки COS-1. Эти хозяева могут быть использованы в сочетании с векторами на основе поксвирусов, таких как вирус коровьей оспы или вирус оспы свиней. Выбор других подходящих клеток-хозяев и способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и выделения и очистки продукта может быть осуществлен любым специалистом в соответствии с известной техникой. См., например, Gething & Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981) и т.п. Другой предпочтительной системой являются бакуловирусные системы экспрессии и векторы.

При продуцировании стандартными рекомбинантными методами композиции настоящего изобретения, то есть полипептиды/петиды, содержащие указанные копии иммуногенов эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, и необязательные иммуногены, могут быть выделены либо из клеточного содержимого стандартным методом лизиса, либо из клеточной среды стандартными методами, таким как хроматография. См. например, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2d Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989). Подходящие плазмидные и вирусные векторы, используемые для продуцирования пептидных/полипетидных компонентов в виде ДНК-вакцин, хорошо известны специалистам и не ограничивают объема изобретения. См., руководство Sambrook et al., цитируемое выше, и вышеуказанные работы, в которых описано продуцирование белка. См., также Международную патентную заявку РСТ WO 94/01139, опубликованную 20 января 1994. Вкратце, ДНК, кодирующую выбранный пептид/полипептид, встраивают в вектор или плазмиду, которые содержат другие необязательные фланкирующие последовательности, промотор, лидерную последовательность мРНК, сайт инициации транскрипции и другие регуляторные последовательности, способные регулировать размножение и экспрессию указанной последовательности in vivo и in vitro. Указанные векторы инфицируют клетки пациента и обеспечивают экспрессию последовательности синтетического гена in vivo или его экспрессию in vitro в виде белка/пептида или гибридного белка/пептида.

Полученная композиция может быть введена в композицию эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, вместе с любым числом необязательных иммуногенов и скринирована на ее эффективность с помощью in vivo-анализа. Такие анализы предусматривают иммунизацию животного, например обезьяны, данной композицией и оценку титров антител против белков Tat ВИЧ-1 или против синтетических детекторных пептидов, соответствующих вариантам последовательностей Tat (как показано в нижеприведенных примерах).

I. Антитело-содержащие композиции настоящего изобретения

Антитело-содержащая композиция или связывающаяся с лигандом композиция настоящего изобретения включает, по крайней мере, одно антитело, которое специфически связывается с эпитопом I формулы -Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z ₁₂- [SEQ ID NO: 9], где Y₇ выбран из группы, состоящей из Arg, Lys, Ser и Asn; Х₉ выбран из группы, состоящей из Glu и Asp; а Z₁₂ выбран из группы, состоящей из Lys и Asn. Такая антитело-содержащая композиция, предпочтительно, включает, по крайней мере, два или более различных антител или лигандов, которые специфически связываются, по крайней мере, с двумя определенными здесь необходимыми последовательностями эпитопа I. При этом вырабатываются антитела (или другие связывающиеся лиганды) против двух необходимых последовательностей R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 17] и R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 18] эпитопа I. Таким образом, антитела данной композиции связываются с белком Tat ВИЧ, присутствующим на множестве вариантов белков Tat ВИЧ-1. Другие антитела или лиганды вырабатываются против других последовательностей, охватываемых вышеуказанными формулами эпитопа I.

В одном из вариантов изобретения, выделенное антитело, которое связывается с пептидом или полипептидом эпитопа I настоящего изобретения, описанного выше, также является аспектом настоящего изобретения. Такие композиции, содержащие поликлональное антитело, обычно продуцируют путем иммунизации млекопитающего, а предпочтительно примата, пептидной/полипетидной композицией, содержащей два необходимых иммуногена эпитопа I, а также набор других иммуногенов эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, и необязательные иммуногены, описанные выше. В качестве иммуногенов особенно предпочтительными являются семивалентный иммуноген эпитопа I, распознаваемый иммунной системой приматов (то есть без редкого варианта) или восьмивалентный иммуноген, такой как синтетический ген или гибридный белок, описанный ниже в примере 3, и/или одновалентный иммуноген эпитопа II (то есть единственный пептид эпитопа II, необязательно связанный с носителем). Помимо антител, вырабатываемых у приматов, такие антитела могут быть также продуцированы у трансгенных животных, включая так называемую «очеловеченную» трансгенную мышь. Однако желательным хозяином для выработки поликлональных антител против композиции настоящего изобретения является человек. Мониторинг титров таких поликлональных антител, вырабатываемых у млекопитающего в ответ на введение композиции эпитопа I, может быть осуществлен стандартными методами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ. По желанию молекулы антител могут быть выделены у млекопитающего, например, из цельной крови, плазмы или сыворотки, а затем они могут быть очищены из плазмы или сыворотки иммунизованного млекопитающего стандартными методами. Стандартными методами сбора могут быть плазмаферез, хроматография на белке А и т.п. Композиции таких поликлональных антител могут быть сами использованы в качестве фармацевтических композиций настоящего изобретения.

Альтернативно, клетки, продуцирующие антитело, могут быть получены от млекопитающих и использованы для получения других форм антител и лигандов, например моноклональных антител, химерных антител, «очеловеченных» антител, человеческих антител, лигандов, продуцируемых путем скрининга фагового дисплея, фрагментов антител и их смесей, и синтетических антител, моноклональных антител, химерных антител, «очеловеченных» антител и полностью человеческих антител. Препаративные методы генерирования лигандов этих типов известны специалистам, и сами лиганды могут быть генерированы с использованием описанных аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемых иммунной системой приматов, и необязательных иммуногенов. См., например, Kohler & Milstein (1975) Nature, 256:495-497; Kozbor et al. (1983) Immunol. Today, 4:72; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96; Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 (1989); Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991); Международную заявку РСТ/GB91/01554, публикацию № WO 92/04381 и Международную заявку РСТ/GB93/00725, публикацию № WO 93/20210].

Так, например, в другом варианте осуществления изобретения, моноклональное антитело специфически связывается с минимальной последовательностью эпитопа I, определенной как -Asp-Pro-Y₇-Leu-Х₉-Pro-Trp-Z₁₂ - [SEQ ID NO: 9] белка Tat ВИЧ-1, содержащего любой более крупный иммуноген, определенный формулой эпитопа I, где вариабельные аминокислоты и группы R определены выше. В одном из вариантов осуществления изобретения, моноклональное антитело специфически связывается с аминокислотной последовательностью -Asp-Pro-Asn-Leu-Х ₉-Pro- Trp-Asn- [SEQ ID NO: 26], где Х₉ представляет Glu или Asp. Другие моноклональные антитела, которые специфически связываются с минимальными последовательностями эпитопа I, определенными вышеуказанными формулами, являются частью настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления изобретения моноклональное антитело специфически связывается с минимальной последовательностью эпитопа II, содержащей аминокислотную последовательность -Lys-Х ₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SEQ ID NO: 10], где Х₄₂ представляет собой Gly или Ala и где указанный эпитоп отличается от эпитопа -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SEQ ID NO: 11], распознаваемого описанными ранее антителами. Предпочтительно, антитело-содержащая композиция включает одно антитело, которое перекрестно реагирует с пептидом, где Х ₄₂ представляет собой Gly, и с пептидом, где Х₄₂ представляет собой Ala. Эти антитела предпочтительно вырабатываются у приматов. Другие моноклональные антитела, которые специфически связываются с минимальными последовательностями эпитопа II, определенными вышеуказанной формулой, также являются частью настоящего изобретения.

Другие антитела против Tat могут быть получены путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, фагового дисплея антител) с использованием распознаваемых иммунной системой приматов эпитопов Tat ВИЧ-1 настоящего изобретения, для выделения членов библиотеки иммуноглобулинов, которые связываются с Tat ВИЧ-1 [W.D. Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1988)]. Наборы для генерирования и скрининга библиотек фагового дисплея являются коммерчески доступными, например, в Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog №27-9400-01; Stratagene Phage Display kits, и т.п. См., например, патент США №5223409, публикации международных заявок № WO 92/09690, WO 90/02809 и т.п. Химерные антитела могут быть аналогичным образом получены известными методами [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851; Takeda et al., Nature, 313:452 (1984) и т.п.]. Химерные антитела представляют собой молекулы, у которых различные части происходят от различных видов животных. Одноцепочечные антитела могут быть также получены стандартными методами [см. патент США №4946778 и 4704692] с использованием вариабельных частей поликлональных или моноклональных антител, продуцированных в соответствии с настоящим изобретением. Фрагменты антител, такие как фрагменты Fab, F(ab')₂ и Fv и их библиотеки могут быть также использованы в различных аспектах настоящего изобретения.

Эти антитело/лиганд-содержащие композиции предпочтительно связываются с большинством известных вариантов белка Tat ВИЧ-1 (например, более чем с 95%, а предпочтительно более чем с 99% известных вариантов белка Tat) и предотвращают дальнейшее размножение ВИЧ-1, которое обеспечивается белками Tat. Такие композиции могут включать смесь множества различных антител, которые связываются с последовательностями эпитопа белка Tat ВИЧ-1, происходящими от множества штаммов ВИЧ-1. Таким образом, эти антитела могут быть использованы в фармацевтических методах и препаратах, описанных ниже.

J. Фармацевтические композиции настоящего изобретения

В другом аспекте настоящего изобретения фармацевтическая композиция, используемая для выработки антител, реагирующих с большинством (например, более чем с 95%, а предпочтительно более чем с 99%) известных белков Tat ВИЧ-1 и ингибирующих размножение ВИЧ-1, может содержать в качестве активных агентов, по крайней мере, два необходимых пептида или полипептида распознаваемого приматами эпитопа I настоящего изобретения и, предпочтительно, дополнительные пептиды эпитопа I. Некоторые предпочтительные композиции включают нижеследующие вышеописанные компоненты:

(а) пептидный/полипептидный иммуноген, который содержит, по крайней мере, две необходимые, а более предпочтительно, по крайней мере, семь аминокислотных последовательностей эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов [SEQ ID NO: 17-24];

(b) пептидный/полипептидный иммуноген (а), который, кроме того, содержит любую из аминокислотных последовательностей эпитопа II, III или IV, а предпочтительно одновалентный иммуноген эпитопа II;

(с) синтетический или рекомбинантно продуцированный ген, кодирующий две необходимые последовательности эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, а предпочтительно семь последовательностей эпитопа I [SEQ ID NO: 17-24], и необязательно последовательности, описанные выше;

(d) синтетическую молекулу, содержащую синтетический ген (с);

(e) рекомбинантный вирус, несущий синтетический ген или молекулу, описанные выше; и

(f) бактерию-комменсал, несущую синтетический ген или молекулу, описанные выше.

Выбранный(е) активный(е) компонент(ы) присутствует(ют) в фармацевтически приемлемом носителе, а указанная композиция может содержать дополнительные ингредиенты. Фармацевтические препараты, содержащие композиции настоящего изобретения, могут включать другие активные агенты, такие как агенты, стимулирующие Т-клетки, для МАР, адъюванты и иммуностимулирующие цитокины, такие как IL-12, и другие хорошо известные цитокины для белковых/пептидных композиций. Все указанные фармацевтические композиции могут способствовать снижению уровней вируса у млекопитающего.

При получении фармацевтических композиций композиции, включающие пептидные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, и необязательные последовательности иммуногенов, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для введения млекопитающим в целях профилактики или лечения вирусных инфекций. Эти белки/пептиды могут быть объединены в одном фармацевтическом препарате для введения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, используемые в иммуногенной белковой композиции настоящего изобретения, хорошо известны специалистам. Указанными носителями являются, например, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, выбранный адъювант, такой как водные суспензии гидроксидов алюминия и магния, липосомы, эмульсии типа "масло в воде" и т.п. В белок-содержащих композициях настоящего изобретения могут быть также использованы подходящие адъюванты. Подходящими носителями для прямой доставки ДНК, плазмидной нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора являются, но не ограничиваются ими, физиологический раствор или сахароза, протамин, полибрен, полилизин, поликатионы, белки, CaPO₄ или спермидин. См., например, заявку РСТ WO94/01139 и работы, цитируемые выше. Пептидные/полипептидные композиции и синтетические гены или молекулы in vivo способны стимулировать у иммунизованного хозяина-млекопитающего, например у человека, иммунный ответ, способствующий супрессии множества (например, примерно более чем 95%-99%) известных внеклеточных вариантов белка Tat ВИЧ-1 и, тем самым, снижению уровней вируса.

Другая фармацевтическая композиция, которая может быть использована для ингибирования размножения ВИЧ-1, включает композицию антител, содержащую одно или несколько антител, подробно описанных выше. В фармацевтической композиции указанные антитела могут присутствовать в физиологическом растворе или в другом подходящем носителе. Указанные антитело-содержащие композиции способны обеспечивать немедленое экзогенное ингибирование Tat.

Настоящее изобретение не ограничивается выбором стандартных физиологически приемлемых носителей, адъювантов или других ингредиентов, которые могут быть использованы в фармацевтических препаратах вышеописанных типов. Препарат, включающий указанные фармацевтически приемлемые композиции, состоящие из вышеописанных компонентов и обладающие соответствующим рН, изотоничностью, стабильностью и другими приемлемыми свойствами, может быть получен любым специалистам.

К. Способ настоящего изобретения - Ингибирование размножения ВИЧ-1

В соответствии с настоящим изобретением способ снижения уровней вируса ВИЧ-1 предусматривает введение человеку вышеописанных фармацевтических композиций, которые индуцируют выработку антитела против Tat, активно индуцируют выработку антител, реагирующих с множеством (например, примерно более чем с 95%, а предпочтительно более чем с 99%) известных белков Tat ВИЧ-1 и подавляют размножение вируса in vivo. Этот способ предназначен для ВИЧ-1-инфицированного индивидуума с компетентной иммунной системой или для активной иммунизации неинфицированного индивидуума. Указанный способ позволяет индуцировать антитела, которые реагируют с белками Tat ВИЧ-1, подавляют размножение вируса в процессе начального острого инфицирования вирусом ВИЧ-1 и минимизируют хроническую виремию, приводящую к развитию СПИДа. Указанный способ также направлен на снижение постоянного размножения вируса у инфицированных индивидуумов, а также на минимизацию прогрессирования СПИДа. Использование указанных способов может осуществлять контроль над хроническими ВИЧ-1-инфекциями и дает новый механизм лечения, при котором не вырабатывается резистентность. Антитела против Tat ингибируют репликацию квазивидов ВИЧ-1 независимо от вида белка Tat, которые они продуцируют, поскольку внеклеточный белок Tat не ассоциируется с реплицирующейся частью этого вируса. Следовательно не существует какого-либо очевидного механизма, посредством которого антитела против Tat могли бы генерировать селективное давление на нереактивные и ускользающие от иммунологического надзора варианты Tat.

В соответствии с этим способом фармацевтические композиции содержат пептидные/полипептидые композиции, синтетические гены или молекулы, рекомбинантные вирусы или рекомбинатную бактерию-комменсал. Предпочтительно, указанные композиции содержат семивалентный синтетический ген или гибридный белок (без редкого варианта эпитопа I) или восьмивалентный синтетический ген или гибридный белок примера 3 и необязательно одновалентный пептид эпитопа II. Каждый из этих активных компонентов фармацевтической композиции активно индуцирует у человека, которому была введена указанная композиция, образование антител против Tat, которые блокируют перенос Tat из инфицированных клеток в другие инфицированные или неинфифицированные клетки. Это действие снижает множественность инфекции и блокирует вспышку размножения вируса ВИЧ-1 и, таким образом, снижает уровни вируса. У уже инфицированных пациентов этот способ снижения уровней вируса может способствовать снижению хронической виремии и ослаблению прогрессирования СПИДа. У неинфицированных индивидуумов введение композиции настоящего изобретения может приводить к подавлению острой инфекции и, тем самым, минимизировать хроническую виремию, приводящую к развитию СПИДа.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения уровней вируса ВИЧ-1 путем введения человеку, не способному вырабатывать эффективный или быстрый иммунный ответ на ВИЧ-1-инфекцию, фармацевтической композиции, содержащей композиции антител, описанные выше. Этот способ может предусматривать постоянное введение композиции. Пациентами, восприимчивыми к лечению указанным способом, являются ВИЧ-1-инфицированные пациенты с иммунологической реактивностью, нарушенной заболеванием, и неспособные вырабатывать сильный иммунный ответ. На более поздних стадиях ВИЧ-1-инфекции вероятность генерирования эффективных титров антител снижается вследствие ослабления иммунной системы, ассоциированного с указанным заболеванием. Такими пациентами являются ВИЧ-1-инфицированные беременные женщины, новорожденные у инфицированных матерей и неиммунизированные пациенты, которые, как предполагается, были подвергнуты контакту с вирусом (например, человек, которому случайно был сделан «укол» иглой, используемой ВИЧ-1-инфицированным человеком).

Для таких пациентов способ настоящего изобретения предпочтительно предусматривает использование антитело-содержащей композиции настоящего изобретения в качестве фармацевтической композиции. Указанная антитело-содержащая композиция включает композицию, содержащую поликлональное антитело, полученное от других млекопитающих, а предпочтительно от нормального человека или альтернативно другие формы вышеописанного антитела, например моноклонального антитела и т.п. Эти антитело-содержащие композиции вводят в качестве пассивной иммунотерапии для ингибирования размножения вируса и снижения вирусной нагрузки. Экзогенные антитела, которые реагируют с множеством известных белков Tat ВИЧ-1, быстро предотвращают у данного пациента перенос Tat от вирусинфицированных клеток в другие инфицированные или неифицированные клетки. В соответствии с указанным способом данному пациенту можно постоянно вводить антитело-содержащую композицию в течение продолжительного курса лечения.

В каждом из вышеописанных способов композицию настоящего изобретения вводят подходящим способом, например подкожно, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интраназально или путем ингаляции. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным путем введения является внутримышечное введение иммунизирующих (активное индуцирование) композиций и внутривенное (i.v.), подкожное (s.c.) или внутримышечное (i.m.) введение антитело-содержащих композиций (пассивная терапия). Рекомбинантный вирусный вектор или «голую» ДНК предпочтительно вводят внутримышечно, однако, некоторые другие рекомбинантные вирусные векторы и/или живые бактерии-комменсалы могут быть введены перорально.

Количество последовательностей белка, пептида или нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, присутствующее в каждой дозе вакцины, выбирают в зависимости от возраста, массы, пола, общего физического состояния пациента и т.п. Количество активного компонента, необходимое для индуцирования иммунного ответа, а предпочтительно протективного ответа, либо для продуцирования экзогенного эффекта у пациента без каких-либо значительных негативных побочных эффектов варьирует в зависимости от используемой фармацевтической композиции и присутствия необязательного адъюванта (для белок-содержащих композиций).

В общих чертах для композиций, содержащих белок/пептид, гибридный белок, МАР или связанный белок, или для композиций, содержащих антитело, каждая доза может содержать примерно от 50 мкг до 20 мг пептидных/полипептидных иммуногенов на мл стерильного раствора. Более предпочтительная доза может составлять примерно 500 мкг иммуногена. Другие диапазоны доз могут быть также определены самим специалистом. После введения начальных доз могут быть, но необязательно, введены повторные бустер-дозы, если это необходимо.

Композиции антител настоящего изобретения могут быть использованы для постоянного введения пациентам с риском острых инфекций, вызванных уколом иглы или инфекцией матери. Частота введения доз для каждой «острой» инфекции может варьировать от введения один раз в день до одного или двух раз в неделю, i.v., s.c. или i.m. в течение примерно 6 недель. Антитело-содержащие композиции настоящего изобретения могут быть также использованы для постоянного лечения инфицированных пациентов или пациентов с прогрессирующей ВИЧ-инфекцией. У инфицированных пациентов частота постоянного введения доз может варьировать от введения один раз в день до одного или двух раз в месяц, i.v., s.c. или i.m. и может зависеть от времени полужизни иммуногена (например, примерно 7-21 дней). Однако ожидается, что постоянное лечение таких инфицированных пациентов может продолжаться в течение неопределенного, но продолжительного периода времени.

Альтернативно, композиции настоящего изобретения могут быть получены для направленного введения синтетических генов или молекул настоящего изобретения в виде "голой ДНК". Как и в случае с иммуногенными белок-содержащими композициями, количества компонентов в ДНК- и вектор-содержащих композициях и способ введения, например, путем инъекции или введения через нос, могут быть выбраны и скорректированы любым специалистом. В основном, каждая доза может содержать примерно от 50 мкг до 1 мг иммуноген-кодирующей ДНК на мл стерильного раствора.

Что касается рекомбинантных вирусов, содержащих синтетические гены или молекулы, их дозы могут составлять примерно от 20 до 50 мл физиологического раствора, содержащего примерно от 1×10 ⁷ до 1×10¹⁰ б.о.е./мл рекомбинантного вируса настоящего изобретения. Предпочтительная доза для человека составляет примерно 20 мл физиологического раствора с вышеуказанными концентрациями вируса. Однако следует отметить, что каждый специалист может изменить указанные дозы в зависимости от конкретно используемого рекомбинантного вируса и состава иммуногена, который должен быть доставлен хозяину.

Количества бактерий-комменсалов, несущих синтетический ген или молекулы, доставляемые пациенту, будут, в основном, варьировать примерно от 10³ до 10 ¹² клеток/кг. Эти дозы могут быть изменены специалистом в зависимости от используемой бактерии и конкретной композиции, содержащей эпитоп I и необязательные иммуногены, доставляемые этой живой бактерией.

Таким образом, композиции настоящего изобретения предназначены для замедления или минимизации инфицирования неинфицированного млекопитающего, например человека, выбранным вирусом. Такие композиции, таким образом, используются в качестве вакцин. Антитела против белка Tat не реагируют с белками ВИЧ-1, используемыми в диагностических анализах для детекции сероконверсии после инфицирования. Таким образом, индивидуумы, которым были введены композиции настоящего изобретения, не должны давать ложноположительные результаты в тестах на ВИЧ-1-инфекцию и, при этом, должна оставаться возможность детекции сероконверсии в том случае, если индивидуумы, которым была введена указанная композиция, становятся ВИЧ-1-инфицированными.

Введение млекопитающему композиции настоящего изобретения независимо от того, является ли она белок/пептид-содержащей композицией или новой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноген, представляет собой радикально отличающуюся стратегию для вакцинации против СПИДа, поскольку она позволяет снижать уровни вируса путем биологического ингибирования, предпочтительно более чем примерно 95%, а более предпочтительно более чем примерно 99% известных вариантов белка Tat ВИЧ-1, снижая, тем самым, размножение ВИЧ-1.

Использование композиций, содержащих иммуноген Tat, имеет особенно желательное преимущество по сравнению с другими способами лечения и профилактическими способами, используемыми против таких вирусов. Поскольку подавление белка Tat экстраклеточно приводит к ингибированию размножения всех квазивидов или штаммов ВИЧ без разбора, то оно не создает селективного давления на сам родительский вирус для отбора мутантных вирусных вариантов. Таким образом, блокирование поглощения белка Tat клетками пациента не только снижает уровень виремии, но также препятствует отбору «ускользающих от контроля» вариантов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу активного лечения асимптотических ВИЧ-1-инфекций у пациентов с виремией, поскольку по мере развития заболевания внеклеточный белок Tat, по всей вероятности, играет определенную роль в развитии хронической инфекции и иммунных патологий, которые возникают на этой стадии ВИЧ-1-инфекций. Ингибирование внеклеточного белка Tat антителами, индуцированными путем иммунизации в соответствии с настоящим изобретением, может приводить к снижению виремии посредством более эффективного иммунного контроля и к замедлению или предупреждению развития СПИДа.

Механизм настоящего изобретения, описанный выше, может быть использован для предотвращения развития вирусной инфекции и достижения желательных клинических результатов. Более конкретно, композиции настоящего изобретения способны снижать виремию у пациентов, уже инфицированных вирусом, путем блокирования последующего поглощения белка Tat неинфицированными клетками. Ожидается, что композиции настоящего изобретения, используемые либо отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими схемами лечения ВИЧ-ифицированных пациентов, будут способствовать снижению виремии и предупреждению клинического ухудшения состояния пациента.

Для такого терапевтического применения препараты и способы введения, в основном, идентичны препаратам и способам, конкретно описанным выше, и эти препараты могут быть введены вместе или одновременно с другими стандартными терапевтическими средствами, предназначенными для конкретной вирусной инфекции. Для терапевтического или профилактического использования может оказаться желательным повторное введение доз иммунизирующих композиций, таких как бустер-доза, вводимая один раз в год или бустер-дозы, вводимые через другие интервалы времени.

L. Диагностические наборы настоящего изобретения

Пептиды и полипептиды, описанные выше, могут быть также использованы в качестве реагентов в наборе, используемом для измерения и детекции титров и специфичности антител, индуцируемых путем вакцинации композициями, описанными выше. Набор настоящего изобретения может включать, по крайней мере, два необходимых пептида эпитопа I, определенных выше, а предпочтительно два или более эпитопов I, распознаваемых иммунной системой приматов, и необязательные иммуногены. В одном из вариантов осуществления изобретения каждый пептид имеет на своем N-конце белок биотин и спейсер, например -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NO: 27]. Альтернативно, указанный пептид может иметь на своем С-конце спейсер, например -Gly-Ser-Gly-Ser- [SEQ ID NO: 39], и белок - биоцитин. Эти варианты обеспечивают связывание указанных пептидов с твердым носителем, сенсибилизированным авидином, например, с плоской поверхностью или сферами. В этих целях могут быть также использованы и другие связывающие агенты, известные специалистам в области диагностического анализа. В данный набор также входят меченные реагенты, которые детектируют связывание антитела с иммобилизованными пептидами эпитопов, таких как козье антитело против человеческого иммуноглобулина или т.п. Метка для реагента может быть выбрана из множества известных диагностических меток, таких как радиоактивные соединения, флуоресцентные соединения и белки, колориметрические ферменты и т.п. Таким образом, этот набор также содержит разнообразные реагенты и устройство для считывания меток, например некоторые субстраты, которые взаимодействуют с ферментной меткой для продуцирования цветового сигнала и т.п., устройство для взятия проб крови, а также соответствующие сосуды и другие компоненты для диагностического анализа. Каждый специалист может также легко выбрать другие стандартные диагностические компоненты для этого набора.

Такие наборы и реагенты могут быть использованы в способе детекции титров и оценки картины реактивности антител у пациентов, вакцинированных композициями настоящего изобретения. Способ определения присутствия и/или титра антител, индуцированных путем иммунизации против иммуногена Tat, включает стадии контактирования биологического образца, взятого у иммунизованного индивидуума, например, физиологической жидкости, предпочтительно крови, сыворотки или плазмы, но возможно также мочи, слюны и других жидкостей или тканей, с одной или несколькими связывающими последовательностями эпитопа I, распознаваемого иммунной системой приматов, и с необязательными иммуногенами, предпочтительно иммобилизованными на твердом носителе, таком как плоская поверхность или сферы. Эпитоп I, распознаваемый иммунной системой приматов, и необязательные связывающие последовательности, используемые в данном способе, могут представлять собой немодифицированные минимальные области связывания эпитопа.

После обработки биологического образца иммобилизованными пептидами в течение достаточного промежутка времени носитель промывают для удаления из данного биологического образца любого материала, не связанного с данными пептидами. Такие стадии промывки являются традиционными в диагностических анализах и осуществляются с использованием физиологического раствора. В случае, если антитела против эпитопа I и необязательных иммуногенов или их комбинаций были индуцированы у пациента посредством вышеуказанной обработки, то иммобилизованные пептиды связываются с антителом из биологического образца. Затем для детекции связывания между пептидами на твердом носителе и антителом в указанном биологическом образце в материал на носителе добавляют меченый реагент. Таким реагентом предпочтительно является античеловеческий иммуноглобулин, такой как козий античеловеческий иммуноглобулин. Указанную метку выбирают из широкого ряда обычно используемых диагностических меток, обсуждаемых выше. В одном из вариантов осуществления изобретения такой меткой может быть колориметрический фермент, который после своего контакта с субстратом, продуцирует детектируемый цветовой сигнал. Присутствие и/или интенсивность цветового сигнала является показателем индукции антитела у обработанного индивидуума. Этот анализ может быть использован для определения эффективности иммунизации, а также для мониторинга иммунного статуса пациента.

Выбор конкретных стадий анализа, а также различных систем детектируемых меток может быть с успехом осуществлен самим специалистом. Такой отбор является рутинной процедурой и не ограничивает объема изобретения.

М. Преимущества настоящего изобретения

Одним из преимуществ композиции настоящего изобретения является небольшое число иммуногенов, необходимых для включения в композицию данного изобретения для перекрестной реакции с более чем 95-99% известных вариантов белка Tat ВИЧ-1 наиболее распространенного В-подтипа. Как проиллюстрировано в нижеприведенных примерах, иммуногенная композиция распознаваемого приматами эпитопа I, содержащая две необходимые аминокислотные последовательности распознаваемого приматами эпитопа I, а также шесть дополнительных последовательностей эпитопа I перекрестно реагируют с 95% белков Tat ВИЧ-1 наиболее распространенного В-подтипа, а также со всеми 56 последовательностями белка Tat более редких не-В-подтипов ВИЧ-1. Таким образом, одна композиция может быть с успехом использована для защиты от инфекции или для лечения инфекции, вызываемой большинством из встречающихся штаммов ВИЧ-1.

Кроме того, при точной идентификации эпитопов Tat, с которыми было бы желательно связывание (то есть АА5-12 SEQ ID NO: 15), новые нужные пептидные иммуногены Tat, происходящие от вновь появляющихся штаммов ВИЧ-1 или новых обнаруженных штаммов, могут быть легко идентифицированы описанными здесь методами и включены в композиции. Такая универсальность позволяет использовать композиции настоящего изобретения для профилактики в целях защиты от любого нового штамма или штаммов ВИЧ-1, которые могут быть идентифицированы в будущем. Предполагается, что исходя из приведенного здесь описания, любой специалист может легко вводить новые комбинации иммуногенов Tat (и конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих эти иммуногены) в композиции.

Так, например, использование стандартных методов, таких как ПЦР и олигонуклеотидные матрицы высокой плотности [M.J. Kozal et al., Nature Med., 2:753 (1996)], позволяет специалисту получить аминокислотные последовательности для большого множества белков Tat ВИЧ-1, представляющих собой варианты клинических изолятов штаммов и подтипов ВИЧ-1. Использование такой техники позволяет определить другие варианты В-подтипа ВИЧ-1, а также другие подтипы этого вируса, встречающиеся в слаборазвитых странах, которые до настоящего времени не были достаточно изучены. Определение новых последовательностей Tat позволит легко включать соответствующие пептиды в качестве иммуногенов в композиции настоящего изобретения и, тем самым, индуцировать гуморальный ответ против других редких белков Tat ВИЧ-1.

Исследования перекрестной реактивности с антителами, продуцированными против синтетических пептидов, соответствующих каждому варианту Tat, могут быть использованы для исключения необходимости иммунизации такими вариантами Tat, в которых замены в последовательности являются иммунологически молчащими, то есть в которых указанные пептиды сильно связываются с антителами против консенсусной последовательности или других вариантов.

Нижеследующие примеры иллюстрируют предпочтительные методы получения композиций настоящего изобретения и использования этих композиций для индуцирования антител против белков Tat указанного вируса в иммунизованном хозяине. Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема настоящего изобретения.

Пример 1 - Иммунологические исследования в целях определения минимальных аминокислотных последовательностей белка Tat, необходимых для связывания с антителом против распознаваемого приматами эпитопа I в белке Tat ВИЧ-1, вариантов последовательности и иммунологической перекрестной реактивности антисывороток против этих последовательностей

А. Синтетический пептид и конъюгаты

Синтетические пептиды были синтезированы путем твердофазного синтеза на дериватизированных полиэтиленовых носителях [R.M.Valerio et al., Int. J. Peptide Res., 44:158-165 (1994)]. Были синтезированы иммунизирующие пептиды с амино-концевым Cys, вводимым для облегчения присоединения к белку-носителю и к амидированному С-концу. Были также синтезированы детекторные пептиды с амино-концевой последовательностью биотин-Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NO: 27] и свободной кислотной функциональной группой у С-конца для использования в анализах ELISA в целях детекции реактивности и перекрестной реактивности. Иммунизирующие пептиды, ковалентно конъюгированные с белком-носителем дифтерийного токсоида (DT) посредством цистеиниловой боковой цепи в отношении пептид:носитель =5:8 [A.C.J. Lee et al., Molec. Immunol. 17:749 (1980)], были очищены с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) с получением чистоты более чем 95%, на что указывала аналитическая ЖХВД и масс-спектрометрия, при этом используемые детекторные пептиды имели чистоту более чем 50%.

В. Иммунизация

Пептидные конъюгаты растворяли в очищенной воде и эмульгировали 1:1 полным адъювантом Фрейнда (CFA) или неполным адъювантом Фрейнда (IFA) [ANTIBODIES - A LABORATORY MANUAL, Eds. E. Harlow & P.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)]. Общий объем для примата составлял 1 мл и в этом объеме содержалось 100 мкг пептида, связанного с DT.

Макаки резус, которые участвовали в исследовании на вирусное заражение, были иммунизированы антигеном в IFA/CFA следующим образом. Несколько приматов использовали для иммунизации пептидом путем первоначальной внутримышечной (i.m.) инъекции конъюгата в CFA, а затем, через две недели, бустер-инъекцией i.m. конъюгата в IFA. Перед первой инъекцией брали предварительные пробы крови, а через 3 и 5 недель после бустер-инъекции брали более крупные пробы.

С. ELISA-титры

ELISA-анализы были проведены как описано Н.М. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1983). Титр антитела представлял собой величину, обратную разведению сыворотки, которая давала оптическую плотность на 1,0 ОП единиц выше фонового уровня. Для каждого ответа вычисляли геометрическое среднее титра (GMT) для 2-3 проб сывороток, либо лишь одиночные сыворотки были доступны для иммунизации некоторых обезьян.

Результаты сравнительного анализа ELISA, проведенного на кроликах и на обезьянах, представлены на фиг.1А и 1В, соответственно. Результаты ELISA продемонстрировали, что антитела приматов против иммуноген-содержащего эпитопа I реагируют с последовательностью -Asp-Pro-Arg₇-Leu-Glu₉-Pro-Trp-Lys ₁₂- [АА5-12 SEQ ID NO: 15]. Как обсуждается ниже, положения 7, 9 и 12 представляют наиболее распространенные варианты указанного пептида эпитопа I, распознаваемого приматами.

D. Анализ на разнообразие аминокислотных последовательностей в эпитопах

Последовательности первого экзона Tat ВИЧ-1 были взяты из банка Genbank и базы данных ретровирусов и СПИДа человека в Лос-Аламосе [HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996, опубликованные группой «Теоретической биологии» и «Биофизики» в Национальной лаборатории Лос-Аламоса, Los Alamos, NM, и дополнительные последовательности, любезно предоставленные из Genbank Dr. Esther Guzman, лаборатория Los Alamos]. Неполные последовательности и последовательности со стоп-кодонами или делециями оснований, приводящими к сдвигу рамки считывания, были удалены, поскольку они, очевидно, были идентичными повторяющимися последовательностями от того же самого изолята. Варианты аминокислот в указанных положениях внутри эпитопов были зарегистрированы и представлены в виде таблиц.

Е. Антигенная перекрестная реактивность между вариантами

Антисыворотки против консенсусной последовательности эпитопа титровали с помощью ELISA на консенсусной последовательности и на последовательностях с наиболее распространенными вариантами аминокислот для определения влияния аминокислотного полиморфизма на антигенность.

F. Различия в последовательностях

Консенсусные последовательности распознаваемого приматами эпитопа I оценивали на максимальную встречаемость и распознавание антителами приматов. Для этих эпитопов была оценена антигенная консервативность и консервативность последовательностей в белках Tat ВИЧ-1 для 294 белков Tat ВИЧ-1, происходящих от 294 вирусов В-кладотипа (I) и 56 вирусов не-В-кладотипа (II), и результаты представлены в таблицах II-VI.

В верхнем ряду в таблицах II и III показана консенсусная последовательность, имеющая максимальную встречаемость. В средних рядах указан процент встречаемости аминокислот, обнаруженных в более чем 5% последовательностей в каждом положении, если их несколько. В нижнем ряду каждой таблицы указан процент общей встречаемости, включая аминокислоты, присутствующие в более чем 5% последовательностей в каждом положении, если их несколько. Все указанные наборы данных в таблице II представляют антигенно отличающиеся эпитопы (с перекрестной реактивностью <25%) и это относится ко всем указанным наборам данных в таблице III, за исключением графы под аминокислотой 4.

Таблица II

Эпитоп I - 294 последовательности В-кладотипа

Val4

Asp 5

Pro6

Arg7

Leu8

Glu9

Pro 10

Trp11

Lys12

Arg(73)

Lys(96)

Lys(12)

Asn(2)

Ser(11)

Asn(4)

100%

98%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

Таблица III

Эпитоп I - 56 последовательностей не-В-кладотипа

Val4

Asp 5

Pro6

Asn7

Leu8

Glu9

Pro 10

Trp11

Asn12

Val(89)

Asn(79)

Glu(86)

Asn(87)

Ile(11)

Lys(14)

Asp(14)

Lys(13)

Ser(5)

100%

100%

100%

98%

96%

100%

98%

100%

100%

Как показано в таблицах II и III, эпитоп I, распознаваемый приматами, имеет потенциальный 16-кратный антигенный полиморфизм, но один крупный антиген имеется в В-кладотипах, а другой крупный антиген имеется в не-В-кладотипах. Пять других вариантов ответственны за более чем 95% известных вариантов Tat. См. таблицы IV и V; последовательности, указанные звездочками, представлены в обоих В- и не-В-кладотипах.

В таблице VI проиллюстрирована слабая антигенная перекрестная реактивность вариантов эпитопа I в положении 7, антигенное отличие этих вариантов в положении 9 и почти полное отсутствие перекрестной реактивности антисыворотки против GluProValAspProArg ₇LeuGlu₉ProTrpAsn₁₂ [АА225-235 SEQ ID NO: 13] с последовательностью GluProValAspProArg₇ LeuGlu₉ProTrpLys₁₂ [АА2-12 SEQ ID NO: 15], содержащей модификации в обоих положениях 7 и 12. Показано также антигенное отличие Glu9- и Asp9-вариантов.

Пример 2 - Иммунологические исследования в целях определения минимальных аминокислотных последовательностей белка Tat, необходимых для связывания с антителом против распознаваемого приматами эпитопа II в белке Tat ВИЧ-1, вариантов последовательности и иммунологической перекрестной реактивности антисывороток против этих последовательностей

С использованием процедур, описанных в Примере 1, определяли встречаемость вариантов аминокислотной последовательности для 294 последовательностей Tat ВИЧ-1 В-кладотипа и 56 последовательностей не-В-кладотипа в пределах границ эпитопа II для связывающего антитела, присутствующего у обезьян. Результаты представлены в таблицах VII и VIII. Верхние строки таблиц содержат данные для консенсусной последовательности. В средних строках указан процент встречаемости аминокислот, обнаруженных в более чем 5% последовательностей в каждом положении, если их несколько. В нижней строке каждой таблицы указано общее число случаев встречаемости, включая аминокислоты, присутствующие в более чем 5% последовательностей в каждом положении, если их несколько. Аминокислотные варианты в положении 42 Tat обладали антигенной перекрестной реактивностью.

Как показано в таблицах VII и VIII, эпитоп II обнаруживает почти полную антигенную консервативность.

Была измерена ELISA-реактивность обезьяньих антисывороток против иммуногена эпитопа II на детекторных пептидах с Gly₄₂ или Ala₄₂ Tat (вариантами) в детекторных последовательностях и результаты представлены ниже в таблице IX. См., например, фиг.2А и 2В, где графически представлены сравнительные результаты для кроликов и обезьян, соответственно.

Пример 3: Вырабатывание человеческого моноклонального антитела. Лечение асимптотических ВИЧ-1-инфекций

Коммерчески доступные мыши с "очеловеченными" антителами иммунизировали подходящим количеством иммуногена эпитопа II: Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-амид [SEQ ID NO: 34], присоединенного к белку-носителю дифтерийного токсоида. Гибридомы скринировали на последовательность биотин-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-ОН [SEQ ID NO: 35] на иммобилизованных со стрептавидином планшетах и отбирали моноклональное антитело IgG с субнаномолярной аффинностью связывания, которое не связывалось с комплементарными рецепторами. Были подтверждены специфичности по отношению к рекомбинантному белку Tat ВИЧ-1.

Поскольку указанное моноклональное антитело направлено не на сам антиген, то следует провести традиционные процедуры его предклинического продуцирования, очистки и теста на безопасность. Человеческие моноклональные антитела имеют время полужизни 20 дней у человека, тогда, как время полужизни ОКТ3 мышиного моноклонального антитела, которое интенсивно поглощается на внутреннем CD3, составляло 18 часов. Суточные дозы в 5 мг ОКТ3 способствовали поддержанию минимальных уровней антитела примерно 1 микрограмм/мл у человека. Таким образом, ожидалось, что доза анти-Tat моноклонального антитела в 5 мг, вводимая раз в две недели, является достаточной для поддержания аналогичных минимальных уровней, что в молярном отношении более чем в 50 раз превышает оцененные максимальные циркулирующие уровни у инфицированных индивидуумов, составляющие до 1 нг/мл для белка Tat ВИЧ-1.

В настоящее время контроль вирусной нагрузки в плазме является общепринятым критерием эффективности лечения ВИЧ-1-инфекций. Эффективность моноклонального антитела против Tat может быть быстро определена у ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов без симптомов заболевания уже в первые четыре недели курса лечения. Этот протокол может быть использован для пациентов, которые еще не проходили курса лечения; для пациентов, которые по различным причинам оказались невосприимчивыми к лечению, проводимому в соответствии с протоколами HAART; или для пациентов, подвергнутых HAART-терапии с прекращением этой терапии через 4 недели (вирусная нагрузка быстро восстанавливалась при прекращении HAART-трапии). 2-3 log величины снижения вирусной нагрузки в плазме до величины ниже LOD (50 копий вирусной РНК/мл) свидетельствуют в пользу монотерапии моноклональным антителом, которую оценивали в течение более продолжительного промежутка времени. Снижение выше одного log (90%), но не ниже LOD, наводит на мысль об использовании указанного моноклонального антитела как компонента терапии.

Пример 4 - Разработка универсальной вакцины для предотвращения развития СПИДа у индивидуумов

А. Конструирование синтетического гена

На фиг.3 проиллюстрирован синтетический ген, кодирующий четыре копии каждого из четырех полиморфов эпитопа I, обнаруживаемых при гуморальном ответе у кроликов, и четыре копии эпитопа II, экспрессированных как линейный гибридный белок в штамме DnaK E.coli (HSP70). При тестировании в ELISA с использованием эпитоп-специфических кроличьих антисывороток этот экспрессированный белок содержал все антигенные эпитопы. Однако при использовании для иммунизации кроликов или обезьян все варианты эпитопа I были иммуногенными, кроме эпитопа II. Таким образом, эпитоп II лучше всего использовать в виде синтетического пептидного конъюгата, присоединенного к подходящему белку-носителю.

На фиг.3В проиллюстрирован новый восьмивалентный синтетический ген, который был сконструирован исходя из полиморфизма в границах распознаваемого приматами эпитопа I для введения, с сохранением рамки считывания, восьми полиморфов распознаваемого приматами эпитопа I:

R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 17]

R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 19]

R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 22]

R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 20]

R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 24]

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NO: 21]

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 18] и

R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 23].

Последовательности эпитопа I разделены дипептидными спейсерами, содержащими остатки Gly и/или Ser. Сборку этого гена осуществляли, как описано W.P.C. Stemmer et al., Gene, 164:49 (1995). Вкратце, наряду с двухконцевыми 50-мерами, синтезировали 60-мерные олигонуклеотиды верхней цепи (oligos) и олигонуклеотиды нижней цепи с перекрыванием в 20 нуклеотидов (nt). Эти 60-меры инкубировали вместе в условиях гибридизации и осуществляли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для достраивания последовательности и ее амплификации. Затем добавляли концевые 50-меры и осуществляли сборку с помощью ПЦР с выделением полноразмерного гена на агарозном геле. Этот ген секвенировали и было обнаружено, что он имеет "правильную" последовательность в нужных эпитопах. Аналогичный семивалентный ген может быть сконструирован путем исключения редкого варианта R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NO: 24].

В. Экспрессия гибридного белка

Затем вышеописанный ген вырезали рестриктирующими ферментами и встраивали в подходящий экспрессирующий вектор, содержащий, в той же самой рамке считывания, последовательность дифтерийного токсоида (HSP 70). E.coli трансфецировали и колонии, экспрессирующие данный белок, выделяли. Выделенные колонии культивировали и индуцировали экспрессию. Затем идентифицировали белок из колоний, экспрессирующих гибридный белок. Полученный белок очищали стандартными методами.

На фиг.3С проиллюстрирован моновалентный иммуноген эпитопа II, полученный, но необязательно, в виде конъюгата синтетического пептида с белком-носителем, таким как дифтерийный токсоид, с использованием стандартной техники.

С. Анализы для оценки «правильной» экспрессии эпитопов в гибридном белке и эффективности индуцирования антител против Tat

Четыре варианта эпитопа I, где Y₇ представляет собой Arg, Asn, Lys или Ser, Х₉ представляет собой Glu, а Z₁₂ представляет собой Lys, и оба варианта эпитопа II конструировали в синтетическом гене и экспрессировали в виде гибридного белка, как описано выше в параграфах А и В. Для того чтобы определить, экспрессируется ли каждый эпитоп в гибридном белке в форме, которая может распознаваться антисывороткой приматов, антисыворотки приматов, вырабатываемые против синтетических пептидов, соответствующих последовательностям эпитопа I, тестировали с помощью ELISA с использованием стандартной методики. Планшеты сначала непосредственно сенсибилизировали гибридным белком, а затем обрабатывали 100 мкг/мл раствора антисывороток (например, кроличьих антисывороток), которые, как известно, реагировали с эпитопами I и II. Последовательности-варианты этих эпитопов экспрессировали в конформации, распознаваемой антителами против соответствующих синтетических пептидов, на что указывал титр, составляющий более чем 32000 для каждого эпитопа.

Для оценки иммуногенности мультивалентного иммуногена обезьян иммунизировали гибридным белком в IFA. Обезьяньи антисыворотки анализировали на синтетические пептиды эпитопов I и II. Против вариантов эпитопа I вырабатывались высокие титры, то есть титр 28000 для эпитопа I, где Y₇ представляет собой Arg, а Z₁₂ представляет собой Lys; титр 16000 для эпитопа I, где Y ₇ представляет собой Asn, а Z₁₂ представляет собой Lys; титр 37000 для эпитопа I, где Y₇ представляет собой Lys и Z₁₂ представляет собой Lys, и титр 4000 для эпитопа I, где Y₇ представляет собой Ser, а Z ₁₂ представляет собой Lys. Титр для эпитопа II составлял 700, что указывало на то, что для иммунизации этот эпитоп лучше всего использовать в виде синтетического пептида, связанного с носителем.

Пример 5: Способ и наборы для детекции титров и специфичностей антител, индуцированных путем вакцинации

Для оценки титра и специфичностей антител, индуцированных после иммунизации вакцинами настоящего изобретения, может быть использован аналитический метод. В одном из вариантов такого анализа пептиды, содержащие последовательности распознаваемого приматами эпитопа I, описанные в Примере 1 (в зависимости от состава иммунизирующей вакцины), использовали в целях разработки наборов для измерения титров и оценки картины реактивности антител у вакцинированных индивидуумов.

Эти пептиды синтезировали с использованием последовательности биотин-Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NO: 36] у N-конца. Каждый пептид наносили на отдельные сенсибилизированные авидином планшеты, где последовательность -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NO: 27] служила в качестве спейсера для гарантии того, что соответствующая пептидная последовательность будет оставаться внешней по отношению к биотин-связывающему карману авидина. Затем планшеты инкубировали с разведениями тестируемой сыворотки, промывали и оценивали на связывание антитела с использованием реагента против иммуноглобулина человека, например козьего античеловеческого иммуноглобулина, непосредственно помеченного ферментом. Этот реагент использовали для реакции с данным ферментом, в результате чего продуцировался колориметрический сигнал (вкладыши набора R&D).

В вышепривиденное описание изобретения могут быть внесены многочисленные модификации и изменения, которые очевидны для каждого специалиста. Такие модификации и изменения, вносимые в композиции и способы настоящего изобретения, входят в объем прилагаемой формулы изобретения.