способ диагностики карциномы эрлиха

Формула изобретения

Способ диагностики карциномы Эрлиха путем исследования лимфоцитов крови, отличающийся тем, что лимфоциты крови обрабатывают меченной флюоресцеинизотиоцианатом изоформой лектина гороха, полученной экстракцией измельченных семян гороха раствором хлорида натрия, очисткой переосаждением, диализом и выделением изоформы колоночной хроматографией на сефадексе и элюцией раствором, содержащим глюкозу, и при снижении числа меченых лимфоцитов более чем на 50% относительно нормы диагностируют карциному Эрлиха.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам диагностики онкологических заболеваний.

Одна из основных проблем онкологии состоит в том, что никому не удается найти те изъяны в иммунитете онкологических больных, которые делают возможным рост опухолей в организме. Складывается парадоксальная ситуация, когда иммунитет онкологических больных ничем не отличается от здоровых, но при этом в организме у них растет опухоль.

На фоне роста опухоли в иммунитете организма не происходит изменений, подобных тем, которые развиваются при иммунодефицитных состояниях, когда подавлены целые звенья иммунокомпетентных клеток или когда происходит исчезновение каких-либо клеточных рецепторов. Изменения, которые происходят в лимфоцитах организма на фоне роста опухоли, касаются гликозилирования белков (рецепторов) их клеточной мембраны. В этом случае иммунокомпетентные клетки теряют способность реагировать только на опухолевые клетки, тогда как реакция на инфекционные агенты полностью сохранена, т.е. иммунодефицит не развивается.

В настоящее время все методы диагностики онкологических заболеваний по анализу крови основаны на измерении уровня опухольассоциированных антигенов. Опухольассоциированные антигены - это структуры, которые в норме представлены в тканях организма, но их количество в нормальных тканях или незначительно, или расположение их в тканях таково, что в норме в кровь они не попадают. В результате развития онкологического процесса увеличивается количество опухолевых клеток и увеличивается в организме количество опухольассоциированных антигенов, которые экспрессированы на поверхности этих клеток. При гибели и (или) слущивании с поверхности опухоли эти антигены начинают попадать в кровь. Таким образом, эта группа методов диагностики использует структуры, которые расположены на опухолевых тканях и полностью игнорирует те изменения, которые могут происходить в организме в ответ на растущую опухоль.

Известен способ диагностики онкологических заболеваний путем определения содержания малых лимфоцитов (диаметр <7.5 мкм) в крови больных онкологическими заболеваниями (В.И.Говалло и др. "Снижение содержания малых лимфоцитов в крови больных со злокачественными костными опухолями". Вопросы онкологии. 1987 г., том 33, №9, стр.15-21).

Как указывают авторы, снижение их на 40-75% по сравнению со здоровыми людьми наблюдается на фоне роста опухолей.

Однако данный способ отличается большим субъективизмом и зависит от квалификации специалистов. Так, диаметр клеток может меняться в зависимости от изотоничности растворов, скорости фиксации мазков, опыта измерения размеров клеток окуляр-микрометром МОВ-1 и т.д. Вследствие большого субъективизма метода он не нашел широкого применения.

Задачей изобретения является повышение специфичности диагностики онкологических заболеваний и исключение его субъективизма.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что лимфоциты крови обрабатывают меченной флуоресцентным красителем - флуоресцеинизотиоцанатом изоформой лектина гороха, и при снижении числа меченых лимфоцитов более чем на 50% относительно нормы судят о наличии онкологического заболевания.

Способ осуществляют следующим образом.

Лектин гороха выделяют методом аффинной хроматографии на Sephadex G-100. Выделение изоформы лектина гороха с высоким сродством связывания с сахарами является необходимым этапом для повышения специфичности диагностики, так как в противном случае с поверхностью клеток связывались бы изоформы лектина, которые при отмывании клеток от несвязавшегося лектина также удалялись (из-за их низкой константы связывания) с поверхности клеток и это приводило бы к заниженному проценту окрашенных клеток.

Для этого семена гороха перемалывают в мельнице в муку с размером гранул менее 0.1 мм. Затем заливают 4-кратным по весу количеством 0.5% раствора NaCl и настаивают в течение 3 часов при 4°С. Экстракт подкисляют до рН 4,6 с помощью 5N HCl и центрифугируют для удаления осадка при 1500 g в течение 30 мин.

Твердый сульфат аммония (NH ₄)₂SO₄ добавляют к супернатанту до достижения 60% насыщения раствора. Выпавший в осадок белок собирают центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. Осадок растворяют в минимальном объеме воды и диализируют строго при 4°С против 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Белок, выпавший в осадок во время диализа, также удаляют центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.

Супернатант наносят на колонку с Sephadex G-100 (26×100 см). Несвязавшийся белок элюируют 4 л 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Лектин гороха элюируют 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с содержанием глюкозы от 0.01 до 0.2М, с шаговым повышением концентрации глюкозы 0.01, 0.05 и 0.2М. Элюированный лектин собирают в три отдельные фракции, которые подвергают диализу против 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2). Белок стерилизуют микрофильтрацией с помощью 0.22 Millipore фильтра.

Далее проводят мечение изоформы лектина флуоресцеинизотиоцианатом. Мечение изоформы лектина именно этим флуоресцентным красителем необходимо, так как именно флуоресцеинизотиоцианат флуоресцирует от лазерного источника света, который используется в проточном цитофлуориметре.

В данном приборе соединены воедино два блока - оптический прибор с лазерным источником света и мощный компьютер. Клетки анализируемого образца попадают и двигаются в тонком стеклянном капилляре, луч лазера просвечивает этот капилляр и клетки, которые по нему двигаются. В различных направлениях по ходу лазерного луча стоят многочисленные детекторы, которые оценивают прохождение света через клетку, его рассеивание на объекте, отражение, флуоресценцию и т.д.

Компьютер по специальной программе оценивает поступающую информацию и выдает оптические параметры каждой, прошедшей по капилляру клетки, определяя уровень флуоресценции каждой из них, что позволяет измерить количество лектина, связавшегося с клеткой и, следовательно, уровень сахаров на поверхности анализируемой клетки, которые доступны для связывания с данным лектином.

Исходно раствор лектина хранят в 0.15М растворе NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1% в концентрации 8 мг/белка на мл. Для мечения берут 0.5 мл раствора и доводят этим же буфером объем до 2.5 мл. Этот объем наносят на колонку PD-10, уравновешенную 0.1М карбонатным буфером рН 9.3. Белок элюируют 3 мл карбонатного буфера. Таким образом получают раствор белка с концентрацией в пределах 0.5-2 мг/мл. 1 мг флуоресцеинизотиоцианата растворяют в 1 мл диметилсульфоксида и добавляют к раствору белка из расчета 25 мкл на 1 мл буфера. Раствор перемешивают и оставляют на ночь при 4°С. По окончании инкубации к раствору добавляют 100 мкл 0.5М раствора хлорида аммония и оставилют в прежних условиях при 4°С на 2 часа. Затем лектин переводят в исходный буфер (0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1%) с помощью колонки PD-10, уравновешенной 0.15М раствора NaCl в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0.1%.

Диагностика онкологического заболевания на перевиваемой карциноме Эрлиха

Перевиваемые опухолевые модели позволяют быстро изучить те изменения, которые происходят в организме на фоне роста опухоли. Для этого берут животных одной линии, веса, пола, возраста и части из них перевивают опухоль, а часть используют как контроль. Большинство опухолей уже через две-три недели достигают значительных размеров, в то время как животные без опухоли являются адекватным контролем на те изменения в организме, которые происходят именно на рост опухоли.

На фоне роста карциномы Эрлиха в сыворотке крови мышей появляются для этой опухоли факторы, ускоряющие ее рост в опытах in vivo. Однако природа этих изменений остается неизвестной, так как не удается выявить каких-либо опухольспецифических факторов. Нами было высказано предположение, что этот феномен связан с изменением гликозилирования белков крови и мембран лимфоцитов. С целью подтверждения этого предположения было изучено изменение связывания меченой изоформы лектина гороха с лейкоцитами крови на фоне роста карциномы Эрлиха. Выделенная изоформа лектина обладает способностью связываться с глюкозидом и маннозой, в том числе и входящей в состав полисахаридов при гликозилировании белков.

Способ осуществляют с использованием самцов мышей F₁ (CBAxC₅₇BL/6), мышей линии C₅₇BL/6 самцов. В каждой группе используют 10 животных. Клетки карциномы Эрлиха трансплантируют внутримышечно по 10⁶ клеток в 0.2 мл среды RPMI-1640 на мышь. Лимфоциты выделяют из периферической крови мышей на 15 сутки после трансплантации опухоли по стандартной методике в градиенте плотности 1.093. Каждый эксперимент повторяют не менее 3 раз.

Определение экспрессии поверхностных маркеров на поверхности лимфоцитов проводят при помощи меченных флуоресцеинизотиоцианатом лектинов. Оценку специфичности связывания пектинов с клеточной поверхностью подтверждают ингибированием их связывания при добавлении сахаров. Результаты учитывают методом проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США). Гейт (окно) популяции клеток устанавливают на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. Подобный подход полностью исключает субъективный фактор при проведении анализа, так измерения проводятся детекторами прибора и их показания полностью определяются оптическими свойствами анализируемого объекта. При учете результатов подсчитывают 10000 событий в гейте. Статистическую обработку материала проводят при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Исследовали связывание лектинов с поверхностью лимфоцитов периферической крови интактных мышей и мышей на 20 день карциномы Эрлиха. В таблице 1 приведены усредненные данные по всем сериям экспериментов с различным видимым объемом опухоли от минимального менее 1 мм³ до 5 см³.

На фигуре 1 показано распределение клеток лимфоцитов крови здоровых мышей. По оси абсцисс показано распределение клеток лимфоцитов периферической крови в зависимости от их фронтального светорассеивания, а по оси ординат показано светорассеивание клеток в зависимости от их бокового светорассеивания. Лимфоциты формируют плотное облако, что свидетельствует об однородности рассматриваемых клеток. Выделенная рамка (многоугольник) на фигуре 1 называется гейт, она показывает ту популяцию лимфоцитов крови мышей, которая изучается на предмет связывания их с лектинами. Анализируемые клетки обладают сходными оптическими характеристиками как для контрольных животных, так и для животных-опухоленосителей, что также исключает субъективный фактор в проведении исследования.

На фигуре 2 представлена гистограмма распределения нормальных лейкоцитов крови до их окраски лектином гороха (гистограмма 1) и после окраски ФИЦ-меченным лектином гороха (гистограмма 2). Следовательно, после инкубации с лектином происходит сдвиг гистограммы вправо по оси абсцисс, что свидетельствует об увеличении флуоресценции клеток вследствие связывания с ними меченой изоформы лектина. При этом процент связанных клеток составляет 91,2%. По оси ординат показано число клеток, которые имеют соответствующий уровень флуоресценции.

На фигуре 3 приведены гистограммы лимфоцитов периферической крови животных-опухоленосителей до их окраски изоформой лектина гороха и после окраски. Так же, как в случае с нормальными лимфоцитами, окраска лектином гороха вызывает сдвиг гистограммы вправо. При этом только 21,3% клеток находятся в тех же пределах окраски, тогда как в контроле таких клеток 91,2%. Таким образом процент меченых клеток уменьшился на 69,9% (91,2-21,3=69,9).

Таким образом, окраска меченой изоформой лектина гороха лимфоцитов периферической крови мышей показала, что на фоне роста опухолей наблюдается уменьшение доступности сахаров (гликозида и маннозы) для связывания с лектинами на поверхности клеток. Рассматриваемые изменения гликозилирования мембранных белков могут вызвать нарушение адгезивных свойств лимфоцитов и снижение связывания их с поверхностью опухолевых клеток, что может привести к недостаточности противоопухолевого иммунитета.

Выделенная в соответствии с изобретением изоформа лектина гороха может быть использована для диагностики онкологического заболевания (см. таблицу).

Таблица 1
Средний процент меченых клеток у животных без опухоли		Средний процент меченых клеток у животных с опухолью		Уменьшение процента меченых клеток на фоне роста опухоли
(в %)		(в %)		(в %)
89+10		31+9		58+9