панель сывороток с нормированным содержанием антител класса igg k антигенам p17 и p41 treponema pallidum и способ ее получения

Формула изобретения

1. Панель сывороток для контроля качества тест-систем для серодиагностики сифилиса, отличающаяся тем, что она содержит набор образцов с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Т.pallidum:

a) образцы с преобладанием антител к антигену р17;

b) образцы, содержащие антитела только к антигену р17;

c) образцы с преобладанием антител к антигену р41;

d) образцы, содержащие только антитела к антигену р41;

e) образцы, содержащие смесь антител к антигенам р17 и р41 в равных концентрациях.

2. Панель сывороток по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно включает позитивные образцы, изготовленные из двух или более исходных сывороток, имеющих сходные соотношения титров антител.

3. Панель сывороток по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что она дополнительно включает несколько негативных образцов, изготовленных из сывороток, не содержащих антител к Т.pallidum.

4. Способ получения панели сывороток по пп.1-3, отличающийся тем, что осуществляют отбор положительных сывороток путем определения в них соотношения (К) обратных титров антител к антигенам Т.pallidum с мол. массой 17 и 41 кДа (K=T^-1p₁₇/T^-1 _р41), при этом отбирают исходные образцы сывороток, имеющих соотношения К 2, К 1/2 и К=1 и разводят их не иммунной донорской сывороткой до получения необходимых концентраций специфических антител.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что определение концентраций (титров) антител к антигенам р17 и р41 осуществляют на ИФА тест-системах с использованием планшетов, сенсибилизированных отдельными рекомбинантными антигенами р17 или р41.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что при разведении сывороток с соотношениями титров антител К>2 и К<1/2 из каждой исходной сыворотки получают не менее 2 образцов, причем разведения производят так, чтобы в первом образце определялись антитела к тому и другому антигену, а во втором образце определялись только наиболее представленные антитела (антитела только к одному антигену) с уровнем оптического сигнала, превышающем в 1,5 раза уровень ОПкрит.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что при разведении сывороток с соотношением К=1 из каждой исходной сыворотки получают не менее 2 образцов, причем разведения производят так, чтобы антитела к тому и другому антигену в первом разведении определялись в титре не менее 1:20, а во втором - в титре не более 1:10 с уровнем оптического сигнала, превышающем в 1,5 раза уровень ОПкрит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток для контроля качества тест-систем, предназначенных для серологической диагностики сифилиса. Нормированное содержание антител к отдельным белкам возбудителя сифилиса - Treponema pallidum в образцах панели позволяет осуществлять контроль ряда показателей качества тест-систем, изготовленных с использованием рекомбинантных антигенов, на стадиях их производства и применения.

Сифилис представляет собой инфекционное венерическое заболевание, характеризующееся прогрессирующим волнообразным течением, в котором стадии клинических проявлений (первичный сифилис половых органов, вторичный сифилис кожи и слизистых и т.д.) сменяются бессимптомными периодами (скрытый сифилис). Более половины случаев заболевания сифилисом протекают в скрытой, бессимптомной форме и выявляются только при серологическом обследовании пациентов. В таких условиях большое значение приобретает эффективная лабораторная диагностика данного заболевания.

Лабораторная диагностика сифилиса основана на выявлении неспецифических (реагинов) или специфических (IgG, IgM) антител в сыворотке (плазме) пациента. Профили этих антител сложны и значительно варьируют в зависимости от стадии заболевания. В комплексе серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса, в последние годы все большее значение приобретает иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием рекомбинантных белков, содержащих специфические антигенные детерминанты Т.Pallidum. К настоящему времени разработаны системы ИФА для выявления сифилитических антител класса IgG, антител класса IgM и суммарных (IgG+IgM) антител, причем в двух последних модификациях рекомбинантные антигены используют не только на подложках, но и в качестве иммунопероксидазного конъюгата. От того, какие антигены, какого качества, в каком количестве и соотношении использованы в тест-системе, в решающей степени зависит чувствительность и специфичность диагностики [1-3].

При производстве тест-систем используются в основном антигены с мол. массой 17 и 41 кДа. Проведенные исследования показали, что для сывороток со стадии первичного сифилиса характерно значительное преобладание антител к антигену р41, а для сывороток со стадии скрытого сифилиса - к антигену р17. На стадии вторичного сифилиса соотношение титров антител к указанным антигенам разнообразно. При этом на всех стадиях сифилиса выявляются сыворотки как с высокими, так и с крайне низкими уровнями антител. Экспериментально подтверждено наличие пяти принципиально различающихся ситуаций соотношения титров антител к указанным антигенам:

1. в сыворотке определяются только антитела к антигену р41;

2. в сыворотке определяются антитела к тому и другому антигену, но уровень антител к антигену р41 значительно выше, чем уровень антител к антигену р17;

3. в сыворотке определяются одинаковые или близкие по значению титры антител к белкам р17 и р41;

4. в сыворотке определяются антитела к тому и другому антигену, но уровень антител к антигену р17 значительно выше, чем уровень антител к антигену р41;

5. в сыворотке определяются только антитела к антигену р17.

Очевидно, что тест-системы, предназначенные для диагностики сифилиса, должны выявлять все перечисленные выше ситуации. Для этого необходимо иметь планшеты, сенсибилизированные сбалансированной смесью антигенов р17 и р41, а в случае тест-систем для выявления суммарных антител необходима также сбалансированная смесь конъюгатов указанных антигенов с пероксидазой.

Качество диагностических наборов проверяется на определенном наборе (панели) сывороток. В настоящее время официально утвержденных отечественных панелей сифилитических сывороток нет. Зарубежные аналоги неизвестны. Производители и потребители тест-систем обычно пользуются своими панелями, подбор сывороток в которых в основном имеет случайный характер и в лучшем случае учитывает стадию заболевания и пол донора.

Известна панель производства «Вектор-Бест», однако и эта панель представляет «слепой» набор высокотитражных сывороток, неизвестны ни характеристики образцов панели, ни критерии их подбора [4].

Такая панель не может обеспечить достаточно полный анализ сывороток.

Наиболее близким способом изготовления панели (прототипом) является способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов [5, прототип]. Способ включает приготовление иммунных сывороток, содержащих разные концентрации специфических антител ко всем основным белкам тестируемого антигена путем разведения нативных иммунных сывороток неиммунной сывороткой доноров. Причем наибольшее количество сывороток панели приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в этих сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток панели - с концентрациями антител, близкими к их концентрации в нативных сыворотках.

В отличие от прототипа настоящее изобретение предполагает целенаправленный подбор сывороток, критериями которого служит соотношение (К) в сыворотках обратных титров антител к антигенам р17 и р41 (К=Т^-1 _р17/Т^-1 _р41).

Технической задачей изобретения является получение панели сывороток, обеспечивающей контроль параметров тест-систем в процессе их производства и эксплуатации, как средства, позволяющего сопоставлять экспериментальные данные, полученные разными исследователями на разных тест-системах и в разное время.

Поставленная задача решается получением и использованием панели сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum.

Настоящее изобретение позволяет реализовать новый подход к конструированию панелей как эффективного инструмента для контроля ряда параметров тест-систем в процессе их производства и эксплуатации. В отличие от существующих панелей настоящее изобретение предполагает включать в панель набор сывороток, воспроизводящих все описанные выше ситуации соотношения титров антител к антигенам р17 и р41. Такая панель позволяет потребителям осуществлять оценку чувствительности и специфичности тест-системы, а производителям, кроме того, обеспечивает дифференциальный контроль достаточности нагрузки планшетов антигенами и оптимальности соотношения антигенов в «суммарном» конъюгате.

Подбор сывороток осуществляется их титрованием на планшетах, сенсибилизированных отдельными антигенами (р17 или р41) в насыщающей концентрации. Подбираются исходные сыворотки:

- сыворотка №1 (с первичной или вторичной стадии сифилиса) с К<1/2;

- сыворотка №2 (со скрытой стадии сифилиса) с К>2;

- сыворотка №3 (с первичной, вторичной или скрытой стадии сифилиса) с К=1;

- несколько образцов донорских сывороток, не содержащих антител к Tr.Pallidum (негативные образцы);

- донорская сыворотка или смесь сывороток, не содержащих антител к Tr.Pallidum, для приготовления разводящего раствора.

Сыворотки №1 и 2 раститровывают на разводящем растворе и в полученных образцах определяют титры антител к отдельным антигенам таким же способом, как и на стадии подбора исходных сывороток. По каждой раститровке исходных сывороток выбирают не менее 2 образцов таким образом, чтобы в первом образце определялись антитела к тому и другому антигену, а во втором определялись только наиболее представленные антитела (антитела только к одному антигену) с оптическим сигналом, в 1,5 раза превышающем ОПкрит.

Сыворотку №3 раститровывают на разводящем растворе и в полученных образцах определяют титры антител к отдельным антигенам таким же способом, как и на стадии подбора исходных сывороток. Из раститровки отбирают не менее 2 образцов таким образом, чтобы в первом образце антитела к тому и другому антигену выявлялись в титре не менее 1/20, а во втором - в титре не более 1:10 с оптическим сигналом, в 1,5 раза превышающем ОПкрит.

Корректировку оптического сигнала образцов при необходимости производят добавлением исходной позитивной сыворотки или разводящего раствора.

Для обеспечения достоверности контроля в состав панели включают по два или более позитивных образца каждого типа, полученных из различных исходных сывороток с разных стадий заболевания.

Из каждой донорской сыворотки готовят по одному негативному образцу.

Все отобранные позитивные и негативные образцы сывороток дополнительно очищают центрифугированием или фильтрацией и стабилизируют добавлением известных консервантов или стабилизирующих смесей, разливают во флаконы и лиофилизируют.

Пример

По описанному выше способу изготовляют панель, включающую в себя 12 позитивных и 6 негативных сывороток. При оценке исходных сывороток и разведенных образцов используют растворы для отмывок, разведения сывороток и коньюгата, а также субстраты на основе ОФД и ТМБ из диагностических наборов «СИФ-ДСМ-IgG» (ЗАО «Медико-биологический союз», Бердск). Характеристики исходных сывороток и образцов панели приведены в табл.1.

Таблица 1 Характеристики исходных сывороток и образцов панели
№ панели	Исходные сыворотки				Образцы панели
	Пол	Стадия сифилиса	Титр антител		Кратность разведения	ОП492 на планшетах с антигенами
			р17	р41		р17	р41	р17+р41
1	м	скрытый	1:80	1:20	2	2,242	0,885	2,050
2					5	1,224	0,124	0,934
3	ж	скрытый	1:640	1:160	16	1,932	0,424	1,546
4					40	0,731	0,095	0,634
5	м	вторичный	1:320	1:640	30	1,483	1,996	1,802
6					45	0,215	0,968	0,845
7	ж	первичный	1:20	1:80	2	0,652	1,654	1,477
8					5	0,253	0,903	0,763
9	м	вторичный	1:640	1:640	25	1,412	1,218	1,762
10					50	0,611	0,765	0,801
11	ж	первичный	1:320	1:320	10	1,284	1,168	1,414
12					25	0,586	0,832	0,710
13	ж	Негативные донорские сыворотки	0	0	0	0,124	0,142	0,154
14	ж		0	0	0	0,123	0,132	0,152
15	м		0	0	0	0,119	0,125	0,108
16	ж		0	0	0	0,136	0,118	0,146
17	м		0	0	0	0,128	0,112	0,112
18	м		0	0	0	0,115	0,137	0,125

Панель используют для оценки планшетов, сенсибилизированных сорбционными смесями, содержащими различные соотношения антигенов р17 и р41, а также конъюгатов для определения суммарных антител, содержащими различные соотношения антигенов р17 и р41, конъюгированных с пероксидазой.

Пример 1 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с преобладанием антигена р17, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 2 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с преобладанием антигена р41, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 3 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с оптимальным соотношением антигенов р17 и р41, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 4 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с преобладанием белка р17.

Пример 5 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с преобладанием белка р41.

Пример 6 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с оптимальным соотношением белков р17 и р41.

Результаты оценки приведены в табл.2.

Таблица 2 Примеры применения панели для оценки сбалансированности сорбционной смеси для сенсибилизациии планшетов и антигенного конъюгата
№	Пример 1	Пример 2	Пример 3	Пример 4	Пример 5	Пример 6
1	2,162	1,182	2,050	0,963	0,657	1,026
2	1,145	0,228	0,934	0,421	0,220	0,439
3	1,835	0,634	1,546	0,740	0,446	0,875
4	0,712	0,236	0,634	0,419	0,216	0,334
5	1,238	1,874	1,802	0,654	0,763	0,989
6	0,267	0,768	0,845	0,233	0,432	0,554
7	0,716	1,439	1,477	0,441	0,541	0,767
8	0,271	0,812	0,763	0,230	0,430	0,581
9	1,324	1,118	1,762	0,655	0,657	0,816
10	0,587	0,645	0,801	0,438	0,434	0,534
11	1,196	1,234	1,414	0,561	0,762	0,923
12	0,674	0,712	0,710	0,432	0,429	0,577
13	0,118	0,136	0,154	0,078	0,074	0,092
14	0,121	0,128	0,152	0,084	0,078	0,105
15	0,129	0,123	0,108	0,092	0,083	0,103
16	0,114	0,125	0,146	0,089	0,076	0,133
17	0,118	0,118	0,112	0,086	0,083	0,092
18	0,135	0,129	0,125	0,095	0,102	0,106
ОПкрит	0,300	0,300	0,300	0,280	0,280	0,280

Использование описанной выше панели позволяет дать оценку:

1. работоспособности тест-системы,

2. чувствительности тест-системы,

3. специфичности тест-системы,

4. оптимальности соотношения антигенов на сенсибилизированных планшетах,

5. оптимальности соотношения антигенов в конъюгате для выявления суммарных антител,

6. стабильности тест-системы при хранении, стабильности отдельных белков на планшетах и в антигенном конъюгате при хранении.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Заявка Японии №9304391 «Immunological Treponema pallidum diagnostic reagent and its manufacture» G 01 N 33/571.

2. Патент США 6479248 "Process and agent for detecting antibodies against Treponema pallidum" G 01 N 33/53.

3. Патент РФ «Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum 15 кДа, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum 17 кДа и рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum TMP А», С 12 N 15/31.

4. Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков ФСП 42-0117-0281-00 «РекомбиБест антипаллидум"».

5. Патент РФ №2094807 «Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов», G 01 N 33/96, 33/53.