способ синтеза пептида, содержащего остаток триптофана

Формула изобретения

1. Способ получения твердофазным синтезом пептида с формулой (I)

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ ,

включающий временную защиту NH-группы индола любого остатка триптофана (Trp) и временную защиту остатка гистидина (His) тозильной группой, который включает стадии

(а) присоединения цезиевой соли Boc-Gly к хлорметилированной полистирольной смоле с получением Boc-Gly-смолы;

(б) деблокирования Boc-Gly-смолы посредством смешивания Boc-Gly-смолы с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением соли органической кислоты и H₂N-Gly-смолы;

(в) нейтрализации соли органической кислоты и H₂ N-Gly-смолы основанием с получением H₂N-Gly-смолы;

(г) соединения H₂N-Gly-смолы с аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, причем указанная аминокислота соответствует аминокислоте, определенной в формуле (I) по порядку, указанному с С-конца к N-концу, которое включает

(1) реагирование H₂N-Gly-смолы с аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, в присутствии пептидобразующего агента с получением Вос-блокированного продукта соединения;

(2) отделение Вос-группы от Вос-блокированного продукта соединения посредством смешивания Вос-блокированного продукта соединения с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением продукта соединения;

(3) реагирование продукта соединения со следующей аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, в присутствии пептидобразующего агента с получением Вос-блокированного продукта соединения;

(4) отделение Вос-группы от Вос-блокированного продукта соединения посредством смешивания Вос-блокированного продукта соединения с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением следующего продукта соединения;

(5) повторение стадий (г)(3) и (г)(4) до тех пор, пока не будет присоединена N-терминальная аминокислота пептида с формулой (I) и тозильная защитная группа боковой цепи остатка гистидина не будет удалена, а Вос-группа N-терминальной аминокислоты не будет деблокирована с получением защищенного законченного комплекса пептид-смола;

(д) расщепления и снятия защиты с защищенного законченного комплекса пептид-смола с получением пептида с формулой (I), причем указанное расщепление и снятие защиты включает:

(1) приготовление раствора защищенного законченного комплекса пептид-смола в смеси спирта и инертного полярного апротонного растворителя;

(2) охлаждение раствора до температуры примерно от 0°С до 10°С;

(3) медленное пропускание пузырьков газообразного аммиака или газообразного этиламина через раствор и продолжение охлаждения до тех пор, пока раствор не будет насыщен аммиаком, с получением насыщенного раствора;

(4) перемешивание насыщенного раствора без охлаждения в течение примерно 15-36 часов до тех пор, пока более 95% свободного метилового эфира не преобразуется в соответствующий амид, если используется газообразный аммиак, или в соответствующий этиламид, если используется газообразный этиламин; и

(е) выделение пептида из полученного раствора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что следующие аминокислоты, содержащие Вос-защищенную -аминогруппу, присоединяют последовательно от С-конца к N-концу: N- -Boc-L-пролин, N- -Boc-L-аргинин-HCl, N- -Boc-L-лейцин, N- -Вос-D-триптофан(N'-индол-формил), N- -Boc-L-тирозин, N- -Boc-L-серина гидрат, N- -Вос-триптофан(N'-индол-формил), соль N- -Вос-L-гистидин(тозил)-циклогексил-амина и пироглутаминовую кислоту.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что формильную защитную группу боковой цепи Trp удаляют посредством обработки раствором, содержащим аммиак, первичный амин или вторичный амин и спирт.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный раствор содержит аммиак и метанол.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что при присоединении N- -Вос-D-триптофан(N'-индол-формила), N- -Boc-L-тирозина, N- -Boc-L-серина гидрата и N- -Вос-триптофан(N'-индол-формила) также используется 1-гидроксибензотриазол (НОВТ).

6. Способ получения пептида формулы (I) по п.1, отличающийся тем, что временная защита любого остатка триптофана защитной группой для боковой цепи лабильна по отношению к основанию и указанную защитную группу удаляют при отделении пептида формулы (I) от твердой основы посредством реакции с основанием.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что защитной группой боковой цепи Trp или D-Trp является ацильная группа.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что защитную группу боковой цепи Trp или D-Trp удаляют посредством обработки раствором, содержащим аммиак, первичный амин или вторичный амин и спирт.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная защитная группа боковой цепи является формильной группой, а указанное основание является раствором метанола, содержащим аммиак.

10. Способ получения пептида формулы (I) по п.1, отличающийся тем, что синтез включает стадии последовательного присоединения к твердой основе следующих защищенных аминокислот: Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg-HCl, Boc-Leu, Boc-D-Trp(PG-1), Boc-Tyr, Boc-Ser, Boc-Trp(PG-1), Boc-His(PG-2) и Boc-pGlu, где PG-1 является защитной группой, лабильной по отношению к основанию, a PG-2 является защитной группой для His, и указанный способ включает отделение пептида от основы и отделение PG-1 от остатков триптофана с помощью раствора, содержащего основание.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что PG-1 группа является ацильной группой.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что раствор содержит аммиак, первичный амин или вторичный амин.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что раствор содержит аммиак, первичный амин или вторичный амин.

14. Способ по любому из пп.10-13, отличающийся тем, что PG-2 группа является тозильной группой.

15. Способ по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что PG-1 группа является формильной группой, а указанный раствор содержит аммиак.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу синтеза пептида, содержащего остаток триптофана (Trp), с использованием твердой фазы.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гонадотропин-высвобождающий гормон (LHRH) - это нейромедиатор, вырабатываемый гипоталамусом, который стабилизирует выделение лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH) из гипофиза, которые, в свою очередь, стимулируют синтез стероидных гормонов, например тестостерона, в гонадах. В настоящее время в продаже имеется много пептидов-аналогов LHRH (то есть агонистов и антагонистов), используемых для лечения эндометриоза, рака предстательной железы, преждевременного полового созревания и других расстройств, опосредуемых гормонами. Синтезы таких аналогов LHRH трудны и дорогостоящи.

Твердофазный синтез пептидов был разработан в 1963 г. с целью преодоления многих проблем с промежуточной очисткой, связанных с синтезом пептидов в растворе (Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазный синтез пептидов), Pierce Chemical Co., 2-е изд., 1984). В ходе твердофазного синтеза аминокислоты собирают (то есть соединяют) в пептид с любой желаемой последовательностью, в то время как один конец цепи (например, С-конец) прикреплен к нерастворимой основе. После того как желаемая последовательность будет присоединена к основе, пептид отделяют (то есть отщепляют) от основы.

В Патенте США №4,010,125 (1977) описан синтез [D-Trp⁶]-LHRH, при котором боковые цепи четырех из десяти остатков агониста LHRH защищены (например, L-гистидил(тозил), серил(бензил), тирозил(2,6-ди-Cl-Bzl) и L-аргинил(тозил)). Однако Coy et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 14: 359 (1979)) позже описали синтез нескольких других аналогов LHRH, при котором минимальная защита боковых цепей, например только солевая защита аргинина (то есть Arg·HCl), давала больший выход соответствующего синтеза с использованием защиты. Настоящее изобретение было сделано благодаря открытию того, что, несмотря на существующую в данной области техники тенденцию не защищать боковые цепи аминокислот при синтезе аналогов LHRH, защита остатка триптофана во время твердофазного синтеза значительно увеличивает выход аналогов LHRH, содержащих остаток триптофана (например, [D-Trp⁶ ]LHRH).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает способ получения пептида с формулой (I):

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂

где NH - группа индола любого остатка триптофана защищена,

который включает стадии:

(а) присоединения цезиевой соли Boc-Gly к хлорметилированной полистирольной смоле с получением Boc-Gly-смолы;

(б) деблокирования Boc-Gly-смолы посредством смешивания Boc-Gly-смолы с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением соли органической кислоты и Н₂ N-Gly-смолы;

(в) нейтрализации соли органической кислоты и H₂N-Gly-смолы основанием с получением H₂ N-Gly-смолы;

(г) соединения H₂N-Gly-смолы с аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, причем указанная аминокислота соответствует аминокислоте, определенной в формуле (I) по порядку, указанному от С-конца к N-концу, которое включает

(1) реагирование H₂N-Gly-смолы с аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, в присутствии пептидобразующего агента с получением Вос-блокированного продукта соединения;

(2) отделение Вос-группы от Вос-блокированного продукта соединения посредством смешивания Вос-блокированного продукта соединения с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением продукта соединения;

(3) реагирование продукта соединения со следующей аминокислотой, содержащей Вос-защищенную -аминогруппу, в присутствии пептидобразующего агента с получением Вос-блокированного продукта соединения;

(4) отделение Вос-группы от Вос-блокированного продукта соединения посредством смешивания Вос-блокированного продукта соединения с Вос-деблокирующей органической кислотой с получением следующего продукта соединения;

(5) повторение стадий (г)(3) и (г)(4) до тех пор, пока не будет присоединена N-терминальная аминокислота пептида с формулой (I), а Вос-группа N-терминальной аминокислоты не будет деблокирована с получением защищенного законченного комплекса пептид-смола;

(д) расщепления защищенного законченного комплекса пептид-смола и снятия защиты с получением пептида с формулой (I), которое включает:

(1) приготовление раствора защищенного законченного комплекса пептид-смола в смеси спирта и инертного полярного апротонного растворителя;

(2) охлаждение раствора до температуры примерно от 0 до 10°С;

(3) медленное пропускание пузырьков газообразного аммиака или газообразного этиламина через раствор и продолжение охлаждения до тех пор, пока раствор не будет хорошо насыщен аммиаком, с получением насыщенного раствора;

(4) перемешивание насыщенного раствора без охлаждения в течение примерно 15-36 часов до тех пор, пока более 95% свободного метилового эфира не преобразуется в соответствующий амид, если используется газообразный аммиак, или в соответствующий этиламид, если используется газообразный этиламин; и

(е) выделения указанного пептида из раствора.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором следующие аминокислоты, имеющие Вос-защищенную -аминогруппу, последовательно присоединяют в направлении от С-конца к N-концу: N- -Boc-L-пролин, N- -Boc-L-аргинин-HCl, N- -Boc-L-лейцин, N- -Вос-D-триптофан(N'-индол-формил), N- -Boc-L-тирозин, N- -Boc-L-серина гидрат, N- -Вос-триптофан(N'-индол-формил), соль N- -Вос-L-гистидин(тозил)-циклогексиламина и пироглутаминовую кислоту.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором формильную защитную группу боковой цепи Trp удаляют посредством обработки раствором, содержащим аммиак, первичный амин или вторичный амин и спирт.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанный раствор содержит аммиак и метанол.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором стадия выделения указанного пептида из указанного раствора включает:

(1) фильтрование указанного раствора с получением фильтрата; и

(2) концентрирование указанного фильтрата.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанный пептид с формулой (I) представляет собой pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ .

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором при присоединении N- -Вос-D-триптофан(N'-индол-формила), N- -Boc-L-тирозина, N- -Boc-L-серина гидрата и N- -Boc-триптофан(N'-индол-формила) используется также 1-гидроксибензотриазол (НОВТ).

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ твердофазного синтеза пептида с формулой

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂

причем указанный способ включает временную защиту любого остатка триптофана защитной группой для боковой цепи, которая лабильна по отношению к основанию, и указанную защитную группу удаляют во время отделения указанного пептида от твердой основы посредством реакции с основанием.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором защитной группой для боковой цепи Trp или D-Trp является ацильная группа.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором защитную группу для боковой цепи Trp или D-Trp удаляют посредством обработки раствором, содержащим аммиак, первичный амин или вторичный амин и спирт.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанная защитная группа для боковой цепи является формильной группой, а указанное основание является раствором метанола, содержащим аммиак.

В следующем аспекте настоящее изобретение направлено на способ твердофазного синтеза пептида с формулой pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂, включающий стадии последовательного присоединения к твердой основе следующих защищенных аминокислот: Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg·HCl, Boc-Leu, Boc-D-Trp(PG-1), Boc-Tyr, Boc-Ser, Boc-Trp(PG-1), Boc-His(PG-2) и Boc-pGlu, где PG-1 является защитной группой, лабильной по отношению к основанию, a PG-2 является защитной группой для His, и указанный способ включает отделение указанного пептида от указанной основы и отделение PG-1 от указанных остатков триптофана с помощью раствора, содержащего основание.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанная PG-1 группа является ацильной группой.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанный раствор содержит аммиак, первичный амин или вторичный амин.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанная PG-2 группа является тозильной группой.

Предпочтительным примером осуществления описанного выше способа является такой способ, при котором указанная PG-1 группа является формильной группой, а указанный раствор содержит аммиак.

Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут ясны из сведений, подтверждающих возможность осуществления изобретения, а также из формулы изобретения.

Аббревиатуры

ВОС = t-бутоксикарбонил

Cit = цитруллин

cPzACAIa = цис-3-(4-пиразинилкарбониламиноциклогексил)аланин

hArg(Bu) = N-гуанидино-(бутил)-гомоаргинин

hArg(Et) ₂ = N,N'-гуанидино-(диметил)-гомоаргинин

hArg(СН ₂CF₃)₂ = N,N'-гуанидино-бис-(2,2,2-трифторэтил)-гомоаргинин

НОВТ = 1-гидроксибензотриазол

Lys(iPr) = N -изопропиллизин

B-Nal = -1-нафтилаланин или -2-нафтилаланин, если не указано иное

NicLys = N -никотиноиллизин

Pal = пиридилаланин

p-Cl-Phe = 3-(4-хлорфенил)аланин

p-F-Phe = 3-(4-фторфенил)аланин

PicLys = N -пиколиноиллизин

Qal = хинолилаланин

Предполагается, что специалист в данной области техники на основании приведенного здесь описания сможет использовать настоящее изобретение в его полном объеме. Поэтому приведенные ниже примеры осуществления изобретения следует рассматривать лишь как иллюстративные, а не как ограничивающие объем изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данной работе, имеют такое же значение, какое им обычно придает специалист в данной области техники. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, указанные в данной работе, безусловно включены в нее посредством ссылки.

Пептиды с формулой (I) можно получить посредством твердофазного пептидного синтеза с использованием химических свойств Boc на смоле Меррифилда (Merrifield) с последующим отделением пептида от смолы аммиаком, первичным амином или вторичным амином в спирте с получением указанного пептида.

Первой стадией такого способа по настоящему изобретению является присоединение цезиевой соли С-конца аминокислоты, Boc-Gly к смоле Меррифилда посредством сложноэфирной связи. Цезиевую соль Boc-Gly получают путем добавления Boc-Gly к карбонату цезия в смеси метанола и воды. Цезиевую соль Boc-Gly высушивают под вакуумом, а затем проводят реакцию с хлорметилбензильными группами, присутствующими на полистироле, в безводном полярном апротонном растворителе, таком как диметилформамид (ДМФ). Эта реакция идет в течение примерно 24-48 часов, предпочтительно - в течение 36 часов, при температуре, примерно от 45 до 60°С, предпочтительно - при 50°С. Затем прореагировавшую смолу фильтруют, промывают водой, полярным апротонным растворителем, например ДМФ, и спиртом, например метанолом, а затем сушат до постоянной массы, предпочтительно - при пониженном давлении. Высушенную смолу можно проанализировать с целью определения содержания Boc-Gly, которое выражают в миллимолях Gly на грамм сухой смолы. Расчетное значение используют для определения объема реакции присоединения при последующем использовании материала и для расчетов теоретического выхода.

Синтез пептида с формулой (I) можно осуществить на Boc-Gly-смоле, находящейся в стеклянном реакторе с дисковыми фильтрами из пористого стекла на дне реактора. Содержимое реактора перемешивают с помощью механической мешалки и сушат посредством подачи инертного газа под давлением, например азота под давлением, для принудительного перемещения жидкостей через пористый диск, находящийся на дне, с удержанием смолы на дне реактора. Вначале удаляют Вос-группу Boc-Gly с Gly-смолы (то есть деблокируют смолу) посредством двукратного перемешивания Gly-смолы со смесью органической кислоты и хлорированного растворителя, предпочтительно - со смесью 25%-ной трифторуксусной кислоты (ТФУК) с дихлорметаном (ДХМ), вначале - в течение примерно 2 минут, а затем - в течение примерно 25 минут, с последующим дренажом с помощью азота под давлением. Gly-смолу три раза промывают ДХМ и два раза - спиртом, например изопропиловым спиртом (ИПС), и образующуюся в результате соль аминогруппы и ТФУК дважды нейтрализуют основанием в инертном растворителе, предпочтительно - 10% триэтиламином в ДХМ, оба раза - в течение примерно 5 минут, и снова три раза промывают ДХМ.

Затем смолу соединяют с 2,5-молярными эквивалентными смесями аминокислот, содержащих Вос-защищенную -аминогруппу, соответствующих аминокислотам, определенным по формуле (I) по направлению от С-конца к N-концу, с использованием пептидобразующего агента, предпочтительно - диизопропилкарбодиимида (ДИК), в полярных апротонных растворителях, предпочтительно - в смесях ДМФ/ДХМ, в качестве реакционной среды. За каждым присоединением следуют промывки ДМФ и ДХМ. Смолу можно проанализировать с помощью нингидрина по Кайзеру на полноту каждой реакции присоединения, кроме присоединения аргинина, которое можно проанализировать с помощью изатина для выявления вторичного амина остаточного неприсоединенного пролина. Вос-группу отделяют от каждой присоединенной аминокислоты с последующим анализом, описанным выше. Следующие защищенные аминокислоты, соответствующие аминокислотам из формулы (I), предпочтительно используют в синтезе по настоящему изобретению: N- -Boc-L-пролин, N- -Boc-L-аргинин·HCl, N- -Boc-L-лейцин, N- -Вос-D-триптофан(N'-индол-формил), N- -Boc-L-тирозин, N- -Boc-L-серина гидрат, соль N- -Вос-L-гистидин(тозил)-циклогексиламина и пироглутаминовую кислоту.

1-Гидроксибензотриазол (НОВТ) (3-5 экв.) также можно использовать при соединении защищенных производных D-Trp, Tyr, Ser и Trp. Тозильную защитную группу боковой цепи гистидина удаляют посредством двух обработок НОВТ в ДМФ в течение одного часа (при каждой обработке) после присоединения последней аминокислоты. Боковые цепи Boc-D-триптофана и Boc-L-триптофана защищены формильной группой по азоту в индольном кольце. Формильную группу затем удаляют во время отделения пептида от смолы с помощью основания.

Законченный комплекс пептид-смола промывают во взвешенной воронке с фильтром из пористого стекла инертным хлорированным растворителем, например ДХМ, дважды промывают спиртом, например метанолом, и сушат под вакуумом. Высушенный комплекс пептид-смола переносят в трехгорлую круглодонную колбу с объемом, равным 1 литру. В круглодонную колбу добавляют смесь метанола/ДМФ в соотношении 9:1 из расчета примерно 15 миллилитров на грамм комплекса пептид-смола. Раствор охлаждают примерно до температуры ниже 10°С и, если желательна амидная форма С-конца пептида, медленно пропускают пузырьки газообразного аммиака при сильном охлаждении до достаточного насыщения (время добавления равно примерно 1 часу), при этом пептид отделяется от смолы в форме промежуточного соединения, являющегося свободным метиловым эфиром. Раствор оставляют при перемешивании без охлаждения еще примерно на 15-36 часов, в течение которых примерно более 95% свободного метилового эфира преобразуется в соответствующий амидный продукт. Ход реакции можно контролировать, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC), и ее можно прекратить после получения желаемой степени завершенности. Продукт в растворе фильтруют через воронку с пористым стеклянным фильтром и смолу несколько раз промывают метанолом и ДМФ. Все промывочные жидкости и фильтраты конденсируют до очень густого масла. Добавляют этилацетат и раствор превращают в порошок с целью отверждения продукта, декантируют и еще раз повторяют порошкование с этилацетатом. Сырой продукт растворяют в метаноле и добавляют равный объем 4Н уксусной кислоты. Раствор концентрируют для полного удаления метанола. Продукт разводят 4Н уксусной кислотой.

С-терминальную этиламидную форму пептида можно получить путем замены аммиака на этиламин в процедуре, описанной в предшествующем абзаце, при этом температуру раствора во время насыщения раствора этиламином поддерживают ниже примерно 16°С, а предпочтительно - в интервале от примерно 5°С до примерно 15°С.

Неочищенный материал можно очистить посредством повторной обратнофазной препаративной хроматографии и лиофилизировать с получением конечного продукта.

Специалисту в данной области техники будет очевидно, что можно использовать другие системы растворителей, включающие, но не ограничивающиеся ими, низкомолекулярные спирты, такие как этанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол, трет-бутанол и тому подобные, другие полярные апротонные растворители и их смеси.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нижеследующий пример приведен в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению и его не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающий объем изобретения.

Пример

Синтез pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂ ([D-Trp⁶]LHRH-NH₂)

[D-Trp ⁶]LHRH-NH₂ получали посредством твердофазного пептидного синтеза с использованием химических свойств Boc на смоле Меррифилда с последующим отделением пептида от смолы раствором аммиака в метаноле с получением указанного в заголовке пептида.

Первой стадией процесса было присоединение цезиевой соли С-концевой аминокислоты, Вос-глицина к смоле Меррифилда посредством сложноэфирной связи. Цезиевую соль Вос-глицина получали посредством реакции Вос-глицина (40,9 г) с карбонатом цезия (37,9 г) в смеси метанола и воды (80 мл/40 мл). Цезиевую соль Вос-глицина сушили под вакуумом, а затем проводили реакцию с хлорметилбензильными группами, присутствующими на полистироловых шариках (смола Меррифилда; Advanced Chemtech, 88,2 г), в безводном диметилформамиде (ДМФ; 200 мл). Эту реакцию проводили в течение примерно 36 часов при температуре, примерно равной 50°С, на роторном испарителе Buchi , модель 110. Прореагировавшую смолу затем отфильтровывали, промывали водой, ДМФ и метанолом, а затем сушили до постоянной массы при температуре ниже 35°С под вакуумом. Высушенную смолу затем анализировали с целью определения содержания Вос-глицина, которое выражали в миллимолях глицина на грамм сухой смолы. Было получено расчетное значение, равное 0,872 ммоль/грамм, и оно было использовано для определения точного объема реакции присоединения при последующем использовании материала и для расчетов теоретического выхода.

Синтез пептида производили на смоле, соединенной с Вос-глицином (12,5 г), находившейся в стеклянном реакторе объемом 500 мл с дисковыми фильтрами из пористого стекла на дне и на верхней части реактора. Реактор заполняли снизу и встряхивали посредством переворачивания (повороты на 180 градусов в течение 3 секунд). Вначале удаляли Вос-группу (то есть деблокировали) с глицинсодержащей смолы посредством двукратного смешивания смолы со 175 мл 35% трифторуксусной кислоты (ТФУК) в дихлорметане (ДХМ) (в течение 2 минут и 25 минут) с последующим дренажом, которому способствовала подача азота под давлением. Смолу три раза промывали 125 мл ДХМ и два раза - 125 мл изопропилового спирта (ИПС), а затем три раза - 125 мл ДХМ. Образовавшуюся в результате соль аминогруппы и ТФУК дважды нейтрализовали 125 мл 10%-ного триэтиламинового основания в ДХМ, каждый раз - в течение 5 минут, и снова три раза промывали ДХМ.

Затем смолу деблокировали и соединяли с 2,5-молярной эквивалентной смесью следующих Вос-защищенных аминокислот с 4,2 мл диизопропилкарбодиимида (ДИК) в 16 мл ДМФ и 47 мл ДХМ: 5,84 г Boc-L-пролина, 8,93 г Вос-L-аргинина-HCl; 6,77 г Boc-L-лейцина, 9,0 г Вос-D-триптофан(формила), 7,64 г Boc-L-тирозина, 9,0 г Вос-L-триптофан(формила), 6,06 г Boc-L-серина гидрата, 16 г соли Вос-L-гистидин(тозила) и циклогексиламина и 13,5 г пироглутаминовой кислоты. Также использовали 1-гидроксибензотриазол (НОВТ) (3-5 экв.) при присоединении D-Trp, Туг, Ser и Trp. 75 мл диметилацетамида (ДМА) использовали вместо ДМФ и ДХМ при присоединении Arg. Смолу промывали ДМФ и ДХМ и анализировали с помощью нингидрина по Кайзеру на полноту присоединения. Вос-группу отделяли от каждой присоединенной аминокислоты, как описано выше. Боковая цепь гистидина была защищена тозильной группой, которую удаляли посредством двух обработок 4,16 г НОВТ в 105 мл ДМФ в течение одного часа (при каждой обработке) после присоединения последней аминокислоты. Боковые цепи Boc-D-триптофана и Boc-L-триптофана были защищены формильной группой, которую удаляли во время отделения пептида от смолы.

Законченный комплекс пептид-смола смывали с помощью ДХМ во взвешенную воронку с фильтром из пористого стекла, дважды промывали метанолом и сушили под вакуумом. Высушенный комплекс пептид-смола переносили в трехгорлую круглодонную колбу с объемом, равным одному литру. В колбу добавляли 15 мл смеси метанола/ДМФ в соотношении 9:1 на грамм смолы с пептидом (380 мл для 10,9 мМ). Раствор охлаждали до температуры ниже примерно 10°С и медленно пропускали через него пузырьки газообразного аммиака при сильном охлаждении до значительного насыщения (время пропускания примерно равно 1 часу). Раствор оставляли при перемешивании без охлаждения еще примерно на 15-36 часов, пока более 95% свободного метилового эфира не преобразовывалось в амидный продукт, что определяли посредством мониторинга с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Продукт в растворе фильтровали через воронку с пористым стеклянным фильтром, а смолу несколько раз промывали метанолом и ДМФ. Все промывочные жидкости и фильтраты конденсировали до очень густого масла на роторном испарителе при температуре ниже 40°С. Добавляли этилацетат (0,08 литра), и раствор порошковали для отверждения продукта, декантировали и повторно обрабатывали 0,08 литра этилацетата. Твердый смолистый продукт в течение ночи выдерживали в этилацетате и декантировали. Неочищенный продукт растворяли в метаноле (0,07 литра) и добавляли эквивалентный объем 4Н уксусной кислоты. Раствор концентрировали для полного удаления метанола в роторном испарителе при температуре ниже 40°С. Продукт разбавляли до примерно 35 граммов продукта на литр 4Н уксусной кислотой.

Затем неочищенный материал очищали посредством многократной обратнофазной хроматографии и лиофилизировали с получением конечного продукта (8,4 г, выход 59%) в виде белого твердого вещества при чистоте более 99%.

Другие примеры осуществления

Из приведенного выше описания специалист в данной области техники может легко узнать основные особенности настоящего изобретения и, не отклоняясь от сущности и объема, произвести различные изменения и модификации изобретения для адаптации его к различным прикладным задачам и условиям. Поэтому другие примеры осуществления также входят в формулу изобретения.