способ хроматографического разделения паклитаксела и цефаломаннина

Формула изобретения

1. Способ отделения паклитаксела от цефаломаннина, предусматривающий

получение исходного материала, содержащего паклитаксел и цефаломаннин;

растворение исходного материала в растворителе, имеющем следующую формулу:

где R₁ означает водород или метил и R₂ означает алкильную или арилалкильную группу, содержащую от четырех до семи атомов углерода, с образованием смеси;

подвергание этой смеси колонной хроматографии в силикагелевой колонке с получением элюированной фракции паклитаксела, элюированной фракции цефаломаннина и остатка, и

раздельную сушку фракций паклитаксела и цефаломаннина с получением отдельных кристаллических форм паклитаксела и цефаломаннина, соответственно.

2. Способ по п.1, в котором указанный исходный материал содержит любое соотношение цефаломаннина и паклитаксела.

3. Способ по п.1, в котором указанный исходный материал представляет собой экстракт свежих или сухих корней, листьев, ветвей, семян Taxus или их смеси.

4. Способ по п.1, в котором указанный исходный материал представляет собой экстракт, получаемый из клеточной культуры Taxus.

5. Способ по п.1, в котором указанный исходный материал имеет вид твердого материал, сиропа или полутвердой смолы.

6. Способ по п.1, в котором в молекулярной структуре указанного растворителя R₁ является водородом или метилом, а R₂ является н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или т-бутилом.

7. Способ по п.1, в котором в формуле указанного растворителя R₁ является водородом или метилом, и R₂ является н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или т-бутилом.

8. Способ по п.1, в котором силикагель используют в количестве около 50-100 вес. ч. от веса исходного материала.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к отделению паклитаксела от его аналога цефаломаннина, происходящих из экстрактов растений рода Taxus или их клеточных культур. В частности, паклитаксел отделяют от цефаломаннина хроматографией на прямофазных силикагелевых колонках.

Паклитаксел, ранее называвшийся «Таксол», представляет собой весьма перспективное противораковое средство. Паклитаксел был выделен Вани (Wani) из коры Taxus brevifolia в 1971 г. (Wani et al. J. Am. Chem. Soc., 93, 2325, 1971), и его структура была определена химическими методами и рентгеноструктурным анализом.

Паклитаксел одобрен Администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным средствам (аналог Госкомэпиднадзора) для лечения рака молочной железы и яичников, а в настоящее время проводятся клинические испытания по применению его для лечения рака легких и толстой кишки (см., например, W.P.McGuire and E.K.Rowinsky, Paclitaxel in VCancer Treatment, M.Dekker, New York, 1995, pages 1-337).

Основным природным источником паклитаксела является кора дерева тихоокеанского тиса Taxus brevifoilia. Было также обнаружено, что паклитаксел присутствует в надповерхностных частях и корнях других видов тиса, включая тис европейский (Taxus baccata), азиатские виды тиса (Taxus wallichiana и Taxus chinensis) и деревья тиса, культивируемые в декоративных целях (например, Taxus media).

Метод выделения паклитаксела из любого природного источника сложен и дорог, отчасти из-за его относительно низкой концентрации в растительных материалах, но также из-за присутствия родственного соединения - цефаломаннина. Содержание и соотношение паклитаксела и цефаломаннина варьирует в растительных материалах в зависимости от вида и части данного растения. В целом, однако, было показано, что содержание паклитаксела и цефаломаннина варьирует в пределах 0,001%-0,08% и 0,001%-0,22% соответственно (К.М.Witherup et al., J. Nat. Prod., 53, 1249, 1990; R.G.Kelsey et al., J. Nat. Prod., 55, 912, 1992; N.C.Wheeler et al., J. Nat. Prod., 55, 432, 1992). В частности, виды Taxus media, которые относятся к возобновляемому растительному материалу и которые представляют собой наиболее часто используемое растительное сырье, содержат в среднем наивысшую концентрацию цефаломаннина по сравнению с другими видами.

Даже методики получения паклитаксела из клеточных культур тиса, несмотря на бурное развитие в последнее время исследований, направленных на разработку простых способов экстракции дорогого растительного материала, приводят к продукту, содержащему соответствующее количество цефаломаннина в дополнение к паклитакселу.

Единственное различие молекулярных структур паклитаксела и цефаломаннина состоит в боковой цепи, так что химические свойства этих соединений очень похожи. Оба соединения поэтому обладают очень сходными хроматографическими свойствами, и хорошей чистоты разделения этих родственных соединений достичь трудно. Было предложено множество хроматографических методов, основанных, главным образом, на использовании хроматографии с обратной фазой или дорогих колонок со связанной фазой (J.H.Cardellina, J. Liq. Chromatogr., 14, 659, 1991; S.L.Richheimer et al., Anal. Chem. 64, 2323, 1992; E.R.M.Wickremesinhe et al.,* J. Liq. Chromatogr., 16, 3263, 1993; K.M.Witherup et al., J. Liq. Chromatogr., 12, 2117, 1989), но их трудно приспособить к крупномасшабному коммерческому процессу. В связи с вышесказанным, доступность методов, позволяющих осуществлять разделение паклитаксела и цефаломаннина, остается задачей большой практической важности.

Ранее предлагались методы разделения паклитаксела и цефаломаннина, основанные на различной реакционной способности двух соединений по отношению к окислителям. Было показано, что двойная олефиновая связь, присутствующая в тиглиновом остатке цефаломаннина, может быть окислена в реакции с тетроксидом осмия (D.G.I.Kingston et al., J. Nat. Prod., 55, 259, 1992) или с озоном (J.T.Beckvermit et al., J. Org. Chem., 61, 9038, 1996), тогда как паклитаксел не подвергается никаким химическим превращениям в окислительных реакциях. Другой подход основан на обработке смесей паклитаксела и цефаломаннина бромом (J.M.Rimoldi et al., J. Nat. Prod., 59, 167, 1996). Обработка бромом в контролируемых температурных и временных условиях вызывает образование дибромцефаломаннина, тогда как на паклитаксел никак не действует обработка указанным химическим реагентом. Указанные методы имеют тот недостаток, что включают использование таких токсичных реагентов, как тетроксид осмия, и в любом случае могут привести к деструкции цефаломаннина или к трансформации его в производные, от которых цефаломаннин может быть отделен только с помощью очень сложных способов синтеза. В связи с вышесказанным, имеется потребность в недорогом, простом, безопасном и эффективном способе отделения цефаломаннина от паклитаксела. Соответственно, главной задачей настоящего изобретения является разработка простого способа разделения паклитаксела и цефаломаннина из их смесей или из экстрактов тиса.

Настоящее изобретение относится к способу отделения паклитаксела от цефаломаннина и других родственных соединений. В частности, настоящий способ предусматривает стадии получения исходного материала, содержащего паклитаксел и цефаломаннин, растворение исходного материала в любом из множества определенных ниже растворителей с образованием смеси, хроматографирование смеси на колонке с получением элюированной фракции паклитаксела, элюированной фракции цефаломаннина и остатка, а затем раздельную сушку фракций паклитаксела и цефаломаннина с получением отдельных кристаллических форм паклитаксела и цефаломаннина, соответственно. Растворитель представляет собой предпочтительно бутилформиат или бутил- или бензилацетат.

Неожиданно было обнаружено, что высокочистые чистый паклитаксел и цефаломаннин могут быть получены с высоким выходом при хроматографическом разделении на одной прямофазной силикагелевой колонке с использованием одного растворителя в качестве элюента. Предпочтительно данный растворитель имеет следующую общую формулу:

где R₁ означает водород или метил, a R₂ содержит до семи и предпочтительно четыре атома углерода, то есть является н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или т-бутилом. Указанные растворители не относятся к числу часто используемых в обычных методах хроматографической очистки на колонке, однако дают удивительно хорошие практические результаты в конкретном случае разделения паклитаксела и цефаломаннина.

Исходный материал согласно настоящему изобретению может представлять собой смесь паклитаксела и цефаломаннина в любом соотношении или экстракт свежих или сухих корней, листьев, ветвей, семян Taxus или их смесь. В способе по изобретению может использоваться также экстракт, полученный из клеточной культуры. Указанные исходные материалы в общем известны специалистам в данной области, так что далее они не описываются.

Рассматриваемый экстракт может представлять собой сырой или очищенный экстракт, при этом последний обрабатывается обычными растворителями и подвергается предварительной хроматографической очистке. Указанные методики также хорошо известны специалистам в данной области, так что нет необходимости далее их описывать. Исходный материал может иметь вид твердого материала, сиропа или полутвердой смолы, в зависимости от экспериментальных условий, использованных при его получении. Указанный материал может просто подвергаться колонной хроматографии после его растворения в одном из растворителей, указанных в описании.

Хроматографическая очистка согласно настоящему изобретению включает использование простого, прямофазного силигакагеля в количестве около примерно 50-100 вес. частей от веса исходного материала, в зависимости его состава.

Колонная хроматография, проводимая растворителями по изобретению, представляет быстрый метод, не требующий высокого давления, и проводится в условиях нормальной силы тяжести (без центифугирования).

В таблице представлено поведение цефаломаннина и паклитаксела при анализе методом тонкослойной хроматографии с использованием силикагелевых пластинок и ряда растворителей по изобретению, позволяющих осуществить удовлетворительное разделение двух соединений.

Таблица Значения Rf паклитаксела и цефаломаннина на силикагелевых
Растворитель	R1	R2	Паклитаксел	Цефаломаннин
н-бутилформиат	Н	н-С 4Н9	0,17	0,12
и-бутилформиат	Н	и-С4 Н9	0,20	0,15
т-бутилформиат	Н	т-С4Н 9	0,20	0,13
н-бутилформиат	СН 3	н-С4Н 9	0,36	0,28
втор-бутилформиат	СН3	втор-С 4Н9	0,35	0,24
и-бутилацетат	СН3	и-С4Н9	0,31	0,19
т-бутилацетат	СН3	т-С4Н9	0,19	0,09
бензилацетат	СН3	PhCH2	0,28	0,16

Использование растворителей, описанных в данной заявке, для разделения паклитаксела и цефаломаннина хроматографией на прямофазной силикагелевой колонке дает множество преимуществ.

Во-первых, колонная хроматография обеспечивает действительно не содержащий от цефаломаннина паклитаксел и, наоборот, практически не содержащий паклитаксела цефаломаннин. Во-вторых, использование прямофазного силикагеля обеспечивает значительные экономические преимущества по сравнению с разделением на обратнофазных силикагелях, описанных в литературе, и, в-третьих, применение одного растворителя для элюирования колонки позволяет осуществлять быстрое повторение цикла без перерывов для фракционной перегонки в операциях, связанных с промышленным непрерывным производственным процессом. Любые другие составляющие, присутствующие в исходном материале, вместе с паклитакселом и цефаломаннином удаляются при хроматографической очистке.

Элюированные фракции выпаривают в вакууме до их высыхания, а остаток кристаллизуют из соответствующего растворителя с получением паклитаксела и цефаломаннина в желательной кристаллической форме.

Таким образом, описанный в настоящем изобретении способ обеспечивает простое получение раствора для получения больших количеств не содержащего цефаломаннина паклитаксела при увеличении выхода и ускорении и удешевлении процесса производства указанного противоопухолевого средства.

Примеры

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Выделение паклитаксела из экстракта Taxus media, содержащего цефаломаннин.

200 г экстракта, полученного из 620 кг Taxus media (все растения) способом, описанным Сенилхом с соавт. (V.Senilh et al., J. nat. Prod., 47, 131, 1984), содержат, согласно ВЭЖХ анализу, 183 г паклитаксела и 81 г цефаломаннина. Экстракт растворяют в 3,5 л т-бутилацетата и вводят в колонку, содержащую 60 кг силикагеля. Для элюирования используют всего 1200 л бутилацетата. Получают фракцию в 400 л, содержащую паклитаксел и менее 3% цефаломаннина, и другую, 200 л фракцию, содержащую цефаломаннин и менее 3% паклитаксела, после чего проводят еще одно элюирование с 350 л растворителя. Обе фракции по отдельности концентрируют под вакуумом до высуши вания, а остатки кристаллизуют с использованием смеси гексан-ацетон. Таким образом получают 154 г паклитаксела и 70 г цефаломаннина с 99% чистотой (по ВЭЖХ), физико-химические и спектроскопические свойства которых соответствуют данным, имеющимся в литературе (G.N.Ghmurny et al., J. Nat. prod., 55, 414, 1992; C.J.Falzone et al., Tetrahedron Letters, 33, 1169, 1992; V.Senilh et al., J. Nat. Prod., 47, 131, 1984).

Пример 2. Выделение паклитаксела и цефаломаннина из смеси, содержащей оба соединения.

Смесь, содержащую 70 г паклитаксела и 30 г цефаломаннина, растворяют в 1,5 л т-бутилформиата и вводят в колонку, содержащую 10 кг силикагеля, суспендированного в том же растворителе. Колонку элюируют т-бутилформиатом, и соответствующие фракции объединяют после проведения анализа ВЭЖХ/ТСХ (высокоэффективная жидкостная/тонкослойная хроматография). Фракции, содержащие паклитаксел и цефаломаннин, по отдельности высушивают концентрированием, а остатки кристаллизуют с использованием ацетона и гептана в подходящем соотношении с получением 60,9 г паклитаксела и 25,5 г цефаломаннина, имеющих 99% чистоту по ВЭЖХ.