способ оценки стабильного состояния мембран эритроцитов

Формула изобретения

Способ оценки стабильного состояния мембран эритроцитов, включающий выделение эритроцитов из крови, добавление хлористого лантана до конечных концентраций 60-160 мкМ, отличающийся тем, что после агрегации эритроциты инкубируют при 37°С в течение 60 мин и по появлению слившихся клеток судят о нарушении стабильного состояния мембран эритроцитов, при этом слияние клеток регистрируют визуально с помощью светового микроскопа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований.

Известны способы оценки стабильного состояния мембран эритроцитов, включающие определение осмотической хрупкости, кислотной устойчивости (Стусь Л.К. и др. Гематология и трансфузиология - 1988. Т.33. №4. С.41-48).

Известен способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов, взятый за прототип (Шереметьев Ю.А., Суслов Ф.Ю., патент РФ №2082968, 1997), включающий выделение эритроцитов из крови, определение степени их агрегации, вызванной добавлением к эритроцитам 5 дискретных концентраций хлористого лантана (20, 40, 80, 160 и 320 мкМ). По степени агрегации эритроцитов в сравнении с контрольными судят о состоянии мембран. Однако способ трудоемок и требует специального оборудования (для регистрации агрегации эритроцитов).

Задача создания нового, несложного, высокочувствительного, не требующего специального оборудования способа определения стабильного состояния мембран эритроцитов является актуальной.

Задача достигается способом, который заключается в том что эритроциты выделяют из крови и добавляют к ним хлористый лантан до конечной концентрации 60-160 мкМ, после агрегации эритроциты инкубируют при 37°С в течение 60 мин. О состоянии мембран эритроцитов судят по появлению слившихся клеток с помощью светового микроскопа. Способ позволяет упростить определение состояния мембран эритроцитов, по сравнению с прототипом.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспензируют в соотношении 1:200 в забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис-HCl, 146 мМ NaCl, pH 7,4). Суспензию клеток помещают в пробирку и добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 60-160 мкМ. После добавления лантана суспензию клеток интенсивно перемешивают и после агрегации эритроциты инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Слияние клеток регистрируют с помощью светового микроскопа.

В концентрации лантана, равной 60-160 мкМ, наблюдается массовое слияние эритроцитов, мембраны которых находятся не в стабильном состоянии. Интактные эритроциты не сливаются под влиянием лантана (нет объединения содержимого клеток). При концентрациях лантана ниже 60 и выше 160 мкМ частота слияния снижена.

Пример 1. Оценка стабильного состояния мембран интактных эритроцитов (80 мкМ La³⁺). На фиг.1 видно отсутствие слияния клеток (объединения содержимого клеток), наблюдается лишь агрегация эритроцитов.

Пример 2. Оценка стабильного состояния мембран эритроцитов, имеющих пониженный уровень АТФ (80 мкМ La³⁺). Снижение уровня АТФ в эритроцитах получали инкубацией клеток в забуференном физиологическом растворе в течение 20 ч. Уровень внутриклеточного АТФ контролировали ферментативным методом, и он составлял 30% от уровня нормальных клеток. На фиг.2 видно массовое слияние эритроцитов.

Пример 3. Оценка стабильного состояния мембран эритроцитов консервированной крови, хранящейся при 4°С (80 мкМ La³⁺). На фиг.3а видно, что уже через 1 сут хранения крови начинается слияние эритроцитов. Через 4 сут хранения крови происходит массовое слияние клеток (3б).

Проведенные исследования показывают возможность применения способа оценки стабильного состояния мембран эритроцитов. Способ оценки стабильного состояния мембран эритроцитов прост в использовании и не требует специального оборудования.