водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью, на основе соединения серебра с цистином и способ его получения
Классы МПК: | A61K31/197 амино- и карбоксильная группы присоединены к одной и той же ациклической углеродной цепи, например гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), бета-аланин, эпсилон-аминокапроновая кислота, пантотеновая кислота |
Автор(ы): | Третьяков Василий Васильевич (RU), Сильников Владимир Николаевич (RU), Власов Валентин Викторович (RU), Рихтер Владимир Александрович (RU), Третьякова Ольга Владимировна (RU), Курбатов Анатолий Васильевич (RU), Обухов Александр Васильевич (RU), Жевачевский Николай Герасимович (RU), Донченко Александр Семенович (RU), Тихонов Валерий Лаврентьевич (RU), Тихонова Наталья Владимировна (RU), Шкиль Николай Алексеевич (RU), Глотов Александр Гаврилович (RU), Глотова Татьяна Ивановна (RU), Храмцов Виктор Викторович (RU) |
Патентообладатель(и): | Закрытое акционерное общество "БиоАргоФарм" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-11-25 публикация патента:
20.06.2006 |
Изобретение относится к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится к новому водорастворимому противовирусному средству на основе соединения серебра с цистином, отвечающее составу C6H19N4O6 S2LiAg2, а также к способу его получения. Синтез заявленного средства осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак в мольном соотношении 1:2:2:8. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 часов, после чего упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С. К полученной суспензии прибавляют эквивалентное количество этилового спирта, охлаждают до +4÷+6°С и выдерживают 12 часов. Образовавшийся целевой продукт в виде желтого мелкодисперсного осадка отфильтровывают, промывают этиловым спиртом, и сушат в вакууме при комнатной температуре. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.
Формула изобретения
1. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью, на основе соединения серебра с цистином и отвечающее составу C6H19N4O6S2 LiAg2.
2. Способ получения водорастворимого средства, обладающего противовирусной активностью по п.1, заключающийся в том, что синтез осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак в мольном соотношении 1:2:2:8, при этом в воде вначале растворяют цистин, который переводят в литиевую соль добавлением гидроокиси лития, к полученному раствору добавляют предварительно полученный аммиачный комплекс нитрата серебра, полученный смешением рассчитанных количеств раствора нитрата серебра и 25%-ного водного раствора аммиака, реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 ч, упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С, при котором происходит интенсивное выпадение целевого соединения в виде мелкодисперсного осадка желтого цвета, полученную суспензию перемешивают с эквивалентным объемом этилового спирта, который добавляют четырьмя равными порциями, суспензию охлаждают до 4-6°С и выдерживают 12 ч, образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к водорастворимым противовирусным лекарственным средствам, к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится также к области получения этих средств. Изобретение может быть использовано для создания готовых лекарственных форм для лечения вирусных, бактериальных и других инфекций.
Цель - создание высокоэффективных противовирусных лекарственных препаратов, в особенности для лечения вирусных гепатитов, антибиотикоустойчивых инфекций, включая ВИЧ инфекцию.
Сущность изобретения. Предложено новое противовирусное средство на основе соединения серебра и природной аминокислоты L-цистина, отвечающее составу C6 H19N4O6S2LiAg 2 (табл. 1).
Известны препарат под названием Аргохром фирмы Мерк (производившийся в Германии примерно с 1916 по 1945 годы и поступавший по импорту в бывший СССР в довоенный период), состав которого подпадает под действовавший с 1914 года Патент Австрии N69476 и называвшийся до 1920 г. по-немецки Silber methylen blau, а также препарат Гегонон, выпускавшийся по патенту Германии N268968, изданному 7 января 1914, класс 12р, группа 16 - прототип. (См. справочник Вотчал Б.Е. и др. "Фармацевтические препараты", М.-Л.: ОНТИ, 1934 г.)
Указанные препараты содержат серебро в ионной форме, прочно связанное с органическими молекулами - лигандами. Недостатком указанных препаратов является малая биодоступность содержащегося в них серебра, так как в случае Аргохрома лигандом является синтетический краситель - метиленовая синь, а в случае Гегонона - это высокомолекулярный носитель - альбумоза.
Задачей изобретения явилось повышение эффективности проникновения ионов серебра через биологические мембраны, начиная от проникновения в кровяное русло в случае перорального или ректального способов введения препарата, а также эффективная доставка ионов серебра к больным клеткам и проникновение через клеточную мембрану с целью прекращения жизнедеятельности инфекционных агентов.
Задача решается тем, что получен водорастворимый фотостойкий в растворах препарат серебра, представляющий собой прочный металлокомплекс серебра с природной аминокислотой L-цистином, при этом одна молекула цистина прочно связывает два иона серебра.
Предложен также способ получения нового водорастворимого противовирусного лекарственного средства (субстанции), заключающийся в том, что синтез осуществляют при комнатной температуре и мольном соотношении следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак 1:2:2:8, при этом в воде вначале растворяют цистин, который переводят в литиевую соль добавлением гидроокиси лития, к полученному раствору добавляют предварительно полученный аммиачный комплекс нитрата серебра [Ag(NH3)2]NO3, полученный смешением рассчитанных количеств раствора нитрата серебра и 25% водного раствора аммиака, реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 ч, упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С, при котором происходит интенсивное выпадение целевого соединения в виде мелкодисперсного осадка желтого цвета, полученную суспензию перемешивают с эквивалентным объемом этилового спирта, который добавляют четырьмя равными порциями, суспензию охлаждают до +4÷+6°С и выдерживают 12 ч, образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.
Предлагаемая структурная формула, отвечающая составу C6H19N4O6 S2LiAg2.
Пример осуществления способа.
В круглодонную колбу вместимостью 1 л загружают 24,00 г цистина, 8,40 г моногидрата гидроокиси лития и 100 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения исходных компонентов.
В стеклянный стакан вместимостью 300 мл загружают 33,97 г азотнокислого серебра и 50 мл дистиллированной воды. После растворения соли, при энергичном перемешивании, приливают 54,4 мл 25% водного раствора аммиака.
К гомогенному раствору дилитиевой соли цистина при комнатной температуре, при перемешивании на магнитной мешалке приливают раствор аммиачного комплекса серебра. Реакционная смесь постепенно приобретает желтую окраску, которая усиливается в течение 1-2 часов. Через 6 часов реакционную смесь упаривают на ротационном испарителе при температуре 40-50°С до объема 50 мл. При этом происходит интенсивное выпадение мелкодисперсного осадка желтого цвета. Суспензию переносят в стеклянный стакан емкостью 500 мл и при интенсивном перемешивании механической мешалкой добавляют 200 мл этилового спирта порциями по 50 мл в течение 30 минут. Суспензию перемешивают 30 минут и помещают в холодильник (+4÷+6°С) на 12 часов. Образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, осадок тщательно промывают 300 мл этилового спирта и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.
Данные элементного анализа, представленные в таблице 1 получены с использованием автоматического анализатора элементного состава. Содержание металлов определялось атомно-адсорбционным методом.
Таблица 1 | ||||
Данные элементного анализа. | ||||
Найдено (%) | ||||
С | H | N | Li | Ag |
13.36 | 3.42 | 10.57 | 1.18 | 40.16 |
13.74 | 3.50 | 10.70 | 1.25 | 40.68 |
13.33 | 3.54 | 10.71 | 1.32 | 40.46 |
Вычислено (%) для C6H19 N4O6S 2LiAg2 | ||||
С | Н | N | Li | Ag |
13.60 | 3.61 | 10.57 | 1.31 | 40.70 |
Результаты лабораторных исследований на биологическую активность. В результате проведенных экспериментов в лабораторных условиях была изучена цитотоксичность и противовирусная активность заявляемого комплекса серебра с цистином с условным названием Аргобиоцин-2S.
Определение цитотоксичности препаратов проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по использованию культур клеток МДВК и КСТ для оценки цитотоксического действия лекарственных средств" (С.Г. Колесникова и соавт., 2002).
Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (И.П. Ашмарин и соавт., 1974).
Определение цитотоксичности препаратов для культуры клеток.
Для определения цитотоксичности препаратов для культуры клеток испытуемые препараты вносили в двухсуточный монослой культуры клеток КСТ, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах в следующих дозах: 10 мг/мл; 1 мг/мл; 100 мгк/мл; 10 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0,1 мкг/мл; 0,01 мкг/мл; 0,001 мкг/мл. На одно разведение каждого препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препарата на клетки учитывали по степени изменения монослоя и контролировали в течение 3 суток. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 | |
Цитотоксическое действие препарата в культуре клеток КСТ | |
Доза препарата | Цитотоксическое действие (ЦТД) |
"Аргобиоцин 2S" | |
10 мг/мл | + |
1 мг/мл | - |
100 мкг/мл | - |
10 мкг/мл | - |
1 мкг/мл | - |
0,1 мкг/мл | - |
0,01 мкг/мл | - |
0,001 мкг/мл | - |
Токсическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 10 мг/мл. В результате исследований установили, что цитотоксическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" для культуры клеток КСТ составила 10 мг/мл. Нетоксичная для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 1 мг/мл.
Для определения минимальной цитотоксической дозы испытуемый препарат вносили в двухсуточный монослой культуры клеток КСТ, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах в следующих дозах: 10; 5; 2,5; 1,25 мг/мл. На одно разведение каждого препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препаратов на клетки учитывали по степени изменения монослоя и контролировали в течение 3 суток. Исследования проводили в трех повторностях. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 | |||
Определение минимальной цитотоксической и максимальной нетоксичной дозы препарата "Аргобиоцин 2S" | |||
Доза препарата "Аргобиоцин 2S", мг/мл | Цитотоксическое действие (ЦТД) | ||
1 исследование | 2 исследование | 3 исследование | |
10 | + | + | + |
5 | + | + | - |
2,5 | - | - | - |
1,25 | - | - | - |
Минимальная цитотоксическая для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила: 6,67±1,36 мг/мл, а максимальная нетоксичная - 3,33±0,68 мг/мл.
Таким образом, максимальная цитотоксическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" для культуры клеток КСТ составила 10 мг/мл, а минимальная - 6,67±1,36 мг/мл. Максимальная нетоксичная для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 3,33±0,68 мг/мл.
Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса ВД-БС КРС осуществлялось следующим образом. Монослой используемой культуры клеток заражали вирусом ВД-БС КРС в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл, через 1,5 часа после этого их отмывали питательной средой без сыворотки и вносили препараты в максимальных нетоксичных для культуры клеток КСТ дозах (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Через 72 часа культивирования вируса в таких биосистемах культуральную жидкость титровали. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по разнице инфекционных активностей вирусов в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы, под ред. Б. Мейхи, М.: Мир, 1988). Противовирусный эффект препаратов выражали в lg ТЦД50/0,1 мл снижения титров вируса (Н.Д. Львов и соавт., Вопросы вирусологии, 1986, №2). Препарат считали эффективным при снижении инфекционного тира вируса не менее чем на 2 lg ТЦД50/0,1 мл (в 100 раз) по сравнению с контрольными (не обработанными препаратами культурами клеток). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препаратов.
Титрование вирусов осуществлялось следующим образом. Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы, под ред. Б. Мейхи, М.: Мир, 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД 50/0,1 мл (50%-я тканевая цитопатическая доза).
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 | |||
Накопление вируса ВД-БС КРС в культуральной жидкости в присутствии препарата. | |||
Название препарата | Использованная доза препарата | Концентрация вируса ВД-БС (M±m), lg ТЦД50/0,1 мл | |
Опыт | Контроль | ||
"Аргобиоцин 2S" | 1 мг/мл | 4,07±0,07 | 6,08±0,07 |
В результате проведенных исследований установлено, что препарат "Аргобиоцин 2S" оказывает противовирусное действие, снижая инфекционную активность вируса ВД-БС КРС на 2,01 lg ТЦД50/0,1 мл по сравнению с контролем.
В результате проведенной работы найдена нетоксичная доза препарата для культуры клеток КСТ (коронарные сосуды теленка), на которых культивировался вирус (вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС)) in vitro. Данная доза проявила выраженные противовирусные свойства, снизив инфекционную активность вируса в сто раз. Таким образом, применение данного препарата в качестве основы противовирусных лекарственных средств позволит получить новые эффективные лекарственные средства с иным механизмом действия по сравнению с ныне применяемыми лекарственными препаратами, не содержащими ионов металлов в своей структуре.
Класс A61K31/197 амино- и карбоксильная группы присоединены к одной и той же ациклической углеродной цепи, например гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), бета-аланин, эпсилон-аминокапроновая кислота, пантотеновая кислота